抗體的研制及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用11208120 楊文清

1、抗體的研制及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用11208120 楊文清 抗體藥物是以細(xì)胞工程技術(shù)和基因工程技術(shù)為主體的抗體工程技術(shù)制備的藥物， 具有特異性高、性質(zhì)均一、可針對(duì)特定靶點(diǎn)定向制備等優(yōu)點(diǎn)，在各種疾病治療，特別是腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景備受關(guān)注。當(dāng)前，抗體藥物的研究與開(kāi)發(fā)已成為生物技術(shù)藥物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，居近年來(lái)所有醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品之首。 一、背景歷史：1890年Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素,建立了血清療法,開(kāi)創(chuàng)了抗體制藥。1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、球蛋白，并證明抗體活性主要存在于球蛋白組分。20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞癌變形成的惡性增殖性疾病。

2、病人血清中出現(xiàn)同抗體結(jié)構(gòu)類似的球蛋白， 統(tǒng)稱為免疫球蛋白。1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體。單克隆抗體的研究一直是生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容。白20世紀(jì)90年代中期以來(lái)，單克隆抗體和多克隆抗體的基礎(chǔ)研究論文產(chǎn)出有所下降，而人源化抗體的研究則不斷得到重視(參見(jiàn)圖1)。這說(shuō)明，單克隆抗體相關(guān)生物醫(yī)學(xué)理論的基礎(chǔ)研究已經(jīng)相對(duì)成熟，單克隆抗體應(yīng)用研究則不斷發(fā)展。在這一研究發(fā)展歷程中，人源化抗體和重組多克隆抗體技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了抗體藥物研究的深入(參見(jiàn)圖2)。其中，人源化抗體是在鼠源單抗應(yīng)糖體展示技術(shù)、酵母展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)等的發(fā)展，使人源性基因工程抗

3、體的獲得不再是難題這又激發(fā)了單抗藥物的研究熱情。1994年美國(guó)批準(zhǔn)第二個(gè)抗體藥物上市。之后，抗體藥物不斷上市。2006年 利用能夠產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠XenoMouse技術(shù) 首個(gè)完全人源化單克隆抗體藥物Panitumumab上市， 標(biāo)志著人源化抗體技術(shù)的發(fā)展達(dá)到了新的水平。 近年來(lái)， 隨著Symphoge公司的Symplex 和Sympress 等技術(shù)的發(fā)展以及由此而生產(chǎn)、用于治療原發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)和新生兒溶血癥(HDN)的多克隆抗體藥物Sym001(antiRhD)進(jìn)入II期臨床試驗(yàn) 重組多克隆抗體藥物研究也呈現(xiàn)出良好的發(fā)展態(tài)勢(shì)。二、技術(shù)知識(shí)：抗體制藥工程主要基于抗原抗體反

4、應(yīng)?？乖c抗體能夠特異性結(jié)合是基于抗原決定簇（表位）和抗體超變區(qū)分子間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性與親和性。這種特性是由抗原、抗體分子空間構(gòu)型所決定的。除兩者分子構(gòu)型高度互補(bǔ)外，抗原表位和抗體超變區(qū)必須密切接觸，才有足夠的結(jié)合力?？乖贵w反應(yīng)可分為兩個(gè)階段：第一階段為抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，此階段反應(yīng)快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)；第二階段為可見(jiàn)反應(yīng)階段，這一階段抗原抗體復(fù)合物在適當(dāng)溫度、pH、電解質(zhì)和補(bǔ)體影響下，出現(xiàn)沉淀、凝集、細(xì)胞溶解、補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)，此階段反應(yīng)慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。在血清學(xué)反應(yīng)中，以上兩階段往往不能嚴(yán)格分開(kāi)，往往受反應(yīng)條件（如溫度、pH、電解質(zhì)、抗原抗

5、體比例等）的影響。1.單克隆抗體技術(shù)：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)是1975年英國(guó)科學(xué)家Milstein和Kohler所發(fā)明，并獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1984 德國(guó)人G. J. F. Kohler、阿根廷人C. Milstein和丹麥科學(xué)家N. K. Jerne由于發(fā)展了單克隆抗體技術(shù)，完善了極微量蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)而分享了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 單克隆抗體原理：要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長(zhǎng)。而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長(zhǎng)繁殖，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。這種雜種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)

6、胞的特性，它既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來(lái)源于單個(gè)融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群，可制備一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。1975年，Kohler和 Milstein運(yùn)用這種技術(shù)，獲得了抗綿羊紅細(xì)胞的單克隆抗體，而經(jīng)30多年的發(fā)展，抗體技術(shù)經(jīng)歷了鼠源性單克隆抗體、嵌合體單克隆抗體、人源化和全人源化4個(gè)階段（如下圖）。 2.重組多克隆抗體技術(shù)：微生物入侵后機(jī)體的反應(yīng)是B淋巴細(xì)胞激活抗原反應(yīng)和克隆性擴(kuò)張。一旦進(jìn)入漿細(xì)胞（產(chǎn)生抗體的細(xì)胞），細(xì)胞的每一克隆將分泌其特異抗體，因此入侵的病原體將遇到能在其表面許多不同位點(diǎn)結(jié)合的一連串抗體分子。這種多

7、克隆反應(yīng)，其特異性及親和力范圍隨時(shí)間而改變，對(duì)抗感染是理想的。第3代抗體治療藥，重組多克隆抗體，瞄準(zhǔn)第1，2代抗體治療藥的缺點(diǎn)，模擬天然免疫方式，能與任一抗原的數(shù)種不同表型結(jié)合。因而重組多克隆抗體接近多靶點(diǎn)表型，相信能觸發(fā)更多效應(yīng)器功能，包括調(diào)理作用（加強(qiáng)抗原的內(nèi)吞），位阻（抗原外包抗體防止與 宿主細(xì)胞或粘膜表面接觸），中和毒性，凝集或沉淀 （抗體與數(shù)種可溶性抗原結(jié)合引起凝集和然后的消除），激活補(bǔ)體和抗體依賴性細(xì)胞毒性（使自然殺傷細(xì)胞和中性粒細(xì)胞殺死靶細(xì)胞）。mAb喪失抗高突變靶標(biāo)的作用，包括發(fā)生隨機(jī)突變的病毒，因而逃避免疫系統(tǒng)。而病原體逃避一個(gè)多克隆反應(yīng)的可能性較小，故重組多克隆抗體可為感染

8、疾病提供較好的治療。另外，重組多克隆抗體技術(shù)在病毒毒株變異時(shí)仍能較好地保持治療活性。重組多克隆抗體還有超過(guò)經(jīng)典血漿提取免疫球蛋白的許多優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)免疫球蛋白中有靶特異治療作用的抗體只占全部注射抗體的一小部分，浪費(fèi)了大量的球蛋白，增加了組織交叉反應(yīng)和副作用。重組多克隆抗體較純、較特異，可以克服以上缺點(diǎn)。理論上，各種抗原靶標(biāo)均可產(chǎn)生重組多克隆抗體，沒(méi)有血清提取產(chǎn)品那樣的限制。最后，新一代抗體不攜帶病毒，無(wú)轉(zhuǎn)染危險(xiǎn)，故改善了安全性。3.基因工程抗體：基因工程抗體是以基因工程技術(shù)等高新生物技術(shù)為平臺(tái)，制備的生物藥物總稱。借助DNA重組和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，在基因水平對(duì)免疫球蛋白分子進(jìn)行切割、拼接、修飾和重新

9、組裝的一種新型抗體。所制備的抗體去除或減少了可引起副作用的無(wú)關(guān)結(jié)構(gòu)，但保留天然抗體的特異性和主要生物學(xué)活性，并可賦予抗體分子以新的生物學(xué)活性。三、前沿技術(shù)：1抗體的高通量、大規(guī)模制備技術(shù)：常用的技術(shù)包括雜交瘤快速篩選技術(shù)、抗體庫(kù)技術(shù)和記憶B 細(xì)胞分選技術(shù)等。近年來(lái)又有新的發(fā)展。Uhlen 和Ponten建立了高通量的單一性多克隆抗體制備技術(shù)。Bernasconi 等改進(jìn)了人記憶B細(xì)胞分選技術(shù)，用CpG 寡核苷酸增加了B 細(xì)胞永生化率，從而使單抗制備更加快捷有效。美國(guó)Epitomic 公司發(fā)展了兔雜交瘤技術(shù)，克服了鼠雜交瘤的缺點(diǎn)，可獲得更多的低豐度及磷酸化蛋白質(zhì)抗體。另外B 細(xì)胞表達(dá)Bcl-2

10、轉(zhuǎn)基因鼠結(jié)合多位點(diǎn)重復(fù)免疫（RIMMS）的方法，可增強(qiáng)保守抗原單抗的產(chǎn)生。2.抗體功能化制備新技術(shù)：抗體功能化制備技術(shù)是針對(duì)抗體藥物應(yīng)用研究的新概念，通過(guò)抗體庫(kù)篩選及功能化重組技術(shù)，進(jìn)一步提高抗體藥物效果。主要包括重鏈抗體庫(kù)和多功能重組技術(shù)。重鏈抗體是來(lái)源于駱駝科動(dòng)物體內(nèi)的輕鏈天然缺失抗體，其重鏈可變區(qū)（VHH）能夠單獨(dú)形成完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)，具有相對(duì)分子質(zhì)量小、易表達(dá)、特異性高、親和力高、溶解性高、多樣性好、能識(shí)別獨(dú)特構(gòu)象抗原表位等優(yōu)點(diǎn)，能有效地拮抗酶功能、中和毒素，是功能性抗體發(fā)展的新類型。自1984 年第一個(gè)基因工程人-鼠嵌合抗體誕生以來(lái)，新型基因工程抗體層出不窮，包括單價(jià)小分子抗體（F

11、ab、單鏈抗體ScFV、單域抗體、超變區(qū)多肽等）、多價(jià)小分子抗體（雙鏈抗體、三鏈抗體、微型抗體）、特殊類型抗體（雙特異抗體、抗原化抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體、催化抗體、免疫脂質(zhì)體）、抗體融合蛋白（免疫毒素、免疫黏連素）以及前景看好的重鏈抗體?；谥劓溈贵w、人源抗體產(chǎn)品的基因序列，設(shè)計(jì)多功能重組片段，是目前多功能抗體研發(fā)的主要方向。目前已有出雙特異性抗體、免疫脂質(zhì)體、抗體融合蛋白等優(yōu)點(diǎn)突出的不同類型產(chǎn)品。上海中信國(guó)健藥業(yè)有限公司研制的重組人ll 型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白“益賽普”已于2005 年被批準(zhǔn)上市；浙江大學(xué)研制的抗腫瘤血管生成藥物血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）-Fc 融合蛋白正在申請(qǐng)進(jìn)

12、行臨床研究，已被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局受理。3.抗原表位確定技術(shù)：表位是抗原分子中幾個(gè)氨基酸殘基組成的特殊結(jié)構(gòu)，可以被其相應(yīng)抗體特異識(shí)別并結(jié)合，由57 個(gè)氨基酸組成，最多不超過(guò)20 個(gè)氨基酸殘基。表位的構(gòu)成方式有兩種：由某些氨基酸殘基按一定順序連續(xù)排列組成的線狀序列，稱為線性表位。線性表位是蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，比較穩(wěn)定。由分子內(nèi)不連續(xù)的氨基酸殘基折疊排列所形成的三維結(jié)構(gòu)單元， 稱為構(gòu)象表位。構(gòu)象表位是蛋白質(zhì)的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，不太穩(wěn)定。表位鑒定主要采取競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)、分段表達(dá)、肽庫(kù)、質(zhì)譜技術(shù)及結(jié)構(gòu)解析等方法。競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)主要是檢測(cè)多個(gè)不同抗體的不同抗原表位，但并不能精確定位。分段表達(dá)主要是用原核或真核的

13、表達(dá)方式，分段表達(dá)抗原的結(jié)構(gòu)域。分段表達(dá)可以確定線性表位。合成肽庫(kù)技術(shù)是在分段表達(dá)的基礎(chǔ)上，結(jié)合表位預(yù)測(cè)，合成肽段來(lái)確定抗原表位，適用于線性表位的精確鑒定。質(zhì)譜技術(shù)是限制性酶解抗原表位肽，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜（如基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，MALDI-TOF-MS）檢測(cè)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后鑒定表位。質(zhì)譜既可以鑒定線性表位，也可以鑒定構(gòu)象表位。結(jié)構(gòu)解析確定表位的方法主要包括核磁共振和X 線晶體衍射技術(shù)。目前用核磁共振方法研究蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)還局限于中、小蛋白質(zhì)，已經(jīng)確定了幾百種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)；而采用X 線晶體衍射技術(shù)研究抗原抗體相互作用系統(tǒng)中抗原氨基酸的參與識(shí)別情況以及表位類型，則可擴(kuò)展到大蛋白分子。第

14、四軍醫(yī)大學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京大學(xué)北京核磁共振中心、中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所等合作已進(jìn)行了HAb18G/CD147 等抗體針對(duì)抗原表位的研究。4. 抗體工程藥物標(biāo)聯(lián)及增效技術(shù)：將抗體與放射性同位素、化療藥物或毒素進(jìn)行標(biāo)聯(lián)，既可以利用抗體的特異性靶向功能使藥物分子集中作用于腫瘤細(xì)胞，提高藥物療效，又可以降低抗體或化療藥物用量，減少藥物對(duì)機(jī)體的毒副作用；抗體與放射性同位素的標(biāo)聯(lián)物還可通過(guò)單光子發(fā)射型計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)用于體內(nèi)定位診斷。較常用的同位素標(biāo)記物有可發(fā)射高能射線的131I 和90Y等，這類同位素具有較強(qiáng)殺傷力；也有可發(fā)射低能 射線和俄歇電子的111In等，這類同位素具有較好的單細(xì)胞電離效應(yīng)

15、，兼具診斷和治療兩種用途；還有僅作診斷用途的99Tcm。標(biāo)記逐漸趨于采用溫和、長(zhǎng)效的方法，穩(wěn)定性可達(dá)72 h以上。我國(guó)在該項(xiàng)技術(shù)方面已取得了很大進(jìn)展，如第四軍醫(yī)大學(xué)開(kāi)發(fā)的131I 長(zhǎng)效標(biāo)記抗體技術(shù)和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院開(kāi)發(fā)的小分子工程抗體化學(xué)藥物標(biāo)記技術(shù)均已成熟，并應(yīng)用于臨床。抗體與化療藥物分子標(biāo)聯(lián)一般采用化學(xué)法，常用藥物為阿霉素、卡奇霉素類等。這些標(biāo)聯(lián)物對(duì)結(jié)腸癌、肝癌和胃癌等多種腫瘤均有一定的抗癌效應(yīng)?？贵w與生物毒素的融合表達(dá)產(chǎn)物稱為免疫毒素，生物毒素多用細(xì)菌毒素，如綠膿桿菌外毒素PE38、白喉毒素、蓖麻毒素等，多采用重組融合方式表達(dá)。免疫毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷效應(yīng)，是很具潛力的免疫靶向治療

16、藥物。在美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市的35種抗體藥物中，有5種為同位素標(biāo)記藥物，1 種為化學(xué)標(biāo)記藥物；而臨床試驗(yàn)藥物中，有10種為同位素標(biāo)記藥物，4種為化學(xué)標(biāo)記藥物，2種為融合表達(dá)的免疫毒素。四、產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀：抗體藥物是近年來(lái)復(fù)合增長(zhǎng)率最快的一類生物技術(shù)藥物，占現(xiàn)有生物技術(shù)藥物研發(fā)總數(shù)的30%35%。截至2006年，美國(guó)FDA 已批準(zhǔn)35 個(gè)抗體藥物，其中治療腫瘤抗體藥物占32%，免疫性疾病37%，器官移植11%，感染性疾病8%，心血管疾病4%，其他8%；按照抗體類型分析，鼠源20%（其中約70%用于腫瘤的治療），人源化60%，全人抗體20%。在腫瘤治療方面，應(yīng)用利妥昔單抗治療B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤已達(dá)3

17、0 多萬(wàn)例病人，單藥治療總有效率為50%，其療效與化學(xué)藥物相同，但更安全，幾乎無(wú)副作用，抗體聯(lián)合化療有效率高達(dá)80%以上。另外，針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的抗體藥物Bevacizumab（Avastin）與化療藥物聯(lián)合使用，使晚期結(jié)腸癌患者的生存期平均延長(zhǎng)了5 個(gè)月，F(xiàn)DA認(rèn)為它幾乎對(duì)所有的晚期結(jié)腸癌患者都有幫助，因此批準(zhǔn)它作為晚期結(jié)腸癌的一線用藥。該類藥物一經(jīng)開(kāi)發(fā)就倍受關(guān)注，并創(chuàng)造了巨大的效益。全球抗體藥物年銷售額從1997年的3.10億美元已上升到2005年的150億美元；在生物制藥中所占份額也從2000年的1/5上升到2005年的1/3。我國(guó)的抗體藥物發(fā)展速度也比較快，已有11種抗

18、體藥物被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市；一些具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗體藥物正在進(jìn)行或者完成臨床研究，等待批準(zhǔn)上市。但原始創(chuàng)新的抗體藥物較少。這主要是由于我國(guó)抗體藥物源頭創(chuàng)新不夠，抗體儲(chǔ)備不足，中下游關(guān)鍵技術(shù)比較薄弱，產(chǎn)業(yè)化程度與發(fā)達(dá)國(guó)家相比有較大差距。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)實(shí)力的不斷壯大，國(guó)家重大科技計(jì)劃中加強(qiáng)了對(duì)抗體藥物項(xiàng)目立項(xiàng)的力度，如國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）中的“疫苗與抗體工程”重大專項(xiàng)和“生物制藥關(guān)鍵技術(shù)”重點(diǎn)項(xiàng)目，以及國(guó)家新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)等，建立了國(guó)家資助與企業(yè)匹配、社會(huì)支持相結(jié)合的經(jīng)費(fèi)投入機(jī)制。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，當(dāng)前抗體藥物年銷售額已超過(guò)7000萬(wàn)元，中國(guó)的抗體藥物產(chǎn)業(yè)正在崛起。五、深度思考：抗體工程藥物是以基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程技術(shù)研發(fā)的生物技術(shù)產(chǎn)品，也是全球生物技術(shù)領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)化最為成功的產(chǎn)品。抗體藥物技術(shù)集成了20世紀(jì)50 年代以來(lái)生命科學(xué)發(fā)展最前沿的成果和生物工程最關(guān)鍵的技術(shù)，是生物制藥實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的重要標(biāo)志。我國(guó)抗體藥物經(jīng)過(guò)20年的努力，已逐漸走向產(chǎn)業(yè)化，堅(jiān)信中國(guó)的抗體藥物走向世界已為期不遠(yuǎn)。我國(guó)在抗