單域抗體的研究和應(yīng)用進(jìn)展

1、單域抗體的研究和應(yīng)用進(jìn)展單域抗體的研究和應(yīng)用進(jìn)展 本文關(guān)鍵詞：抗體，進(jìn)展，研究 單域抗體的研究和應(yīng)用進(jìn)展 本文簡介：摘要：傳統(tǒng)IgG抗體分子一般由輕鏈和重鏈組成，輕鏈包含一個(gè)可變區(qū)（VL）和一個(gè)恒定區(qū)（CL）,重鏈包含一個(gè)可變區(qū)（VH）和3個(gè)恒定區(qū)（CH1,CH2,CH3）.單域抗體（singledomainantibody,sdAb）,是指缺失抗體輕鏈，而只有重鏈可變區(qū)的一類抗體，因其分子量小，也被稱為納米抗體 單域抗體的研究和應(yīng)用進(jìn)展 本文內(nèi)容： 摘要：傳統(tǒng)Ig G抗體分子一般由輕鏈和重鏈組成， 輕鏈包含一個(gè)可變區(qū) （VL） 和一個(gè)恒定區(qū) （CL） , 重鏈包含一個(gè)可變區(qū) （VH） 和3個(gè)

2、恒定區(qū) （CH1, CH2, CH3） .單域抗體 （single domain antibody, sd Ab） , 是指缺失抗體輕鏈， 而只有重鏈可變區(qū)的一類抗體， 因其分子量小， 也被稱為納米抗體 （nanobody） .上世紀(jì)九十年代， 單域抗體最早在駱駝科動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)， 之后在護(hù)士鯊， 大星鯊和鰩魚等軟骨魚綱動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了類似的抗體。單域抗體雖然結(jié)構(gòu)簡單， 但仍然可以達(dá)到與傳統(tǒng)抗體相當(dāng)甚至更高的與特異抗原結(jié)合的親和力。相比于傳統(tǒng)抗體， 單域抗體具有分子量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、易于重組表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。近年來在生物學(xué)基礎(chǔ)研究和醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用方面均備受關(guān)注并被廣泛應(yīng)用。本文將從單域抗體的結(jié)構(gòu)特征、理化性

3、質(zhì)、篩選方法以及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。 關(guān)鍵詞：重鏈抗體； 單域抗體； 駱駝； 納米抗體； 傳統(tǒng)抗體分子 （Ig G） 在結(jié)構(gòu)上是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成， 此種結(jié)構(gòu)在哺乳動(dòng)物中均是非常保守的。抗體分子的輕鏈包含了一個(gè)VL區(qū)和一個(gè)CL區(qū) （圖1） , 而重鏈則擁有1個(gè)VH區(qū)和3個(gè)CH區(qū) （CH1、CH2和CH3） .VH區(qū)和VL區(qū)之間通過二硫鍵相互連接形成抗體的可變區(qū) （Fv） , 是抗體識別抗原的最小單位， 抗體可變區(qū)的序列差異決定了抗體能夠特異地識別不同的抗原。而CL區(qū)和CH區(qū)則是相對保守的， 被稱為抗體的恒定區(qū)， 其中CH區(qū)的CH2和CH3兩個(gè)區(qū)域?qū)τ诳贵w招

4、募免疫細(xì)胞發(fā)揮ADCC （抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用） 和CDC （補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用） 功能有著重要的作用1-2. 1993年布魯塞爾自由大學(xué)的HamersCasterman等首先報(bào)道了駱駝血液中除了傳統(tǒng)的Ig G抗體外還存在另一種類型的抗體， 與傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物抗體Ig G分子結(jié)構(gòu)不同， 這種抗體既缺失傳統(tǒng)抗體的輕鏈， 也缺少重鏈恒定區(qū)的CH1區(qū)域， 被稱為重鏈抗體 （Heavy chain antibody, Hc Ab） .重鏈抗體的可變區(qū)僅由抗體重鏈的可變區(qū)組成 （圖1） , 與傳統(tǒng)抗體的Fab類似， 該可變區(qū)可以與抗原特異性的結(jié)合， 因此重鏈抗體可以發(fā)揮和傳統(tǒng)抗體一樣的功能

5、。在哺乳類動(dòng)物中， 目前只有在胼足亞目的駱駝科動(dòng)物血液中發(fā)現(xiàn)含有功能性的重鏈抗體， 同屬于偶蹄目的反芻亞目和豬形亞目動(dòng)物體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)這類抗體3.Hc Ab普遍存在于各種駱駝科動(dòng)物中， 包括單峰駝Camelus dromedarius、亞州雙峰駝Camelus bactrianus、南美洲的大羊駝Lama glama、原駝Lama guanicoe、羊駝Vicugna pacos等動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)， 盡管其所占比例略有不同， 如在南美洲羊駝的血液中重鏈抗體比例為10%25%, 而在普通的雙峰駱駝中則高達(dá)50%80%4-5.除了駱駝科動(dòng)物外， 在護(hù)士鯊 （又稱為鉸口鯊， nurse shark, Gi

6、nglymostoma cirratum） 、大星鯊 （Smooth dogfish, Mustelus canis） 、白斑角鯊 （Spiny dogfish, Squalus acanthias） 、鰩魚 （Skate） 和魟魚 （Ray） 等軟骨魚綱動(dòng)物血液也存在類似結(jié)構(gòu)的抗體。在這些遠(yuǎn)古的物種血液中除了有異源四聚體的Ig M和Ig W抗體外， 還有一種被稱為新抗原受體 （Ig new antigen receptor） 的重鏈抗體， 簡稱為Ig NAR6, 這類抗體由兩個(gè)相同的重鏈組成， 重鏈包含5個(gè)恒定區(qū)和1個(gè)可變區(qū) （圖1） . 無論是駱駝科動(dòng)物來源的Hc Ab還是軟骨魚來源的Ig

7、 NAR, 其特異性結(jié)合抗原的均為單一重鏈的可變區(qū)， 分別被稱為VHH （Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody, VHH） 和VNAR （Variable domain of new antigen receptor, VNAR） .采用分子生物學(xué)技術(shù)直接克隆并重組表達(dá)VHH或VNAR, 可獲得只含有單個(gè)結(jié)構(gòu)域的最小單元抗原結(jié)合片段， 被稱為單域抗體 （Single-domain antibodies, sd Abs） , 亦被稱為納米抗體 （Nanobody） .單域抗體通常只由110-130個(gè)氨基酸組成， 分子量僅有1

8、215 kD a, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)完整抗體 （150160 kD a） 及其Fab片段 （約50 kD a） , 但卻能具備與傳統(tǒng)抗體相似或更高的特異性抗原親和力。單域抗體固有的分子量小、理化特征穩(wěn)定、親和力高和易于重組表達(dá)制備的特點(diǎn)使得其在被發(fā)現(xiàn)后備受關(guān)注， 經(jīng)過20多年的研究， 在免疫研究、診斷檢測、醫(yī)學(xué)和生物學(xué)成像、治療性抗體發(fā)展等領(lǐng)域的應(yīng)用均取得了積極進(jìn)展。本文主要從sd Abs的結(jié)構(gòu)和理化特征、篩選和制備方法、在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用等方面總結(jié)分析了單域抗體的新近研究進(jìn)展， 并展望了其進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用的前景以及面臨的問題。 1 單域抗體的理化性質(zhì) 相比于傳統(tǒng)抗體而言， 單域抗體有著獨(dú)

9、特的理化性質(zhì)。主要包括以下幾點(diǎn)： （1） 單域抗體的分子量小， 因?yàn)闆]有輕鏈的存在， 單域抗體VHH的大小只有15 k Da左右， 鯊魚來源的單域抗體VNAR因?yàn)槿鄙貱DR2區(qū) （Complementaritydetermining region 2, 互補(bǔ)決定簇2） , 只有12 k Da左右， 是已知的最小的抗原結(jié)合單位。這一特點(diǎn)使得其相對易于攜帶靶向藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部或穿越血腦屏障發(fā)揮作用。 （2） 單域抗體具有更好的溶解度和穩(wěn)定性。傳統(tǒng)抗體VH的FR2區(qū)域通常會(huì)包含數(shù)個(gè)相對保守的疏水氨基酸， 利于與VL通過疏水相互作用結(jié)合， 但在VHH中這段區(qū)域常是暴露的， 因此這幾個(gè)氨基酸被演化替換成

10、親水性的氨基酸， 例如， 在傳統(tǒng)抗體的VH中第37位的Val、第44位的Gly、第45位的Leu和第47位的Phe/Trp等疏水氨基酸， 在駱駝科動(dòng)物VHH中被相應(yīng)替換為Phe/Tyr （aa37） 、Glu/Gln （aa45） 、Arg/Cys （aa45） 、Gly/Arg/Leu/Ser （aa47） 等相對親水性更強(qiáng)的氨基酸7-8.這些氨基酸改變使得VHH在蛋白可逆折疊、熱穩(wěn)定性和抗蛋白降解等方面的性質(zhì)相較于傳統(tǒng)抗體更優(yōu)。一些單域抗體可以耐受2.33.3 mol/L的鹽酸胍以及6080的高溫9.此外， VHH除形成Ig分子保守的FR1 （framework region 1, 框架區(qū)

11、域1） 和FR3 （framework region 3, 框架區(qū)域3） 間的二硫鍵外， 還可能形成連接CDR1 （Complementaritydetermining region 1, 互補(bǔ)決定簇1） 和CDR3 （Complementarity-determining region 3, 互補(bǔ)決定簇3） 或者連接CDR2和CDR3之間的額外二硫鍵， 從而進(jìn)一步提高VHH構(gòu)象結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性10-12, 這些二硫鍵甚至可以讓單域抗體不被胃蛋白酶和糜蛋白酶降解， 因此有些單域抗體可以口服應(yīng)用10. （3） 單域抗體的CDR3較長， 使其與抗原的結(jié)合方式更加靈活， 此種結(jié)構(gòu)特征使得單域抗體可以結(jié)合

12、抗原凹狀的隱藏表位， 例如病毒的隱藏表位13和酶/受體蛋白分子的激活位點(diǎn)等14-15. （4） 與傳統(tǒng)的鼠單克隆抗體相比， 駱駝單域抗體的免疫原性更小， 鼠源抗體與人源抗體的差異較大， 導(dǎo)致其免疫原性強(qiáng)， 一般需要經(jīng)過復(fù)雜的人源化才能得到進(jìn)一步的應(yīng)用， 而駱駝抗體的VH和人抗體的VH相似度很高， 易于進(jìn)行人源化改造和臨床應(yīng)用。 2 單域抗體篩選方法 2.1 基于噬菌體表面展示技術(shù)的單域抗體篩選 噬菌體表面展示技術(shù)最早由Smith等在1985年發(fā)展出來， 該技術(shù)的核心是將目的基因通過基因工程方法融合表達(dá)在噬菌體外殼蛋白基因中， 使其展示在噬菌體表面， 進(jìn)而可通過特異性富集篩選獲得攜帶有靶蛋白/多

13、肽的噬菌體， 再進(jìn)行克隆化和序列測定， 并最終獲得靶蛋白/多肽的DNA編碼序列。這一技術(shù)借助噬菌體的高擴(kuò)增性， 將基因型和功能表型 （結(jié)合活性） 結(jié)合在一起， 是一種非常高效的篩選系統(tǒng)16. 由于不存在傳統(tǒng)抗體的輕重鏈匹配問題， 單域抗體更適合采用噬菌體展示文庫技術(shù)進(jìn)行篩選。噬菌體單域抗體文庫一般分為三大類：免疫庫、天然庫和全合成庫。免疫庫是指從預(yù)先免疫過的動(dòng)物 （如羊駝等） 體內(nèi)通過特異性富集靶抗原特異的B細(xì)胞基因， 并擴(kuò)增獲得重鏈抗體VH基因而構(gòu)建的單域抗體表達(dá)文庫， 通常只需較小庫容即可篩選到高親和力抗體。免疫庫的受限因素在于免疫原的特征， 不同免疫原在動(dòng)物中的體液免疫應(yīng)答強(qiáng)弱和表位差異

14、均可能影響最終獲得抗體的質(zhì)量和多樣性， 最終篩選到的抗體同質(zhì)化 （如識別的表位相同等） 程度較高。天然庫是采用未經(jīng)靶抗原免疫動(dòng)物的B細(xì)胞擴(kuò)增全部重鏈抗體VH基因構(gòu)建的單域抗體文庫。從天然庫中篩選獲得高親和力單域抗體的成功率基本與庫容成正比， 理論上只要所構(gòu)建的抗體庫庫容和多樣性足夠大 （>10 CFU/m L） , 即可從中篩選到針對各種靶抗原的高親和力單域抗體， 甚至是針對哺乳動(dòng)物中高度保守的抗原 （類似自身抗原） 的單域抗體。盡管天然庫已具有較高多樣性， 但由于在實(shí)際建庫操作中， 會(huì)因抗體基因家族的偏向性、先天免疫耐受導(dǎo)致的克隆缺失等原因?qū)е露鄻有越档?。直接采用基因合成方法?gòu)建的合成

15、單域抗體庫可通過調(diào)節(jié)抗體分子中抗原結(jié)合區(qū)域附近的骨架區(qū)域來進(jìn)一步提高庫的多樣性， 也可直接基于人源化的VHH分子骨架進(jìn)行合成構(gòu)建。Sandrine Moutel等新近采用全合成的方法構(gòu)建了人源化的通用單域抗體庫Na Li-H1, 庫容達(dá)到3×10, 并從中成功篩選到若干針對不同靶標(biāo)的高親和力單域抗體 （k D達(dá)到10mol/L10mol/L） 17. 噬菌體展示技術(shù)篩選抗體的流程一般包括以下幾點(diǎn) （圖2） : （1） 抗體基因片段的獲取。取羊駝或鯊魚的外周血， 采用淋巴細(xì)胞分離液分離得到淋巴細(xì)胞， 提取淋巴細(xì)胞的總RNA, 通過RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄成c DNA, 采用巢式PCR兩步法擴(kuò)

16、增VHH基因， 最后將VHH基因克隆到噬菌體載體上， 克隆構(gòu)建完成后可用二代測序的方法來質(zhì)控文庫質(zhì)量。 （2） 目的基因的淘選。先將噬菌體文庫與不帶有目的抗原的封閉液共孵育， 進(jìn)行負(fù)選， 減少非特異性反應(yīng)， 提高抗體淘選的效率。再將抗原固定到固相載體上 （聚苯乙烯板或者磁珠） 進(jìn)行淘選。淘選一般要進(jìn)行多輪， 每輪淘選后可采用Phage-ELISA檢測， 直到能檢測到明顯的富集效果。 （3） 抗體的表達(dá)純化， 將目的抗體基因序列克隆到表達(dá)載體上， 可以通過原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。   2.2 基于酵母表面展示技術(shù)的單域抗體篩選 酵母屬于真核的單細(xì)胞生物， 用于抗體展示技術(shù)的

17、酵母一般是釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae, 這種酵母有大約200 nm厚的細(xì)胞壁， 出芽的酵母細(xì)胞壁表面有凝集素蛋白， 可以與相對交配型的酵母上的Aga2p蛋白結(jié)合， 單域抗體便是以融合蛋白的形式與Aga2p蛋白融合表達(dá)并展示于酵母細(xì)胞表面18-20. 酵母展示抗體庫的篩選方法一般采用磁珠輔助的細(xì)胞分選 （MACS） 和流式細(xì)胞分選 （FACS） , MACS的主要作用是為了減少非特異性結(jié)合， 通常會(huì)在MACS篩選過后的基礎(chǔ)上進(jìn)行多輪的FACS進(jìn)行篩選20,21. 相比于噬菌體展示技術(shù)， 酵母展示技術(shù)既有優(yōu)勢也有不足。一方面酵母屬于真核細(xì)胞， 抗體的翻譯后修飾與哺乳動(dòng)

18、物細(xì)胞類似， 糖基化后的抗體穩(wěn)定性高， 同時(shí)也避免在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中可能存在的未知情況。其次酵母展示技術(shù)采用的是流式細(xì)胞分選的方法， 整個(gè)篩選過程的可控性更高16.但另一方面酵母抗體庫的庫容一般比噬菌體抗體庫的小， 最高到1×10, CFU, 但隨著技術(shù)的優(yōu)化， 已有報(bào)道酵母抗體庫的庫容可以提高到10CFU水平22, 而噬菌體抗體庫的庫容可以高達(dá)10CFU.同時(shí)酵母展示技術(shù)在篩選低聚物的抗原時(shí)效果可能不理想， 因?yàn)槊恳粋€(gè)酵母細(xì)胞上會(huì)同時(shí)展示1×10到1×10個(gè)抗體片段20, 因此一個(gè)酵母細(xì)胞可能同時(shí)共價(jià)結(jié)合多個(gè)抗原， 這樣便會(huì)導(dǎo)致篩選到的抗體的親和力可能不如預(yù)期

19、。 2.3 基于細(xì)菌展示技術(shù)的單域抗體篩選 大腸埃希氏菌Escherichia coli除了用于噬菌體文庫的構(gòu)建外， 其本身也可以作為抗體展示的載體。大腸埃希氏菌E.coli屬于革蘭氏陰性菌， 除了有細(xì)菌內(nèi)膜， 在細(xì)胞壁外還有一層細(xì)菌外膜?？贵w片段通常展示在E.coli細(xì)菌的內(nèi)膜， 通過抗體的Fc段與膜上的脂蛋白結(jié)合， 這種展示和表達(dá)方式稱為Anchored periplasmic expression （APEx、錨定周質(zhì)表達(dá)） .但由于E.coli細(xì)菌細(xì)胞壁和外膜的存在， 因此細(xì)菌需要通透處理成原生質(zhì)球的形式才能與抗原結(jié)合23-24.利用外膜展示抗體的技術(shù)也有被報(bào)道過， 例如Salema等

20、將抗體片段展示在Eha A autotransporter （自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白） 或Intimin （緊密黏附素） 上， 這兩種蛋白來源于E.coli O157:H7 （EHEC） 細(xì)菌的外膜， 且可以在E.coli K-12細(xì)菌中表達(dá)和展示25-27.革蘭氏陽性菌中的肉葡萄球菌Staphylococcus carnosus也可以用于抗體展示， 該方法是通過肉葡萄球菌的staphylococcal protein A蛋白的細(xì)胞壁錨定區(qū)域 （Cell-wall anchoring domain） 將抗體片段從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到膜外并錨定在細(xì)胞壁上28.細(xì)菌展示技術(shù)的篩選方法一般采用流式細(xì)胞分選 （FACS

21、） 的方式， 同時(shí)也會(huì)結(jié)合磁珠輔助的細(xì)胞分選 （MACS） . 3 單域抗體的應(yīng)用 3.1 單域抗體在顯微鏡學(xué)中的應(yīng)用 因?yàn)閱斡蚩贵w體積小， 已經(jīng)有許多研究證實(shí)了將單域抗體帶上標(biāo)簽后， 可以用作納米級的檢測工具。例如， 針對GFP和RFP等熒光蛋白的單域抗體在標(biāo)記上有機(jī)染料后可用于超分辨率顯微鏡成像29-30.在2012年， Ries J等利用該方法對穩(wěn)定表達(dá)tubulin-YFP的Ptk2細(xì)胞進(jìn)行成像， 并最終將分辨率提高到 （26.9±3.7） nm （細(xì)胞微管蛋白的直徑為25 nm） 29, 而如果用傳統(tǒng)的抗體， 分辨率只能達(dá)到45 nm左右。Chamma等將GFP的單域抗體應(yīng)

22、用于活細(xì)胞成像和雙色熒光成像系統(tǒng)。他們利用單域抗體去活體標(biāo)記軸突蛋白-1， 然后用雙色成像系統(tǒng)去觀察神經(jīng)細(xì)胞間的跨突觸連接31.GFP和RFP的單域抗體還可以用于研究亞細(xì)胞上的超微結(jié)構(gòu)， 例如核孔復(fù)合物和胞膜窖， 與間接的抗體免疫化學(xué)方法不同， 利用單域抗體染色可以更好的模擬這些超微結(jié)構(gòu)的真實(shí)情況32-33. 3.2 單域抗體用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究 單域抗體結(jié)合抗原可以穩(wěn)定抗原的結(jié)構(gòu)， 并且單域抗體本身分子量小， 對抗原的影響小， 所以單域抗體被用于穩(wěn)定一些結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的蛋白， 輔助解析蛋白的結(jié)構(gòu)。G蛋白偶聯(lián)受體GPCRs （G protein coupled receptors） 是一肽類膜蛋白受

23、體的簡稱， 是最著名的藥物靶標(biāo)分子。它參與了很多細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程， 可以調(diào)節(jié)人體許多生理學(xué)機(jī)能。相同的GPCRs可以結(jié)合不同親和力的激動(dòng)劑分子， 并激活不同的下游信號通路。為了更好地理解不同的激動(dòng)劑分子為何可以激活相同的受體， GPCRs的晶體結(jié)構(gòu)解析是非常重要的手段。2-adrenoceptor （2AR、2腎上腺素受體） 是GPCRs的成員， 它可以被許多天然激動(dòng)劑， 如腎上腺素 （Adrenaline） 等低親和力地結(jié)合并激活， 但不穩(wěn)定。2AR也可以和BI-167107 （Boehringer Ingelheim） 等商品化激動(dòng)劑高親和力地結(jié)合并維持穩(wěn)定的激活狀態(tài)。G蛋白可以通過與2

24、AR結(jié)合并增強(qiáng)其與激動(dòng)劑之間的親和力。Nb80是一株來源于美洲駝 （llama） 的單域抗體， 它可以與2AR結(jié)合并表現(xiàn)出和G蛋白一樣的性質(zhì)34-35.Soren G.F.Rasmussen等利用Nb80與2AR的變體2AR-T4L （第3個(gè)胞內(nèi)環(huán)被替換成T4溶菌酶） 結(jié)合形成的復(fù)合物2AR-T4L-Nb80成功地解析了BI-167107激活下的2AR晶體結(jié)構(gòu)， 分辨率為3.5?34.之后， Aaron M.Ring等通過酵母展示技術(shù)篩選不同的Nb80變體， 并成功得到了一株Nb6B9抗體， 這株抗體可以將BI-167107激活下的2AR晶體結(jié)構(gòu)分辨率提高到2.8?, 同時(shí)也解析了hydrox

25、ybenzyl isoproterenol （HBI、羥芐基異丙腎上腺素） 和adrenaline這兩類低親和力激動(dòng)劑結(jié)合下的2AR的晶體結(jié)構(gòu)， 分辨率分別為3.1?和3.2?36.Dean P Staus等還發(fā)現(xiàn)了一株可以顯著降低2AR與激動(dòng)劑親和力的抗體Nb60, 進(jìn)一步擴(kuò)大了2AR的變構(gòu)潛力37. 3.3 單域抗體用于醫(yī)學(xué)診斷 雖然傳統(tǒng)的單克隆抗體在標(biāo)記了放射性元素 （99m Tc或68Ga） 后可以用于醫(yī)學(xué)診斷和顯影， 但是由于抗體的分子量大， 一方面組織的穿透性不好， 成像組織受限， 另一方面半衰期長， 無法在短時(shí)間內(nèi)被清除。單域抗體分子量小， 可以更快速地進(jìn)入組織， 縮短檢測時(shí)間。

26、同時(shí)半衰期短只有12 h, 不會(huì)長時(shí)間滯留在組織中。Balhuizen等利用放射性同位素99m Tc標(biāo)記的單域抗體追蹤胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞， 因?yàn)橐认賰?nèi)分泌細(xì)胞的二肽基肽酶6 （DPP6） 的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其周圍的組織細(xì)胞， 所以可以通過篩選針對DPP6的單域抗體來實(shí)現(xiàn)對胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的定位追蹤， 并且在過繼轉(zhuǎn)移了表達(dá)DPP6的Kelly神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的免疫缺陷小鼠模型上驗(yàn)證了該方法的可行性38.PD-1/PD-L1抗體藥物是當(dāng)前備受矚目且前景較好的腫瘤治療手段， 但是有一部分病人對該類藥物無應(yīng)答， 如果能在治療前預(yù)測到患者對該類藥物的應(yīng)答效果， 更有利于對癥下藥。Broos等通過篩選針對PD-L1

27、的單域抗體并標(biāo)記99m Tc同位素， 最終發(fā)現(xiàn)了兩株可以與PD-L1表達(dá)的腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而與PD-L1缺失的腫瘤細(xì)胞不反應(yīng)的單域抗體C3和E2, 并且證明這兩株抗體標(biāo)記的同位素與PD-L1的表達(dá)量存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系39, 這也就說明了單域抗體可以用于腫瘤微環(huán)境中目的分子的成像分析。 3.4 單域抗體介導(dǎo)的藥物傳遞 目前已有文章報(bào)道針對腫瘤特異抗原的單域抗體可用于介導(dǎo)藥物特異性地識別腫瘤， 從而減少藥物對正常細(xì)胞的非特異性細(xì)胞毒性。單域抗體沒有Fc段， 因此可以避免被Fc介導(dǎo)的清除作用降解， 同時(shí)也不會(huì)誘發(fā)免疫反應(yīng)40.針對腫瘤組織而言， 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體 （VEGFR） 是很好的抗體

28、靶標(biāo)， 因此該類的報(bào)道較多41-45, 例如Ahani等， 他們首先構(gòu)建了外膜包被Sindbis virus E2糖蛋白 （c SVE2s） , 內(nèi)部包裹針對腫瘤血管內(nèi)皮生長因子受體2 （VEGFR2或KDR） 的慢病毒的假病毒， 然后將針對VEGFR2的單域抗體p2.2-Nb與c SVE2s連接， 通過單域抗體的靶向作用將假病毒帶入腫瘤組織41.Deng等通過將針對VEGFR的單域抗體與cucurmosin （南瓜蛋白） 連接， 利用cucurmosin蛋白的促凋亡作用來殺傷腫瘤， 作者直接采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了該重組蛋白， 并在體外驗(yàn)證了該重組蛋白的抗腫瘤效應(yīng)46.除了針對VEGFR分子外

29、， 還有針對腫瘤其他相關(guān)分子靶標(biāo)的單域抗體被報(bào)道， 例如CD7 （TP-40） , CD7分子主要表達(dá)于急性淋巴細(xì)胞白血病的T細(xì)胞， 針對CD7分子的抗毒素已經(jīng)被證明對CD7+惡性病人具有潛在治療效果， Tang等將針對CD7的單域抗體和毒素Pseudomonas exotoxin A （PE38、假單胞菌外毒素A） 偶聯(lián)， 同樣采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該重組蛋白， 并在CD7陽性的白血病細(xì)胞系Jurkat和CEM細(xì)胞以及T-cell acute lymphoblastic leukemia （T-ALL、T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病） 和Acute myeloid leukemia （AML、急性粒

30、細(xì)胞白血?。?細(xì)胞上驗(yàn)證了其可以顯著的促進(jìn)這類細(xì)胞的凋亡47. 3.5 單域抗體用于疾病治療 單域抗體和傳統(tǒng)抗體一樣可以用于疾病的治療， 但因?yàn)閱斡蚩贵w發(fā)展得比較晚， 因此目前用于疾病治療的單域抗體數(shù)量不多， 而且多數(shù)還處于臨床研究階段， 如表1所示， 目前僅有一株單域抗體caplacizumab （ALX-0081） 完成了三期臨床研究， caplacizumab是一株可用于治療獲得性血栓性血小板減少性紫癜 （TTP） 的單域抗體， 它的靶標(biāo)分子是血管性血友病因子， 通過與該因子結(jié)合， 抑制該因子和血小板之間的相互作用， 從而防止血小板的聚集48-49.II期臨床的結(jié)果顯示相比于安慰劑， c

31、aplacizumab可以顯著的緩解急性發(fā)作的TTP, 說明了caplacizumab對病人的血小板有保護(hù)作用， 但是caplacizumab也同時(shí)增加了病人的出血傾向50-52.ALX-0171是一株針對呼吸道合胞體病毒的具有潛在治療效果的單域抗體， 相比于傳統(tǒng)的帕利珠單抗， 這株單域抗體在A型和B型的病毒株中展現(xiàn)出更好的體外中和活性， 同時(shí)針對病毒的復(fù)制也顯示出更好的抑制效果13.同樣值得關(guān)注的是KN035單域抗體， KN035是我國第一個(gè)自主研發(fā)的PD-L1單域抗體藥物， 它可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的T細(xì)胞應(yīng)答， 并抑制腫瘤的生長。對KN035與PD-L1的復(fù)合物進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)KN03

32、5可以競爭性地封閉PD-L1與PD1的幾個(gè)關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)， 例如Ile54、Tyr56 and Arg11353.在2017年1月， KN035獲得臨床批準(zhǔn)并在3月底開始了第一例臨床試驗(yàn)。 4 總結(jié)和展望 單域抗體相比傳統(tǒng)抗體而言不僅擁有更優(yōu)的理化性質(zhì)， 而且表達(dá)和篩選也更加簡便。從單域抗體被發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)有20多年， 在這20年里單域抗體在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中實(shí)現(xiàn)了多方面的應(yīng)用， 不僅促進(jìn)了某些技術(shù)的更新， 同時(shí)也為疾病的治療和診斷提供了新的可能性。 雖然單域抗體為抗體研究提供了新的突破口， 但也仍然存在一些問題， 一方面單域抗體的半衰期短， 雖然適用于分子顯影， 但是如果作為藥物治療的話， 可能

33、會(huì)導(dǎo)致其過早的被系統(tǒng)代謝， 不僅無法起到長期的保護(hù)作用， 同時(shí)也會(huì)增加腎臟的代謝壓力。另一方面， 單域抗體雖然篩選和表達(dá)相對簡單， 但如果要獲得理想的具有很好應(yīng)用價(jià)值的單域抗體是一個(gè)非常繁瑣的過程， 噬菌體抗體文庫的篩選無法避免絲狀噬菌體表面易與抗原結(jié)合帶來的假陽性， 酵母和細(xì)菌抗體文庫庫容小等都是單域抗體篩選的難點(diǎn)。 單域抗體在未來勢必還會(huì)有更大的應(yīng)用。 （1） 單域抗體可用于雙特異性抗體的構(gòu)建， 雙特異性抗體是一類可以同時(shí)特異性結(jié)合兩種不同抗原的人工改造抗體， 在腫瘤免疫和自身免疫治療中有非常廣闊的應(yīng)用前景， 單域抗體易于改造和表達(dá)的特性在這領(lǐng)域中必然會(huì)發(fā)揮重要的功能54. （2） 隨著胞

34、內(nèi)抗體技術(shù)的發(fā)展， 以胞內(nèi)分子為靶標(biāo)的抗體治療成為了可能55, 而單域抗體在這方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢， 一方面單域抗體分子量小， 入胞的效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)抗體， 而傳統(tǒng)抗體的入胞一般也會(huì)采用sc Fv （單鏈抗體可變區(qū)） 的形式56-57以減小抗體分子量。另一方面因?yàn)榘麅?nèi)抗體必須要在高還原性的胞內(nèi)環(huán)境中保持活性， 因此往往需要對抗體進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑?。單域抗體易于改造并且可以用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的優(yōu)勢將會(huì)展現(xiàn)強(qiáng)大的利用價(jià)值。我們團(tuán)隊(duì)也在嘗試篩選針對乙型肝炎病毒核心顆粒HBc Ag的單域抗體， 并希望通過已有的抗體入胞技術(shù)將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)， 觀察其對胞內(nèi)病毒復(fù)制的影響。 （3） 利用全合成的天然單域抗體合成

35、庫篩選抗體的方式不僅可以減少了動(dòng)物免疫的步驟， 而且有利于去篩選某些構(gòu)象特異和細(xì)胞表面特異的抗原分子17.隨著建庫技術(shù)的更新， 更高的抗體庫庫容會(huì)有利于建立更加廣泛通用的天然抗體庫。 參考文獻(xiàn) 1Liu Z, Gunasekaran K, Wang W, et al.Asymmetrical Fc engineering greatly enhances antibody-dependent cellular cytotoxicity （ADCC） effector function and stability of the modified antibodies.J Biol Chem, 2

36、014, 289 （6） :3571-3590. 2Kinder M, Greenplate AR, Strohl WR, et al.An Fc engineering approach that modulates antibody-dependent cytokine release without altering cell-killing functions.MAbs, 2015, 7 （3） :494-504. 3Muyldermans S, Lauwereys M.Unique single-domain antigen binding fragments derived from naturally occurring camel heavy-chain antibodies.J Mol Recognit, 1999, 12 （2） :131-140. 4Blanc MR, Anouassi A, Ahmed AM, et al.Aone-step exclusion