干擾素α2b生產(chǎn)工藝研究及行業(yè)分析

1、 干擾素2b生產(chǎn)工藝研究及行業(yè)分析姓 名: 郭文文 樊恒達(dá) 學(xué) 號: 2008114020324 專 業(yè): 生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù) 班 級: 0803班 湖北·黃石2011年5月干擾素2b生產(chǎn)工藝研究及行業(yè)分析1 前言干擾素是1957年英國科學(xué)家Isaccs等發(fā)現(xiàn)的。他們把滅活的流感病毒作用于小雞細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞產(chǎn)生了一種可溶性物質(zhì)，這種物質(zhì)能抑制流感病毒，并且能干擾其它病毒的繁殖，因此，他們將這種物質(zhì)稱為“干擾素”。以后科學(xué)家們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，機(jī)體對入侵的異種核酸（包括病毒）都產(chǎn)生干擾素以進(jìn)行防御。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞受到病毒感染時，機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，干擾病毒復(fù)制，它是機(jī)體抗病毒感染的防御

2、系統(tǒng)。干擾素是一種細(xì)胞因子。它是機(jī)體感染病毒時, 宿主細(xì)胞通過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)相似、功能相近的低分子糖蛋白。干擾素干擾病毒復(fù)制, 它是機(jī)體抗病毒感染的防御系統(tǒng)干擾素的種類很多，有人體干擾素、動物干擾素、昆蟲干擾素、植物干擾素和細(xì)胞干擾素。1目前所知道的人體干擾素按細(xì)胞結(jié)構(gòu)和來源分、干擾素三個型別, 干擾素又稱人白細(xì)胞干擾素，它是由B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的,它可以分為23種亞型,分別稱為干擾素1、2a、2b、3等，它們相互之間有較高的同源性。2人-干擾素是人纖維母細(xì)胞產(chǎn)生的, 只有一個亞型。一干擾素又稱免疫干擾素,它是由淋巴細(xì)胞的輔助誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的,與、干擾素之間沒有明顯的同源性

3、。三種干擾素都有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)活性。干擾素不能直接滅活病毒，而是通過誘導(dǎo)細(xì)胞合成抗病毒蛋白（AVP）發(fā)揮效應(yīng)。干擾素首先作用于細(xì)胞的干擾素受體，經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列生休過程，激活細(xì)胞基因表達(dá)多種抗病毒蛋白，實現(xiàn)對病毒的抑制作用。抗病毒蛋白主要包括2-5A合成酶和蛋白激酶等。前者降解病毒mRNA、后者抑制病毒多肽鏈的合成，使病毒復(fù)制終止。近年來在國際上抗病毒和抗癌癥的研究領(lǐng)域中,更多地在開發(fā)自然的免疫調(diào)節(jié)和抗病毒物質(zhì),干擾素作為一種天然的人體抗病毒蛋白質(zhì)受到人們的關(guān)注。干擾素將要成為21世紀(jì)抗病毒、抗癌癥最為廣泛的藥物之一3。干擾素是迄今為止治療慢性乙肝的首選抗病毒藥物, 一般肝炎治療藥

4、物的顯效率在20%-30%左右。干擾素代表了慢性肝炎藥物發(fā)展的方向。它還是治療丙肝的唯一有效抗病毒藥物, 它又是臨床上應(yīng)用最廣的治療腫瘤的細(xì)胞因子。它的適應(yīng)癥主要有病毒性皮膚性病、慢性子宮頸炎、呼吸道病毒感染及婦科疾病、疙疹、造血系統(tǒng)惡性腫瘤和淋巴瘤。-干擾素用于復(fù)發(fā)的多發(fā)性硬化癥，用于靜脈注射使用。-干擾素主要治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。-干擾素在免疫調(diào)節(jié)功能方面較、-干擾素強(qiáng)1000倍, 不僅可以增強(qiáng)免疫功能, 還可以調(diào)整自身免疫性疾病免疫過渡到接近正常水平3。干擾素還應(yīng)用于生殖道衣原體感染、淺表膀胱癌、尖銳濕疣、皮膚病、血液系統(tǒng)疾病、艾滋病相關(guān)綜合征等的治療。世界上已有許多國家批準(zhǔn)生產(chǎn)使用重組干

5、擾素制劑,用于治療多種疾病。經(jīng)過臨床應(yīng)用治療表明,用干擾素治療,一般無嚴(yán)重副反應(yīng).臨床上正在不斷開發(fā)新的適應(yīng)癥以擴(kuò)大干擾素的使用4。然而，傳統(tǒng)的從動物中提取血源性干擾素由于來源有限及技術(shù)資金方面問題而無法大量合成。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,通過先進(jìn)的基因工程技術(shù),可以在人體外大規(guī)模生產(chǎn)干擾素。所謂基因工程技術(shù)生產(chǎn)干擾素，是指從人細(xì)胞中克隆出干擾素基因, 將此基因與大腸桿菌表達(dá)載體連接物構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒, 然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中, 從而獲得高效表達(dá)人干擾素蛋白的工程菌, 工程菌經(jīng)發(fā)酵后可收集到大量菌體, 將菌體破裂, 用先進(jìn)的生物工程手段將干擾素蛋白從菌體分離、純化，得到高純度的人基因工程干擾素。基因工

6、程干擾素的出現(xiàn), 是干擾素研究工作的一項重大突破它使得干擾素能進(jìn)人大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),人們能獲得大量活性高、療效好的干擾素1。基因工程干擾素具有無污染,安全性高,純度高,比活性高,成本低,療效確切等優(yōu)點(diǎn)。如今臨床應(yīng)用的需求量越來越高，如何使基因工程干擾素大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成為了重要課題。想要推廣干擾素的使用,必須建立高效生產(chǎn)干擾素的體系4。重組人干擾素1b是世界上第一個采用中國人基因克隆和表達(dá)的基因工程藥物，也是到目前為止唯一的一個我國自主研制成功的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因工程一類新藥。分析近十年來干擾素的生產(chǎn)工藝及市場概況，對于未來干擾素的發(fā)展前景及市場走向具有重要意義。2 干擾素的生產(chǎn)工藝2.1

7、 體外誘生干擾素制備工藝 采用仙臺病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞，進(jìn)行一定的分離純化手段得到干擾素產(chǎn)品。由此生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的干擾素IFN-n3/Alferon1989批準(zhǔn)上市，但其產(chǎn)量低，生產(chǎn)1g IFN，需要 3億ml人血白細(xì)胞。來源困難，工藝復(fù)雜，收率低，價格昂貴，存在潛在的血源性病毒污染的可能性。2.2 人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝該工藝首次實現(xiàn)干擾素的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。1999年IFN -n1/Wellferon批準(zhǔn)用于臨床。但由于其活性低，逐漸退出臨床應(yīng)用。2.3 基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝此工藝運(yùn)用發(fā)酵過程，通過先變性后復(fù)性的純化手段大規(guī)模生產(chǎn)干擾素。 表達(dá)產(chǎn)物無糖基化，N-met，無活性包涵體。

8、重組人干擾素rhuIFN上市產(chǎn)品一覽表 1986 rhuIFN-2a rhuIFN-2b 1990 rhuIFN-1b 1993 rhuIFN-1b 20012002 PEG化IFN PEG-Intron Pegasys2.4 動物無限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝工藝采用分泌表達(dá)，產(chǎn)量低，成本高，過程嚴(yán)格。上市產(chǎn)品有rhuIFN -1a。如Avonex(Biogen)（1996），Rebif(Serono)（2002）。表達(dá)產(chǎn)物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku。2.5 基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝該工藝采用腐生型假單胞桿菌（Pseudomonas putida）作為宿主，發(fā)酵周期短，只有幾個

9、小時，無需變性、復(fù)性過程，獲得有活性產(chǎn)品。其純化過程淘汰抗體親和層析。表達(dá)產(chǎn)物無糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結(jié)構(gòu)和生物活性，上市產(chǎn)品有IFN -2b/安福隆。是目前較為成熟的生產(chǎn)工藝。下面介紹其工藝詳細(xì)步驟：基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建 2.5.1.1干擾素基因的克隆(RT-PCR)（1）制備白細(xì)胞，病毒誘導(dǎo)，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR。（2）基因連接質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化E.coli,篩選鑒定克隆。（3）測序。測序結(jié)果如圖所示。編碼人IFN-2b基因序列,501bp，165aa。2.5.1.2 表達(dá)載體構(gòu)建（1） IFN基因與表達(dá)載體連接（2）轉(zhuǎn)化大腸桿菌（3）篩選陽性克?。?）獲得序列

10、正確表達(dá)載體2.5.1.3工程菌構(gòu)建（1）轉(zhuǎn)化假單胞桿（2）篩選高表達(dá)、穩(wěn)定遺傳的工程菌（3）獲得原始菌種2.5.2 .干擾素-2b的發(fā)酵工藝過程 工藝流程圖如圖所示2.5.2.1搖瓶培養(yǎng)（1）取保存工作種子批菌種，室溫融化。（2）搖瓶培養(yǎng)：30，pH7.0，250 r/min，18±2h。（3）檢測：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。2.5.2.2 種子罐培養(yǎng)（1）接種：接入50L種子罐，接種量10%。（2）培養(yǎng)：30，pH7.0。（3）控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。DO為30%，34h，OD>4.0。（4）檢測：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。2.5.2.3 發(fā)酵罐培養(yǎng)（1）

11、接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%。（2）控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。（3）前4h：30，pH7.0，DO為30%。（4）4h后：20，pH6.0，DO為60%，56.5h。（5）終點(diǎn)控制：OD值達(dá)9.0±1.0，5冷卻水快速降溫至15以下。（6）檢測：發(fā)酵液雜菌檢查。2.5.2.4 菌體收集（1）連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液，16000 r/min離心收集。（2）菌體保存：20冰柜，不超過12個月。（3）檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。2.5.3 干擾素的分離純化工藝過程2.5.3.1 干擾素-2b分離工藝過程2.5.菌體裂解

12、（1）裂解緩沖液：純化水配制，210（pH7.5）。（2）使用保護(hù)劑：EDTA，PMSF。（3）破碎20菌體：2厘米以下的碎塊（4）攪拌：加裂解緩沖液，210，2hr。（5）凍融: 細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。2.5.3.1.2 預(yù)處理-沉淀（1）加絮凝劑聚乙烯亞胺:210，攪拌45min，對菌體碎片進(jìn)行絮凝。（2）加凝聚劑醋酸鈣溶液:210,攪拌15min，對菌體碎片、DNA等進(jìn)行沉淀。2.5.3.1.3 離心（1）連續(xù)流離心機(jī)：210，16000 r/min（2）收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)（3）雜質(zhì)沉淀：121、30min 蒸汽滅菌,焚燒處理。2.5.3.1.4 初級分離（1）鹽析:

13、4M硫酸銨，210，攪勻,靜置過夜。（2）離心：連續(xù)流離心機(jī)，16000 r/min（3）保存：收集沉淀，粗干擾素，4保存。2.5.3.2 干擾素純化工藝過程2.5.3.2.1 溶解粗干擾素（1）配制純化緩沖液： 超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45 m濾器和10 ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集。冷卻至210。（2）檢查緩沖液的pH值和電導(dǎo)值。（3）溶解。 210，勻漿，完全溶解。2.5.3.2.2 沉淀與疏水層析（1）等電點(diǎn)沉淀（一）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。（2）疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中，除去非疏水性蛋白。（3）洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.

14、0）。（4）等電點(diǎn)沉淀（二）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導(dǎo)值40 ms/cm，210，靜置過夜。（5）超濾：1000 ku超濾膜過濾，除去大蛋白。（6）透析除鹽：調(diào)整溶液pH 8.0，電導(dǎo)值，10 ku超濾膜，0.005 M緩沖液。2.5.3.2.3 陰離子交換層析與濃縮（1）0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹脂。（2）鹽濃度線性梯度550 ms/cm進(jìn)行洗脫，（3）配合SDS-PAGE收集干擾素峰。（4）濃縮：調(diào)整溶液和電導(dǎo)，10 ku超濾膜，0.05M醋酸緩沖液（pH5.0）中透析。2.5.3.2.4 陽離子交換層析與濃縮（1）用0.1M醋酸緩沖液（pH 5.0）平衡樹脂。（2）上樣

15、，相同緩沖液沖洗。（3）鹽濃度線性梯度550 ms/cm進(jìn)行洗脫（4）配合SDS-PAGE收集干擾素峰。（5）濃縮：10 ku超濾膜進(jìn)行。（6）凝膠過濾層析。（7）洗滌液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸緩沖液（pH7.0）清洗系統(tǒng)和樹脂。（8）上樣，相同緩沖液進(jìn)行洗脫。（9）合并干擾素部分。2.5.3.2.5 無菌過濾分裝（1）0.22 m濾膜過濾干擾素溶液。（2）分裝。（3）20以下的冰箱中保存。2.5.3.2.6 檢測項目（1）干擾素鑒別試驗。（2）干擾素效價測定。（3）蛋白質(zhì)含量，純度測定，分子量。（4）宿主殘余蛋白、殘余DNA。（5）干擾素結(jié)構(gòu)鑒定：紫外光譜，肽譜，N端序列。（

16、6）其他：熱原，內(nèi)毒素，殘留抗生素。3 我國基因工程制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展?fàn)顩r我國基因工程制藥產(chǎn)業(yè)起步于80年代末，雖然起步較晚，但發(fā)展速度很快。目前我國基因工程制藥產(chǎn)業(yè)已進(jìn)入快速發(fā)展時期。 1989年我國批準(zhǔn)了第一個在我國生產(chǎn)的基因工程藥物重組人干擾素1b，標(biāo)志著我國生產(chǎn)的基因工程藥物實現(xiàn)了零的突破。1998年我國基因工程制藥產(chǎn)業(yè)銷售額已達(dá)到了7.2億元。 截止1998年底，我國已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物和疫苗產(chǎn)品共計15種。近年來我國基因工程制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，年銷售額已從1996年的2.2億元增長到1998年的7.2億元，年均增長率高達(dá)80。預(yù)計2000年我國基因工程藥物銷售將達(dá)到22.8億元。我國生

17、物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，特別是生物制藥產(chǎn)業(yè)規(guī)模與美國相比差距很大?；蚬こ趟幬锷鲜袝r間較美國同品種上市時間晚510年。 然而，我國目前生物技術(shù)藥物卻一直苦于缺乏自主創(chuàng)新的產(chǎn)品，絕大多數(shù)上市藥物為仿制藥，創(chuàng)新藥物的開發(fā)一直未能打開局面。主要表現(xiàn)在以下幾個方面：（1）同種產(chǎn)品生產(chǎn)廠家過多，造成市場惡性競爭， 嚴(yán)重影響產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。后我國開始跟蹤研制的。我國新藥研究開發(fā)缺乏創(chuàng)新和低水平重復(fù)是導(dǎo)致醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)重復(fù)生產(chǎn)的源頭。（2）融資渠道單一、產(chǎn)業(yè)發(fā)展資金不足。成為基因工程制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的巨大障礙因素。（3）醫(yī)藥市場競爭無序，行業(yè)不正之風(fēng)嚴(yán)重。這種惡性競爭非但未能使消費(fèi)者受益，反而使得國家、制藥企業(yè)和廣大消費(fèi)者的利益

18、受到極大的損害。 （4）企業(yè)管理相對滯后，技術(shù)兼經(jīng)營型人才匱乏。企業(yè)的所有權(quán)與經(jīng)營權(quán)不分的狀況，既不利于企業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展，也不利于企業(yè)經(jīng)營階層即企業(yè)家階層的形成。 為此，要制定產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃，強(qiáng)化財政稅收優(yōu)惠政策，大力加強(qiáng)基因工程創(chuàng)新藥物的研制和生產(chǎn)。為從根本上改變我國基因工程制藥業(yè)重復(fù)生產(chǎn)和缺乏國際競爭力的局面，我國的新藥研制開發(fā)思路必須做出戰(zhàn)略調(diào)整，從以仿制為主向創(chuàng)新與仿制相結(jié)合轉(zhuǎn)變?？梢杂羞x擇地合法仿制一些專利即將過期、療效明確、應(yīng)用前景廣闊的基因工程藥物。對仿制藥物有關(guān)的專利要進(jìn)行認(rèn)真的研究，采取有效的專利回避策略，避免簡單的、盲目的仿制。要在仿制的基礎(chǔ)上創(chuàng)新。創(chuàng)造出與專利方法不同的生

19、產(chǎn)工藝和方法，以避免引起專利糾紛。54 干擾素制品國內(nèi)市場的現(xiàn)狀與發(fā)展分析4.1 需求量及其增長分析自1957年發(fā)現(xiàn)干擾素以來，40年來的研究使人們對干擾素的認(rèn)識已有了根本改觀，干擾素不僅是病毒間干擾現(xiàn)象的介質(zhì)，而且是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的重要系統(tǒng)，現(xiàn)在已發(fā)展成為與病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)以及腫瘤學(xué)有關(guān)的一個新興的研究領(lǐng)域，隨著生物工程技術(shù)的興起，目前已廣泛進(jìn)入臨床應(yīng)用時代。2006年-2009年我國干擾素需求量統(tǒng)計單位：千克數(shù)據(jù)來源：中國市場調(diào)查研究中心4.2 需求地域結(jié)構(gòu)分析我國干擾素區(qū)域市場需求分析數(shù)據(jù)來源：中國市場調(diào)查研究中心4.3 產(chǎn)品結(jié)構(gòu)分析干擾素按制作方法不同，可分為

20、利用基因工程生產(chǎn)的重組-干擾素和人自然干擾素兩大類。從我國市場研發(fā)情況來看，目前重組-干擾素占據(jù)的市場比重較大，約為67.4%。我國干擾素產(chǎn)品結(jié)構(gòu)分析數(shù)據(jù)來源：中國市場調(diào)查研究中心4.4 產(chǎn)量及其增長分析干擾素是目前臨床上應(yīng)用非常廣泛的藥物，也是人類對抗病毒尤其是病毒性肝炎（包括乙型肝炎和丙型肝炎）的重要武器，致使我國干擾素市場將進(jìn)入快速增長階段。從2006-2009我國干擾素市場產(chǎn)量統(tǒng)計圖中可以看出，2009年產(chǎn)量比2006年增加了3.84千克，2009年漲幅達(dá)到了11.38%。2006年-2009年我國干擾素產(chǎn)量統(tǒng)計單位：千克數(shù)據(jù)來源：中國市場調(diào)查研究中心4.5 供需平衡分析迄今為止，我國干擾素生產(chǎn)商已多達(dá)20多家。在2003年以后，