Western Blot 原理和操作方法(詳細)

1、Western Blot 原理和操作方法(詳細工作原理蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一,電泳是指帶電粒子在電場作用下,向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象.根據(jù)所采用的支持物不同,有瓊脂糖凝膠電泳,淀粉凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳等.其中,聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE由于無電滲作用,樣品用量少(1-100g,分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品,凝膠機械強度大,重復(fù)性好以及可以通過調(diào)節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點而受到廣泛的應(yīng)用. SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量.PAGE能有效的分

2、離蛋白質(zhì),主要依據(jù)其分子量和電荷的差異,而SDS-PAGE(SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異,因為SDS-PAGE的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中假如含有SDS和巰基乙醇(2-ME或二巰基赤蘚醇(DTT,其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵,破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu),SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑,它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)分子的二級及三級結(jié)構(gòu),并與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合,破壞其折疊結(jié)構(gòu),電泳樣品假如樣品緩沖液后,要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在強還原劑巰基乙醇存在時,蛋白質(zhì)分

3、子內(nèi)的二硫鍵被打開而不被氧化,蛋白質(zhì)也完全變性和解聚,并形成榛狀結(jié)構(gòu),穩(wěn)定的存在于均一的溶液中,SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上帶有大量的負電荷,平均每兩個氨基酸殘基結(jié)合一個SDS分子,這時各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋,遠遠超過其原來所帶的電荷,從而使蛋白質(zhì)原來所帶的電荷可以忽略不計,消除了不同分子之間原有的電荷差別,其電泳遷移率主要取決于亞基分子質(zhì)量的大小,這樣分離出的譜帶也為蛋白質(zhì)的亞基.樣品處理液中通常加入溴酚藍染料, 溴酚藍指示劑是一個較小的分子,可以自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當指示劑到達凝膠底部時,即可停止電泳.另外樣品處理液中也可加入適量

4、的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部.重要參數(shù)聚丙烯酰胺凝膠(PAG制備原則:由于孔徑的大小取決于單體和雙體丙烯酰胺在凝膠中的總濃度(T以及雙體占總濃度的百分含量即交聯(lián)度(C決定的,因而制膠之前必須首先知道這兩個參數(shù).一般可以由下述公式計算:T%=(a+b/m*100%; 和 C%=a/(a+b*100%其中: a=雙體(bis的重量 ;b=單體(arc的重量 ;m=溶液的體積(ml當分析一個未知樣品時,常常先用7.5%的標準凝膠制成4-10的梯度凝膠進行試驗,以便選擇理想的膠濃度.如果蛋白質(zhì)的分子量已知,可參考下表選擇所需凝膠濃度:蛋白質(zhì)分子量范圍(Da 適宜的

5、凝膠濃度(%<104 20-301×104-4×104 15-204×104-1×105 10-151×105-5×105 5-10>5×105 2-5分離膠:電泳凝膠濃度試劑 10% 12% 15% 10% 12% 15%H2O(ml 4.0 3.3 2.3 5.9 4.9 3.430%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml 3.3 4.0 5.0 5.0 6.0 7.51.5mol/lTris.cl(PH8.8 (ml2.5 2.5 2.53.8 3.8 3.810%SDS(ml 0.1 0.1 0.1 0

6、.15 0.15 0.1510%AP(ml 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15TEMED(l 4 4 4 6 6 6總體積(ml 10 15濃縮膠試劑濃度(5%H2O(ml 4 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml 1 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8 (ml 1 0.510%SDS(l 80 4010%AP(l 60 30TEMED(l 8 4總體積(ml 6 3蛋白質(zhì)的樣品制備:蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的第一步,樣品制備是關(guān)鍵步驟,要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì),應(yīng)注意以下問題:1:在合適的鹽濃度下,應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解

7、性和可重復(fù)性。2:選擇合適的表面活性劑和還原劑,破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價鍵二硫鍵,使其形成一個各自多肽的溶液。3:盡量去除核酸,多糖,脂類等干擾分子。4:防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾,制備過程應(yīng)在低溫下進行,以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾(建議加入合適的蛋白酶抑制劑5:樣品建議分裝成合適的量,然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80中保存,但要注意不要反復(fù)凍融。一:準備工作:一個水浴箱,一臺超聲裝置,組織勻漿器二:需要的溶液:裂解液 Laemmli樣品緩沖液三:操作步驟:1培養(yǎng)細胞蛋白質(zhì)樣品的制備:1:胰酶酶解后裂解:細胞培養(yǎng)至80%左右密度時,以含0.05%胰蛋白酶

8、消化,細胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次,離心收集在離心管中,加入450l裂解液反復(fù)吹打。2:皿上直接裂解:細胞培養(yǎng)至80%左右密度時,細胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次,加入450l裂解液,細胞刮刀收集,用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中,反復(fù)吹打。以上所得的樣品最終用超聲細胞破碎儀超聲處理,超聲時為5S,間歇時間為10S,功率為100-120W至溶液清澈無粘稠為止,處理過程在水浴中進行,后425000g離心1小時取上清或以最大強度超聲4次,每次15-30S,在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S,加入Laemmli 樣品緩沖液(視蛋白樣品濃度,以1:1或1:2的比例混合,強力混勻,樣品置100水浴箱里水浴加熱3-5

9、分鐘,10000g離心10分鐘,取出清液,將其移入另一潔凈試管中,至此,電泳樣品已準備就緒。(樣品可立即使用也可以分裝凍存,-20存放的樣品可穩(wěn)定保持數(shù)月2組織樣品的制備:手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中,漂洗數(shù)次,以清潔表面的血跡,將組織稱量后切成幾個較小的組織塊放入機戒組織勻漿器中,按組織凈重,裂解液=1:10的比例,加入相應(yīng)體積的裂解液進行勻漿,離心收集上清(如有粘稠物可超聲處理,具體方法見細胞培養(yǎng)的樣品制備,也可以冷凍干燥降解核酸后,將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當?shù)纳蠘觔uffer中,混勻后靜置3小時使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解,有5分鐘即可,4度離心收集。加入Laemml

10、i樣品緩沖液(視蛋白樣品濃度,以1:1或1:2的比例混合強力混勻,樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘,10000g離心10分鐘,取上清液,將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中,至此,電泳樣品已準備就緒(樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存,-20存放的樣品可穩(wěn)定保持數(shù)月。蛋白質(zhì)的樣品制備:蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的第一步,樣品制備是關(guān)鍵步驟,要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì),應(yīng)注意以下問題:1:在合適的鹽濃度下,應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。2:選擇合適的表面活性劑和還原劑,破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價鍵二硫鍵,使其形成一個各自多肽的溶液。3:盡量去除核酸,多糖,脂

11、類等干擾分子。4:防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾,制備過程應(yīng)在低溫下進行,以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾(建議加入合適的蛋白酶抑制劑5:樣品建議分裝成合適的量,然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80中保存,但要注意不要反復(fù)凍融。一:準備工作:一個水浴箱,一臺超聲裝置,組織勻漿器二:需要的溶液:裂解液 Laemmli樣品緩沖液三:操作步驟:1培養(yǎng)細胞蛋白質(zhì)樣品的制備:1:胰酶酶解后裂解:細胞培養(yǎng)至80%左右密度時,以含0.05%胰蛋白酶消化,細胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次,離心收集在離心管中,加入450l裂解液反復(fù)吹打。2:皿上直接裂解:細胞培養(yǎng)至80%左右密度時,細胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗

12、3次,加入450l裂解液,細胞刮刀收集,用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中,反復(fù)吹打。以上所得的樣品最終用超聲細胞破碎儀超聲處理,超聲時為5S,間歇時間為10S,功率為100-120W至溶液清澈無粘稠為止,處理過程在水浴中進行,后425000g離心1小時取上清或以最大強度超聲4次,每次15-30S,在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S,加入Laemmli 樣品緩沖液(視蛋白樣品濃度,以1:1或1:2的比例混合,強力混勻,樣品置100水浴箱里水浴加熱3-5分鐘,10000g離心10分鐘,取出清液,將其移入另一潔凈試管中,至此,電泳樣品已準備就緒。(樣品可立即使用也可以分裝凍存,-20存放的樣品可穩(wěn)定保持

13、數(shù)月2組織樣品的制備:手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中,漂洗數(shù)次,以清潔表面的血跡,將組織稱量后切成幾個較小的組織塊放入機戒組織勻漿器中,按組織凈重,裂解液=1:10的比例,加入相應(yīng)體積的裂解液進行勻漿,離心收集上清(如有粘稠物可超聲處理,具體方法見細胞培養(yǎng)的樣品制備,也可以冷凍干燥降解核酸后,將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當?shù)纳蠘觔uffer中,混勻后靜置3小時使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解,有5分鐘即可,4度離心收集。加入Laemmli樣品緩沖液(視蛋白樣品濃度,以1:1或1:2的比例混合強力混勻,樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘,10000g離心10分鐘,取上清液,將其轉(zhuǎn)

14、入另一潔凈的試管中,至此,電泳樣品已準備就緒(樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存,-20存放的樣品可穩(wěn)定保持數(shù)月。附:一:裂解液的制備:組織裂解液(全細胞蛋提取:1:Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.42: Nacl 150 mmoL/L3: 去氧膽酸鈉 0.25%4:NP-40或Triton-x-100 1%5: EDTA 1 mmoL/L6: PMSF 1 mmoL/L7: Aprotinin 1g/ml8: leupeptin 1g/ml9: pepstain 1g/ml其中:7,8,9作用不持久,要使用前加入。細胞裂解液:1:NP-40裂解體系:150 mmoL/L Nac

15、l1.0%NP-40或Triton-x-10050 mmoL/L Tris(PH8.02:RIPA裂解體系:150 mmoL/L Nacl1.0%NP-40或Triton-x-1000.5%脫氧膽酸鈉0.1%SDS50 mmoL/L Tris( ph8.0二:Laemmli 樣品緩沖液配置(1*SDS樣品緩沖液50 mmoL/L Tris-HCL (PH8.0100 mmoL/L DTT2% SDS0.1% 溴酚藍10% 甘油此液可以配置成不同的儲存液,根據(jù)蛋白濃度而定,40C長期保存,用時臨時與蛋白液按比例混合,其中DTT應(yīng)臨時加入,以防降解。蛋白質(zhì)定量1Bradford法:檢測原理: Br

16、adford與蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu),特殊氨基酸結(jié)合,由棕色變成藍色,595nm檢測.該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的,但不使用于小分子堿性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污劑的濃度超過0.2%影響測定結(jié)果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.Bradford法濃染液的配制:將100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml濃磷酸;然后,用蒸餾水補充至200ml;此染液放4至少6個月保持穩(wěn)定.標準曲線蛋白質(zhì)樣本的制備:盡量使用與待測樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標準品,例如測定抗體,可用純化的抗體作為標準,如果待測樣品是未知的,也可用抗體作為標準蛋白,通常在20

17、g -150g/100l之間繪制標準曲線.將待測樣本溶于100l緩沖溶液中,該緩沖溶液相同(最好用PBS按照1:5用水稀釋濃燃料結(jié)合溶液,如果出現(xiàn)沉淀,過濾除去.每個樣品家5ml稀釋的燃料結(jié)合溶液,作用5-30分鐘,燃料與蛋白結(jié)合,將由紅色變?yōu)樘m色,在595nm波長下測定其吸光度,注意顯色反應(yīng)不超過30分鐘.根據(jù)標準曲線計算待測樣品的濃度.2Lowry法:檢測原理: 是Cu2+與蛋白作用生成的Cu+與雙縮脲試劑形成蘭色絡(luò)合物,菲林試劑增強蘭色形成,750nm檢測.首先,將20g碳酸鈉溶于500ml水中;再將1g CuSO4.5H2O和2g酒石酸鈉溶于500ml蒸餾水中;將銅/酒石酸鈉溶液放在磁

18、力攪拌器上攪拌緩緩加碳酸鈉溶液,儲存于冰箱中,可穩(wěn)定保存1年以上.Folin-ciocalteu酚試劑按體積比1:2:1將銅/酒石酸/碳酸鈉,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室溫下儲藏,可穩(wěn)定保存2周,標明為試劑A按體積比1:5將Folin-ciocalteu酚試劑和H2O混合,室溫下儲存于琥珀色試劑瓶中,可穩(wěn)定保存1個月,表明為時機B用蒸餾水將樣本(5-100g稀釋為1ml,并準備100,50,25,12.5g /ml,4個濃度的BSA作為標準蛋白.每個蛋白樣品家1.0ml試劑A,混合均勻,在室溫下孵育10分鐘.加入0.5 ml試劑B并立即混合, 在室溫下孵育30分鐘.在7

19、50nm光波長下測定吸光度;根據(jù)標準曲線計算樣本蛋白質(zhì)的濃度.3紫外分光光度法:檢測原理:是因蛋白質(zhì)樣品在280nm波長下有最大吸光率,最大吸光率主要取決于酪氨酸和色氨酸的存在.純化蛋白質(zhì)濃度的測定:在280nm波長下讀取與適當對照相比較的吸光值.對于抗體和BSA,可按照下述標準計算其濃度,對其他蛋白質(zhì)粗略地估計:1單位吸光值相當于1mg/ml蛋白質(zhì) A280(1mg/mlIgG 1.35IgM 1.2BSA 0.7含有核苷酸的蛋白質(zhì)溶液濃度的測定:蛋白質(zhì)濃度(mg/ml=(1.55*A280-(0.76*A260蛋白質(zhì)濃度(mg/ml=A205(27+120A280/A2051SDS-PAG

20、E設(shè)備和材料電泳裝置(垂直板電泳槽為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYCZ-24D型電泳裝置。電泳儀(電源為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-8B型。振蕩器2試劑丙烯酰胺(電泳級N,N-甲叉雙丙烯酰胺(bisSDSTEMEDTris過硫酸銨-巰基乙醇或DTT甘油甘氨酸溴酚藍(11鹽酸3聚膠前準備:配制凝膠儲液: T%=30% C%=1% arc:bis=29:1 過濾后4避光保存。配制濃縮膠緩沖液: 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 過濾后4避光保存。配制分離膠緩沖液: 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 過濾后4避光保存。配制10%SDS配制10%過硫酸銨(APTEMED原溶液電泳

21、緩沖液(5×:Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,臨用時稀釋5倍至1×SDS 電泳緩沖液加入電泳槽中。4制膠: 制膠關(guān)鍵是聚合時間,最好是分離膠聚合控制在分離膠從加入10%AP和TEMED起至開始出現(xiàn)凝膠的時間為15-20分鐘(并不是此時已凝聚完全。對濃縮膠最佳聚合速度為8-10min開始可見聚合,可以通過調(diào)節(jié)AP和TEMED的加入量來控制,因液體中含有分子氧可抑制凝膠的聚合,故用時可在真空中抽氣以排除液體中的分子氧,灌完分離膠后加水以封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合,總之,要掌握一個原則:即用盡量少的催化劑在最佳時間聚合。按比例配制分離膠,輕緩地搖動溶液

22、(8-10下,使激活劑混合均勻,將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中,再在液面上小心注入一層水或正丁醇,以阻止氧氣進入凝膠溶液中,然后靜置90min。同前按比例配制濃縮膠,但搖動溶液時不要過于劇烈以免引入過多地氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分,以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡,靜制90min以上以保證完全聚合。5預(yù)電泳:將聚合好的凝膠安置于電泳槽中,小心拔去梳子,加入上下槽電泳緩沖液后低電壓短時間的預(yù)電泳(恒壓10-20V,20-30min,清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì),疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通。6加樣:預(yù)電泳后依次加入標準品和待分析樣品,注意加樣時

23、間要盡量短,以免樣品擴散,為避免邊緣效應(yīng),可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。7電泳:加樣完畢,蓋好電泳槽的蓋子并選擇適當?shù)碾妷哼M行電泳,通常在連續(xù)系統(tǒng)中,上層濃縮膠的電泳電壓要低于分離膠的電泳電壓,使樣品更好的進入凝膠,電泳時,應(yīng)采用恒壓的模式,這樣蛋白質(zhì)才可以保證恒定的電泳遷移率。一般采用恒壓濃縮膠80V,分離膠120V,電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處,即停止電泳。8染色和脫色考馬斯亮藍染色:將凝膠取出放入培養(yǎng)皿中到如少量的染色液,以浸沒凝膠為宜,在搖床上震蕩,直到凝膠上出現(xiàn)明顯的條帶為止,一般5-6小時或者4過夜;然后傾去染色液,用脫色液洗滌震蕩,其間要不斷換脫色液,直至脫色液顏色

24、稍清亮.,凝膠背景清楚為止.染色液配制:90ml甲醇和H20混合溶液(甲醇:水=1:1,V/V和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考馬斯亮藍R250用濾紙過濾染液以除去顆粒不溶性物質(zhì).脫色液的配制:90mL(甲醇:H20(1:1 V/V和10ml冰乙酸溶液.附:一、蛋白標準品的選擇凝膠電泳中一個關(guān)鍵的指示系統(tǒng),即蛋白標準品(Molecular Weight Marker,電泳的分離效率,轉(zhuǎn)膜效率以及電泳泳動情況等,皆需通過蛋白標準品來顯示,目前普遍采用的幾種蛋白標準品有: Blue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker M

25、ix Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight MarkerMix以上兩種Marker均為PIERCE公司的產(chǎn)品,貨號為:prod# 26681; prod# 26691;該標準蛋白不需染色,在電泳凝膠中隨著蛋白質(zhì)的遷移,各種分子質(zhì)量的標準蛋白逐漸分開,而顯示出非常漂亮的多色條帶,可通過電泳槽直接肉眼觀察各電泳帶的凝膠中的泳動情況,當相對于目的蛋白大小的標準蛋白與相鄰兩條標準蛋白達到所需分辨距離時,即可停止電泳,取出凝膠做進一步的轉(zhuǎn)膜工作。 Chemiluminescent BlueRangerR peroxidase-Labl

26、ed proteinMolecular Weight Marker Mix以上也為PIERCE產(chǎn)品,貨號為:prod# 26651,該標準蛋白同上也具有以上作用外,同時在使用化學(xué)發(fā)光時,和樣品一起顯色經(jīng)膠片曝光后,在膠片上可出現(xiàn)漂亮的條帶。 Blotinylated SDS Molecular Weight Marker Mix以上為Sigma公司產(chǎn)品,貨號為B2787,作用效果同二、對照的設(shè)置一般需要設(shè)立:內(nèi)參照, 提示系統(tǒng)的穩(wěn)定性,一般是一些管家蛋白陽性對照, 即肯定可以表達你的目的蛋白的組織或者細胞,同時可以提示你一抗的質(zhì)量陰性對照: 即肯定不會表達你的目的蛋白的組織或者細胞.在實驗中根

27、據(jù)你的需要選擇免疫印跡蛋白質(zhì)印跡法是將蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)SDS-PAGE后,分離為不同條帶,其中含有能與特異性抗體(或McAb相應(yīng)的待檢測的蛋白質(zhì)(抗原蛋白,將PAGE膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到NC膜上此過程稱為blotting,以利于隨后的檢測能夠的進行,隨后,將NC膜與抗血清一起孵育,使第一抗體與待檢的抗原決定簇結(jié)合(特異大蛋白條帶,再與酶標的第二抗體反應(yīng),即檢測樣品的待測抗原并可對其定量.一、設(shè)備和材料轉(zhuǎn)移電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳儀(電源震蕩器冰箱濾紙NC膜膠片暗室二、試劑封閉液:5%的脫脂牛奶粉TBS-T第一抗體(Ab1第二抗體(標記的Ab2底物以及顯色指示劑漂洗液(TBS-T轉(zhuǎn)印緩沖液抗體稀釋液麗春

28、紅S顯影液定影液三、試劑的配制封閉液: 5g的脫脂牛奶+100ml的TBS-T漂洗液(TBS-T: 0.01M TBS-T為Tris 1.21g+ NaCl5.84g+800ml H2O用HCl調(diào)節(jié)PH到7.5,假如0.05%或者0.1%Tween-20用H2O定溶至1000ml轉(zhuǎn)印緩沖液: 同5×SDS電泳緩沖液,不含SDS,如果采用PVD干膜或NC膜加20%甲醇,不加甲醇也可以Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1000ml,一般不需調(diào)節(jié)PH值 ,用時稀釋5倍到1×轉(zhuǎn)印緩沖液.顯影液:H2O-750ml米土爾-3g無水亞硫酸鈉-100g對苯二酚-3g溴化鉀-3g無水

29、碳酸鈉:先加5gPH10.0不夠時再加5g注:以上配定加H2o定容至1000ml定影液:起始水溫:60 H2o 700ml硫代硫酸鈉:240g無水亞硫酸鈉:25g冰醋酸:48ml注:加H2o至1000ml四、電印跡蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后,必須從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上,固相支持物具有牢固結(jié)合蛋白又不影響蛋白質(zhì)Ag活性,而且支持物本身還有免疫反應(yīng)惰性等特點,常用的支持物有:硝酸纖維膜(NC膜或PVDF膜。蛋白質(zhì)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的過程普遍采用電轉(zhuǎn)印法,分為半干式和濕式轉(zhuǎn)印兩種模式。一.半干式電轉(zhuǎn)印1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE結(jié)束后,取出凝膠,在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取

30、凝膠方法:用刀片將兩玻璃板分開,將多余的凝膠劃去,上部以濃縮膠為準全部棄去,下部以分子量標準最小分子帶下一點全部劃去,取一10ml注射器注滿轉(zhuǎn)印緩沖液,插入玻璃板與凝膠之間注水,使水的壓力將兩者自然分開,邊推邊進,反復(fù)多次注水,直至凝膠從玻璃板上滑落下來。2. 將NC膜和濾紙切出與凝膠一樣大小,置轉(zhuǎn)移緩沖液中濕潤5-10min.3. 按照以下順序放置濾紙,凝膠和NC膜到半干槽中。4. 每層之間的氣泡要全部去除?？梢杂?0ml吸管輕輕在上一層滾動去除氣泡,然后用一絕緣的塑料片中間挖空與凝膠一樣大小或略小一點,以防電流直接從沒有凝膠處通過造成短路,蓋好加上陽極電極板。二.濕式電轉(zhuǎn)印1. Tris/

31、甘氨酸-SDS-PAGE結(jié)束后,取出凝膠,在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取出凝膠方法同半干式電轉(zhuǎn)印。2. 打開電轉(zhuǎn)印夾,每側(cè)墊上一塊專用的用轉(zhuǎn)印液浸泡透的海面墊,再各放一塊轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙,濾紙與海面墊大小相同或與NC膜,凝膠大小相同均可,將凝膠平放在陰極側(cè)濾紙上,最后將NC膜平放在凝膠上,去除氣泡,夾好電轉(zhuǎn)印夾。3. 電泳槽加滿電轉(zhuǎn)印液,插入電轉(zhuǎn)印夾,將電泳槽放入冰箱內(nèi)(電轉(zhuǎn)印液之前要放入冰箱內(nèi)預(yù)冷,連接好電極,接通電流,轉(zhuǎn)印夾的NC膜應(yīng)對電泳槽的正極。五、印跡膜上總蛋白的染色在確定印跡中是否存在總蛋白之前,通過對硝酸纖維素膜染色可以了解轉(zhuǎn)印至膜上的總蛋白質(zhì)的組成情況,并可確定蛋白質(zhì)分

32、子質(zhì)量標記物的位置和確定轉(zhuǎn)印成功,同時,該方法也清楚地顯示出轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的復(fù)雜性.麗春紅S印跡膜染色法:麗春紅S適用于酸性水溶液,染色但是不持久,在后續(xù)的處理中紅色染料易被洗去,由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合是可逆性的,該染色方法適用于所有顯示抗原的餓技術(shù), 麗春紅S帶負電荷,可以與帶正電賀的氨基酸殘基結(jié)合,同時麗春紅也可以與蛋白的非極性區(qū)相結(jié)合,從而形成紅色條帶.1麗春紅溶液的配制:儲存液(10×: 0.1g麗春紅溶于5ml冰乙酸,加入H2O定容至100ml,臨用前稀釋10倍為應(yīng)用液.2操作步驟轉(zhuǎn)印結(jié)束后取出印跡膜至于麗春紅S應(yīng)用液中,并在室溫下攪動5-10分鐘將膜放入 PBS 洗數(shù)次,每次 1

33、-2 分鐘,并且更換 PBS 根據(jù)需要將轉(zhuǎn)印部位和分子量標準位置進行標記 至此膜可以用于封閉和加入抗體 x ?5>? / fa r y1 eZl 3kfg #jF=Yj 六、膜的封閉 k cog(Sd 5M 在進行抗體雜交之前，需要先對轉(zhuǎn)印膜進行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。封閉一 般采用異源性蛋白質(zhì)或去污劑，常用的有 0.2%Tween-20，20%BSA，10%馬血清以及 5% No-fat milk 等，至于選擇哪一類封閉液，首先應(yīng)考慮與檢測試劑相適應(yīng)，如采用葡萄球蛋白 A（SPA） 作用檢測試劑，就不能用全血清封閉，其次是盡可能使非特異著色背靜淺，封閉液以 20%BSA 效

34、果較好，其次是 5%N-fat milk. 封閉過程： xtUTOV =yW8NQ ca 1 洗轉(zhuǎn)印膜：室溫漂洗 3 次 x10min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的 SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。 PjKSX0+k 2 取漂洗的轉(zhuǎn)印膜，放入 5% No-fat milk 的封閉液內(nèi)，搖床震動，室溫封閉 2h，也可在 4 度過夜。 AG jRc 3 用 1xTBS-T ，PH7.6 洗液，室溫漂洗 3 次 x10min. tBu tAxd f#q2Bv : 七、抗體雜交 8 OJ_E i 抗體表面主要采用間接法。即先加入未標記特異性抗體（Ab1）與膜上抗原結(jié)合，再加入標記 的抗抗體（Ab2）進行雜交檢

35、測，標記 Ab2 物質(zhì)有放射性核素，酶，以及生物素等。 雜交過程： d,z I? 3/ ;gq5 M,=$ ）封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體稀釋液稀釋的 Ab1 濃度為 1ug/ml，封口，4孵 育過夜或室溫（22-25）搖動孵育 2h. ） 液洗膜 3 次 x10min (Bv15 H0$> q0h ）標記的 Ab2（羊抗兔-HRP）室溫 1h，洗膜 3x10min -8 6+2 / >GYD '&xJ 八、檢測 |#Y 2sM 根據(jù)標記 Ab2 的標記物不同,其雜交的結(jié)果檢測方法也不同,較常用的檢測系統(tǒng)有 HRP 標記 Ab2 的的增強化學(xué)發(fā)光(ECL和

36、DAB 檢測系統(tǒng). 1 辣根過氧化物酶-DAB 法: >?KIX " ?NSZiM DAB 顯色液的配制:按照 1mlH2O 加顯色劑 A,B,C 各 1 滴,混勻. b5ir tE=Y 顯色:將適量 DAB 顯色液平鋪在 Ab2 雜交后的印跡膜上,室溫放置觀察,可出現(xiàn)明顯的棕褐色 蛋白顯色帶 kzU MyY9R K 終止:用 Tris-HCl 緩沖液或水漂洗雜交膜即可終止反應(yīng). 2 辣根過氧化物酶-ECL 法: jB BZ R# H"An < 增強化學(xué)發(fā)光(ECL檢測是利用辣根過氧化物酶催化化學(xué)發(fā)光物質(zhì),生成一種不穩(wěn)定的中間物 質(zhì),其衰變時在暗室內(nèi)形成明顯的肉眼可見的化學(xué)發(fā)光帶,利用 X 線膠片感光原理,將結(jié)果記錄 下來: hx- n24=+ ECM 顯色劑配制:按 mlH2O 加顯色劑 A、B 各 1 滴,混勻. Rp&To =Yy6D