RNA抽提詳細步驟-

1、RNA抽提指南(TRIZOL法RNA抽提指南(TRIZOL法注意事項:* 全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實驗操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。* 使用滅菌的,一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA,避免使用公共儀器所導(dǎo)致的RNA酶交叉污染。例如,使用RNA探針的實驗室可能用RNA酶A 或T1來降低濾紙上的背景,因而某些非一次性的物品(如自動吸管可能富含RNA酶。* 在TRIZOL 中,RNA 是隔離在RNA 酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C 的烘箱中

2、烘烤4 小時。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘,用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。抽提步驟:1.勻漿化作用通過離心來沉淀細胞后,棄上清,用移液管加TRIZOL試劑反復(fù)吹打來裂解細胞至均一通亮的液態(tài)后,將勻漿樣品在1530°C 條件下孵育5 分鐘以使核蛋白體完全分解。(每510×106的動物細胞,植物或酵母菌細胞或每1×107 細菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前應(yīng)避免洗滌細胞因為那樣會增加mRNA降解的可能性。2.分離階段每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。蓋緊樣品管蓋,用手用力搖晃試管15 秒并將其在30°C 下

3、孵育23 分鐘。在28°C 下以不超過12,000×g 的離心力高速冷凍離心15 分鐘。離心后混合物分成三層:下層紅色的苯酚-氯仿層,中間層,上層無色的水樣層。RNA 無一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL 容量的60%3.RNA的沉淀將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中,通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀RNA。最初均化時的每1 m lTRIZOL 對應(yīng)0.5 ml 異丙醇。將混合的樣品在 1530°C 條件下孵育10 分鐘并在28°C 下以不超過12,000×g 的離心力高速冷凍離心10 分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見,形成

4、一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。(如果希望分離DNA 和蛋白,有機層同樣要予以保留。在除去水樣層后,樣品中的DNA 和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA,在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA 對于樣品間標(biāo)準(zhǔn)化RNA 的產(chǎn)量十分有用。4.RNA的洗脫移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA 沉淀一次,每1 ml 的TRIZOL 至少加1 ml 的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在28°C 下以不超過7,500×g的離心力高速冷凍離心5 分鐘。5.RNA的再溶解在操作的最后,簡單干燥RNA沉淀。尤為重要的是,不能讓RNA沉淀完全干燥那樣會極大地降

5、低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280 比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5% SDS溶液來溶解RNA,并在5560°C下孵育10 分鐘。TRIzol法抽提總RNA組織100mg加1mlTRIzol勻漿(要徹底,后轉(zhuǎn)至EP管(組織勻漿量>100mg時分裝1ml/每EP管顛倒混勻10下,室溫5分鐘(30°C孵育加氯仿1/5體積(0.2ml(必須按總體積的1/5顛倒混勻15S,室溫2-5分鐘(30°C孵育4,離心12000g,15分鐘轉(zhuǎn)上層水相(約400l于另一1.5mlEP管中加等體積異丙醇(約400 -500l,混勻

6、室溫10分鐘4,離心12000g,10分鐘(30°C孵育棄上清加冰預(yù)冷的75%乙醇(用DEPC水配1ml4離心7500g,5分鐘棄上清,空氣干燥5-10分鐘(不能完全干燥溶于DEPC水中至20l(10l-20l(可在55-60水中,<10分鐘助溶1:在核酸提取時,為了增加細胞的裂解度,增加核蛋白復(fù)合體破碎度,以釋放更多的游離核酸,在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K,在確保沒有核酸水解酶存在的前提下,酶反應(yīng)時間越長越好。2:有時在使用蛋白酶時,為了抑制核酸水解酶的降解作用,可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL,并且可將反應(yīng)溫度提高到50-60,并將反應(yīng)時間縮短到1

7、5-25min,但酶用量必須提高10-20倍。溶菌酶使用時緩沖液中需加EDTA,因游離金屬離子對酶有抑制。3:許多植物材料中富含酚,在細胞破碎時,在多酚氧化酶作用下,被氧化成有色的錕類物資,影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量,在提取液中加入PVP和巰基乙醇對降低酚類的干撓可能有所幫助。PVP將與酚形成復(fù)雜的聚合體,在提取時將酚從核酸成分中游離。且PVP與巰基乙醇作為強還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。4:許多生物材料在提取核酸時,都會遇到多糖的污染問題,具體表現(xiàn)為有機溶劑沉淀時,沉淀很多,但復(fù)溶時,大量沉淀不溶,電泳觀察時核酸含量很低?？朔嗵俏廴究?/p>

8、采用以下一些辦法(1CTAB多次抽提。(2在有機溶劑沉淀時先稀釋樣品濃度(可到10倍左右,對低濃度樣品再進行沉淀。(3在有機溶劑沉淀時選用異丙醇和5MNaCL作為沉淀溶劑,此時氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體積,異丙醇可用到0.6-1的體積。異丙醇沉淀核酸時,高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中,從而可達到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會影響核酸的進一步操作,因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。5:在核酸提取時,酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強于氯仿,但酚與水有一定的互溶,因此酚抽后,除可能損失部分核酸外,水相中還會殘留酚,而酚的存在將對核酸的酶反應(yīng)產(chǎn)生強的抑制,因此在操作中可單用氯仿作變

9、性劑、也可用酚/氯仿混合變性,也可用單一酚作變性己,但用單一酚后在有機溶劑沉淀時一定要用氯仿從抽提。6:在操作中當(dāng)加入變性劑氯仿后,為了保證核酸樣品的完整性,操作要輕,尤其在提DNA 時,更要避免劇烈操作。7:在沉淀核酸時可用乙醇與異丙醇,乙醇的極性要強于異丙醇,所以一般用2V乙醇沉淀,但在多糖、蛋白含量高時,用異丙醇沉淀可部分克服這種污染,尤其用異丙醇在室溫下沉淀對擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。8:在提取核酸時,如樣品濃度低,則應(yīng)增加有機溶劑沉淀時間,-70下>30min;-20過夜將有助于增加核酸的沉淀量。9:在核酸提取過程中有機溶劑沉淀后復(fù)溶時可加水因此時離子濃度可能較高,而到高度純化后低溫保存時最好復(fù)溶于TE緩沖液中,因溶于TE的核酸儲藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保