實驗室常用技術(shù)參數(shù)資料精

1、實驗室常用技術(shù)參數(shù)資料一、核酸及蛋白質(zhì)常用數(shù)據(jù) 1核苷三磷酸的物理常數(shù)化合物分子量max(pH7.0)1摩爾溶液（pH7.0）中max時的最大吸收值OD280/OD260ATP507259154000.15CTP48327190000.97GTP523253137000.66UTP484262100000.38dATP494259152000.15dCTP46727193000.98dGTP507253137000.66dTTP48226796000.712常用核酸的長度與分子量核酸核苷酸數(shù)分子量DNA48502（雙鏈環(huán)狀）3.0×107pBR3224363（雙鏈）2.8×

2、10628SrRNA48001.6×10623SrRNA37001.2×10618SrRNA19006.1×10519SrRNA17005.5×1055SrRNA1203.6×104tRNA（大腸桿菌）752.5×1043常用核酸蛋白換算數(shù)據(jù)（1）重量換算1g=10-6g 1pg=10-12g1ng=10-9g 1fg=10-15g（2）分光光度換算：1A260雙鏈DNA=50g/ml1A260單鏈DNA=30g/ml1A260單鏈RNA=40g/ml（3）DNA摩爾換算：1g 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol末

3、端1g pBR322 DNA=0.36pmol1pmol 1000bp DNA=0.66g1pmol pBR322=2.8g1kb雙鏈DNA（鈉鹽）=6.6×105道爾頓1kb單鏈DNA（鈉鹽）=3.3×105道爾頓1kb單鏈RNA（鈉鹽）=3.4×105道爾頓（4）蛋白摩爾換算：100pmol分子量100，000蛋白質(zhì)=10g100pmol分子量50，000蛋白質(zhì)=5g100pmol分子量10，000蛋白質(zhì)=1g氨基酸的平均分子量=126.7道爾頓（5）蛋白質(zhì)/DNA換算：1kb DNA=333 個氨基酸編碼容量=3.7×104MW蛋白質(zhì)10，000M

4、W蛋白質(zhì)=270bp DNA30，000MW蛋白質(zhì)=810bp DNA50，000MW蛋白質(zhì)=1.35kb100，000MW蛋白質(zhì)=2.7kb DNA4常用蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物（1）高分子量標(biāo)準(zhǔn)參照（2）中分子量標(biāo)準(zhǔn)參照（3）低分子量標(biāo)準(zhǔn)參照肌球蛋白分子量磷酸化酶B97，400碳酸酐酶31，00肌球蛋白212，000牛血清白蛋白66，200大豆脻蛋白酶21，500-半乳糖甘酶B116，000谷氨酶脫氫酶55，000抑制劑磷酸化酶B97，400卵白蛋白42，700馬心肌球蛋白16，900牛血清白蛋白66，200醛縮酶40，000溶菌酶14，400過氧化氫酶57，000碳酸酐酶31，000肌球蛋

5、白（F1）8，100醛縮酶40，000大豆脻蛋白酶21，500肌球蛋白（F2）6，200抑制劑肌球蛋白（F3）2，500溶菌酶14，4005常用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物DNA/HindDNA/EcoR/Hind+EcoRpBR322/Hae23130212262122758712394167421514840510465575804497350489436156434268458802322484335304346420273530202726757564190423451125158421321137519218974184118311247564125續(xù)上表pBR322/Hinf174/Hi

6、nf174/Hae 174/Tap16317261401353291451771311810781175506553100872404396500826033273444176631023129841348281141221311422718722024940234541542002419433751511182072二、常用緩沖液1分子克隆常用緩沖液2磷酸緩沖液（1）25下0.1mol/L磷酸鉀緩沖液的配制pH1mol/L K2HPO4(ml)1mol/L KH2PO4(ml)5.88.591.56.013.286.86.219.280.86.427.872.26.638.161.96.84

7、9.750.37.061.538.57.271.728.37.480.219.87.686.613.47.890.89.28.094.06.2（2）25下0.1mol/L磷酸鈉緩沖液的配制pH1mol/L Na2HPO4(ml)1mol/L NaH2PO4(ml)5.87.992.16.012.088.06.217.882.26.425.574.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.268.431.67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8:用蒸餾水將混合的兩種1mol/L貯存液稀釋至1000ml，根據(jù)Hender

8、son-Hasselbalch方程計算其pH值：pH=pK+1g(質(zhì)子受體/質(zhì)子供體)在此，pK=6.86(25)。3電泳緩沖液測序凝膠加樣緩沖液98%去離子甲酰胺10mol/L EDTA(pH8.0)0.025%二甲苯青FF0.025%溴酚藍(lán)甲酰胺：許多批號的試劑級甲酰胺，其純度符合使用要求，無須再進(jìn)行處理。不過，一旦略呈黃色，則應(yīng)用在磁力攪拌器上將甲酰胺與Dowex XG8混合床樹脂共同攪拌1小時進(jìn)行去離子處理，并用Whatman 1號濾紙過濾2次，去離子甲酰胺分裝成小份，充氮存于-70。常用的電泳緩沖液緩沖液使用液濃貯存液（每升）Tris-乙酸（TAE）1×：0.04mol/L

9、 Tris-乙酸50×：242g Tris堿0.001mol/L EDTA57.1ml冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-磷酸（TPE）1×:0.09mol/L Tris-磷酸10×:10g Tris堿0.002mol/L EDTA15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-硼酸（TBE）a0.5×0.045mol/L Tris-硼酸5×：54g Tris堿0.001mol/L EDTA27.5硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)堿性緩

10、沖液b1×:50mmol/L NaOH1×:5ml 10mol/L NaOH1mmol/L EDTA2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)Tris-甘氨酸c1×:25mmol/L Tris5×:15.1g Tris250mmol/L 甘氨酸94g 苷氨酸（電泳級）（pH8.3）0.1% SDS50ml 10% SDS(電泳級)說明：TBE溶液長時間存放后會形成沉淀物，為避免這一問題，可在室溫下用玻璃瓶保存5×溶液，出現(xiàn)沉淀后則予以廢棄。以片都以1×TBE作為使用液（即1：5稀釋濃貯液）進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。但0.5×

11、;的使用液已具備足夠的緩沖容量。目前幾乎所有的瓊脂糖膠電泳都以1：10稀釋的貯存液作為使用液。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠垂直槽的緩沖液槽較小， 故通過緩沖液的電流量通常較大，需要使用1×TBE以提供足夠的緩沖容量。堿性電泳緩沖液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。Tris-甘氨酸緩沖液用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。2×SDS凝膠加樣緩沖液：100mmol/L Tris·HCl(6.8)200mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）4%SDS（電泳級）0.2%溴酚藍(lán)20%甘油不含DTT的2×SDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，應(yīng)在臨用前取1mol/L貯存液現(xiàn)加于上述緩沖液中。4凝膠加樣緩沖液緩沖液類

12、型6×緩沖液貯存溫度0.25%溴酚藍(lán)40.25%二甲苯青FF40%（W/V）蔗糖水溶液0.25溴酚藍(lán)室溫0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖(Ficoll400)0.25%溴酚藍(lán)40.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液0.25%溴酚藍(lán)440%(W/V)蔗糖水溶液堿性加樣緩沖液:300mmol/L NaOH6mmol/L EDTA18%聚蔗糖(Ficoll400)40.15%溴甲酚綠0.25%二甲苯青FF使用以上凝膠加樣緩沖液的目的有三：增大樣品密度；以確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi)；使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操作更為便利，含有在電塊中能以可預(yù)知速率向陽極泳動的染料。溴酚藍(lán)在瓊脂糖中移動的速

13、率約為二甲苯青FF的2.2倍，而與瓊脂糖濃度無關(guān)。以0.5×TBF作電泳液時，溴酚藍(lán)在瓊脂糖中的泳動速率約與長300bp的雙鏈線狀DNA相同，而二甲苯青FF的泳動則與長4kb的雙鏈線狀DNA相同。在瓊脂糖濃度為0.5%1.4%的范圍內(nèi)，這些對應(yīng)關(guān)系受凝膠濃度變化的影響并不顯著。選用哪一種加樣染料純屬個人喜惡。但是，對于堿性凝膠應(yīng)當(dāng)使用溴甲酚綠作為示蹤染料，因為在堿性pH條件下其顯色較溴酚更藍(lán)為鮮明。5各種pH值的Tris緩沖液的配制各種pH值的Tris緩沖液的配制所需pH值（25）0.1mol/L HCl的體積7145772447734347442075403763857736678

14、34579320802928.126.28.222.98.319.98.417.28.514.78.612.48.710.38.88.58.97.0某一特定pH值的0.05mol/L Tris緩沖液的配制：將50ml 0.1mol/L Tris堿溶液與上表所示相應(yīng)體積（單位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水將體積調(diào)至100ml（2）溫度對50mmol/L Tris·HCl液pH值的影響42537817572827673837774847875857976868077878178888279898380908481918582928683938784948885（6）常用緩沖液

15、的pKa值緩沖液分子量pKa值緩沖范圍Trisa12.18.087.17.9HEPESb283.37.477.28.2MPOSc209.37.156.67.8PIPESd304.36.766.27.3MESe195.26.095.46.8a：三羥甲基氨基甲烷；b：N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磷酸；c：3-（N-嗎啉代）丙磺酸；d：N，N-雙（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-嗎啉代）乙磺酸。7溫度對常用緩沖液pH的影響緩沖體系pKa(20)pKa/10Mes6.15-0.110Ada6.60-0.110PiPes6.80-0.085Aces6.90-0.200Bes7.15-0.160Mops

16、7.20-0.013Tes7.50-0.200Hepes7.55-0.014Tricine8.15-0.210Tris8.30-0.310Bicine8.35-0.180Glycylglycine8.40-0.280三、常用酶的配制1溶菌酶用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分裝成小份并保存于-20。每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。2蛋白水解酶類貯存液貯存溫度反應(yīng)濃度反應(yīng)緩沖液溫度預(yù)處理0.01mol/L Tris(pH7.8)鏈霉蛋白酶a20mg/ml-20（溶于水）1mg/ml0.01mol/L EDTA37自消化b0.5% SDS0.01mol/L Tris(pH7.8)蛋白酶Kc20mg

17、/ml-20（溶于水）50g/ml0.005mol/L EDTA3756無須預(yù)處理0.5% SDSa：鏈霉蛋白酶是從鏈球菌（Streptomyces griseus）中分離到的一種絲氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。b：自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，經(jīng)自消化的鏈酶蛋白酶的配制方法如下：把該酶的粉末溶解于10mmol./l Tris·HCl(pH7.5)、10mmol/l NaCl中，配成20mg/ml濃度，于37溫育1h。經(jīng)消化的鏈霉蛋白酶分裝成小份放在密封試管中，保存-20。c：蛋白酶K是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯氏白色念球菌（Tritirachium album L

18、imber）中純化得到。該酶有兩個Ca2+結(jié)合位點，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機理并無直接關(guān)系。然而，如果從該酶中除去Ca2+，由于出現(xiàn)遠(yuǎn)程的結(jié)構(gòu)變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染酸制品的蛋白質(zhì)。所以，蛋白酶K消化過程中通常加入EDTA（以抑制依賴于Mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化對蛋白酶K具有較強耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGT（pH8.0）至終濃度為2mmol/L,以鰲合Ca2+。3無DNA酶的RNA酶將胰RNA酶（RNA酶A）溶于10

19、mmol/l Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20。四、常用抗生素溶液抗生素貯存液a工作濃度濃度保存條件嚴(yán)緊型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒氨芐青霉素50mg/ml(溶于水)-2020g/ml60g/ml羧芐青霉素50mg/ml(溶于水)-2020g/ml60g/ml氯霉素34mg/ml(溶于乙醇)-2025g/ml170g/ml卡那霉素10mg/ml(溶于水)-2010g/ml50g/ml鏈霉素10mg/ml(溶于水)-2010g/ml50g/ml四環(huán)素b5mg/ml(溶于乙醇)-20

20、10g/ml50g/mla：以水為溶劑的抗生素貯存液通過0.22m濾器過濾除菌。以乙醇為溶劑的抗生素溶液無須除菌處理。所有抗生素溶液均應(yīng)放于不透光的容器保存。b：鎂離子是四環(huán)素的拮抗劑，四環(huán)素抗性菌的篩選應(yīng)使用不含鎂鹽的培養(yǎng)基（如LB培養(yǎng)基）。五、常用貯存液的配制130%丙烯酰胺溶液【配制方法】將29g丙烯酰胺和1g N，N-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中。加熱至37溶解之，補加水至終體積為100ml。用Nalgene濾器（0.45m孔徑）過濾除菌，查證該溶液的pH值應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存于室溫。【注意】丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰

21、胺和亞甲雙丙烯酰胺時應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因為它還可能會含有少量未聚合材料。一些價格較低的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺通常含有一些金屬離子，在丙烯酰胺貯存液中加入大約0.2體積的單床混合樹脂（MB-1Mallinckrodt），攪拌過夜，然后用Whatman 1號濾紙過濾以純化之。在貯存期間，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會緩慢轉(zhuǎn)化成丙烯酰和雙丙烯酸。240%丙烯酰胺【配制方法】把380g丙烯酰胺（DNA測序級）和20g N，N-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為600ml的蒸餾水中。繼續(xù)按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法處理，但加熱溶解后應(yīng)以蒸餾水補足至終體積為1L。【注意】見上述配制

22、30%丙烯酰胺的說明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列測定。3放線菌素D溶液【配制方法】把20mg放線菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀釋貯存液，用100%乙醇作空白對照讀取OD440值。放線菌素D（分子量為1255）純品在水溶液中的摩爾消化系數(shù)為21，900，故而1mg/ml的放線菌素D溶液在440nm處的吸光值為0.182，放線菌素D的貯存液應(yīng)放在包有箔片的試管中，保存于-20?！咀⒁狻糠啪€菌素D是致畸劑和致癌劑，配制該溶液時必須戴手套并在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，而不能在開放在實驗桌面上進(jìn)行，謹(jǐn)防吸入藥粉或讓其接觸到眼睛或皮膚。藥廠提供的作治療用途的放線菌素D制品常含有糖或鹽等添加劑。只

23、要通過測量貯存液在440nm波長處的光吸收確定放線菌素D的濃度，這類制品便可用于抑制自身引導(dǎo)作用。40.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液【配制方法】在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH調(diào)至pH值至7.0，用蒸餾水定容1ml，分裝成小份保存于-70510mol/L乙酸酰溶液【配制方法】把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后過濾除菌。610%過硫酸銨溶液【配制方法】把1g過硫酸銨溶解于終量為10ml的水溶液中，該溶液可在4保存數(shù)周。7BCIP溶液【配制方法】把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二鈉鹽（BCIP）溶解于10ml 100%的二甲基甲

24、酰胺中，保存于482×BES緩沖鹽溶液【配制方法】用總體積90ml的蒸餾水溶解1.07g鹽溶液BESN，N-雙（2-羥乙基）-2-氨基乙磺酸、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4，室溫下用HCl調(diào)節(jié)該溶液的pH值至6.96、然后加入蒸餾水定容至100ml，用0.22m濾器過濾除菌，分裝成小份，保存于-20。91mol/L CaCl2溶液【配制方法】在200ml蒸餾水中溶解54g CaCl2·6H2O，用0.22m濾器過濾除菌，分裝成10ml小份貯存于-20?！咀⒁狻恐苽涓惺軕B(tài)細(xì)胞時，取出一小份解凍并用蒸餾水稀釋至100ml，用Nalgene濾器（0.45m孔徑）

25、過濾除菌，然后驟冷至0。102.5mol/L CaCl2溶液【配制方法】在20ml蒸餾水中溶解13.5g CaCl2·6H2O，用0.22m濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20。111mol/L二硫蘇糖醇（DTT）溶液【配制方法】用20ml 0.01mol/L乙酸鈉溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，過濾除菌后分裝成1ml小份貯存于-20?！咀⒁狻緿TT或含有DTT的溶液不能進(jìn)行高壓處理。12脫氧核苷三磷酸（dNTP）溶液【配制方法】把每一種dNTP溶解于水至濃度各為100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/l Tris堿分別調(diào)節(jié)每一dNTP溶液的pH值7.

26、0（用pH試紙檢測），把中和后的每種dNTP溶液各取一份作適當(dāng)稀釋，在下表中給出的波長下讀取光密度計算出每種dNTP的實際濃度，然后用水稀釋成終濃度為50mmol/L的dNTP，分裝成小份貯存于-70。堿基波長（nm）消化系數(shù)（）L/（mol·cm）A2591.54×104G2531.37×104C2719.10×103T2607.40×103比色杯光徑為1cm時,吸光度=M130.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液【配制方法】在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na·2H2O），在磁力攪拌器上劇烈攪

27、拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0（約需20g NaOH顆粒）然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。【注意】EDTA二鈉鹽需加入NaOH將溶液的pH值調(diào)至接近8.0，才能完全溶解。14溴化乙錠（10mg/ml溶液）【配制方法】在100ml水中加入1g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。【注意】小心：溴化乙錠是強誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶液時務(wù)必戴上手套，稱量染料時要戴面罩。152×HEPES緩沖鹽溶液【配制方法】用總量為90ml的蒸餾水溶解1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2PO4

28、3;2H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/l NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.05，再用蒸餾水定容至100ml。用0.22m濾器過濾除菌，分裝成5ml小份，貯存于-20。16IPTG溶液【配制方法】IPTG為異丙基硫代-D-半乳糖苷（分子量為238.3），在8ml蒸餾水中溶解2g IPTG后，用蒸餾水定容至10ml，用0.22m濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20。171mol/L乙酸鎂溶液【配制方法】在800ml水中溶解214.46g四水乙酸鎂，用水定容至1L過濾除菌。181mol/L MgCl2溶液【配制方法】在800ml水中溶解203.4g MgCl2·6H2

29、O，用水定容至1L，分裝成小份并高壓滅菌備用。【注意】MgCl2極易潮解，應(yīng)選購小瓶（如100g）試劑，啟用新瓶后勿長期存放。19-巰基乙醇（BME）溶液【配制方法】一般得到的是14.4mol/L溶液，應(yīng)裝在棕色瓶中保存于4?！咀⒁狻緽ME或含有BME的溶液不能高壓處理。20NBT溶液【配制方法】把0.5g氯化氮藍(lán)四唑溶解于10ml 70%的二甲基甲酰胺中，保存于4。21酚/氯仿溶液【配制方法】把酚和氯仿等體積混合后用0.1mol/L Tris·HCl(pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋等體積的0.01mol/l Tris·HCl(pH7.6)液

30、層，保存于4?！咀⒁狻糠痈g性很強，并可引起嚴(yán)重灼傷，操作時應(yīng)戴手套及防護(hù)鏡，穿防護(hù)服。所有操作均應(yīng)在化學(xué)通風(fēng)櫥中進(jìn)行。與酚接觸過的部位皮膚應(yīng)用大量的水清洗，并用肥皂和水洗滌，忌用乙醇。2210mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液【配制方法】用異丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分裝成小份貯存于-20。如有必要可配成濃度高達(dá)17.4mg/ml的貯存液（100mmol/L）?！咀⒁狻縋MSF嚴(yán)重?fù)p害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)或通過皮膚吸收后有致命危險。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應(yīng)立即用大量水沖洗之。凡被PMSF污染的衣物應(yīng)予丟棄。PMSF在水溶液中不穩(wěn)定。

31、應(yīng)在使用前從貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)加于裂解緩沖液中。PMSF在水溶液中的活性喪失速率隨pH值的升高而加快，且25的失活速率高于4。pH值為8.0時，20mmol/l PMSF水溶液的半壽期大約為85min，這表明將PMSF溶液調(diào)節(jié)為堿性（pH>8.6）并在室溫放置數(shù)小時后，可安全地予以丟棄。23磷酸鹽緩沖溶液（PBS）溶液【配制方法】在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4加水定容至1L，在15lbf/in2(1034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min。保存于室溫。241mol/

32、L乙酸鉀（pH7.5）溶液【配制方法】將9.82g乙酸鉀溶解于90ml純水中，用2mol/L乙酸調(diào)節(jié)pH值至7.5后加入純水定容到1L，保存于-20。25乙酸鉀溶液（用于堿裂解）【配制方法】在60ml 5mol/L乙酸鉀溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成鉀濃度為3mol/L而乙酸根濃度為5mol/L的溶液。263mol/L乙酸鈉（pH5.2和pH7.0）溶液【配制方法】在80ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2或用稀乙酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，加水定容到1L，分裝后高壓滅菌。275mol/L NaCl溶液【配制方法】在800ml水中溶解292.2g NaC

33、l加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。2810%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液【配制方法】在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用?！咀⒁狻縎DS的微細(xì)晶粒易擴散，因此稱量時要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作區(qū)和天平上的SDS，10%SDS溶液無須滅菌。2920×SSC溶液【配制方法】在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10mol/l NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。3020×SSPE溶液【配制方法】在800ml水中溶解17.

34、5g NaCl、27.6g NaH2PO4·H2O和7.4g EDTA，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4（約需6.5ml 10ml/L NaOH），加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。31100%三氯乙酸溶液【配制方法】在裝有500g TCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100%（M/V）TCA。321mol/L Tris溶液【配制方法】在800ml水中溶解121.91g Tris堿，加入濃HCl調(diào)節(jié)pH值至所需值。pHHCl7.4 70ml7.6 60ml8.0 42ml應(yīng)使溶液冷至室溫后方可最后調(diào)定pH值，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌?！咀⒁狻咳?mol/L溶液呈現(xiàn)黃色，應(yīng)

35、予丟棄并置備質(zhì)量更好的Tris。盡管多種類型的電極均不能準(zhǔn)確測量Tris溶液的pH值，但仍可向大多數(shù)廠商購得合適的電極。Tris溶液的pH值因溫度而異，溫度每升高1，pH值大約降低0.03個單位。例如：0.05mol/L的溶液在5、25、和37時的pH值分別為9.5、8.9和8.6。33Tris緩沖鹽溶液（TBS）（25mmol/l Tris）【配制方法】在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl和3g Tris堿，加入0.015g酚并用HCl調(diào)至pH值至7.4，用蒸餾水定容至1L，分裝后在151bf/in2(1.034×105Pa)高壓下蒸汽滅菌20min，于室溫保存

36、。34X-gal溶液【配制方法】X-gal為5-溴-4-氯-3-吲哚-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的貯存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，并應(yīng)貯存于-20。X-gal溶液無須過濾除菌。雜交試驗中用于降低背景的封閉劑試劑用途Denhardt試劑Northern雜交使用RNA探針的雜交單拷貝序列的Southern雜交將DNA固定于尼龍膜上的雜交Denhardt試劑通常配制50×貯存液，過濾后保存于-20?？蓪⒃撡A存液10倍稀釋于預(yù)雜交液（常為含有0.5%SDS和100g/ml經(jīng)變性被打斷的鮭精DNA的

37、6×SSC或6×SSPE）中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖（Ficoll,400型，Pharmacia）、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（組分V”Sigmal），加水至終體積為500ml。BLOTTOGrunstein-Hogness雜交Benton-Davis雜交除單拷貝序列Southern雜交以外的所有Southern雜交斑點印跡1×BLOTT（牛乳轉(zhuǎn)移技術(shù)優(yōu)化液，Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer）,是含5%膠脂奶粉和0.02%疊氮鈉的水溶液，應(yīng)保存于4。使用前可用預(yù)雜交液稀釋25倍。

38、BLOTTO不應(yīng)與高濃度的SDS并用，因為后者會導(dǎo)致牛奶中蛋白質(zhì)析出。如果雜交背景不合要求，可在雜交液中加入NP-40至終濃度為1%。BLOTTO不能用作Northern雜交的封閉劑，因為這一封閉劑中可能含有RNA酶，其活性之高使人無法接受。注意：疊氮鈉有毒性，取用時需戴手套小心操作。含疊氮鈉的溶液應(yīng)予明確標(biāo)記。肝素Southern雜交原位雜交肝素（Sigma H-7005，從豬中提取的二級產(chǎn)品或相當(dāng)?shù)燃壍漠a(chǎn)品）用4×SSPE或4×SSC溶解配制成50mg/ml的濃度，保存于4。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的雜交液中用作封閉劑的濃度為500g/ml，在不含葡聚糖硫酸酯的雜交液中的

39、濃度為50g/ml。經(jīng)變性并被打斷的鮭精DNAsouthern和Northern雜交把鮭魚精子DNA（Sigma,鹽鈉）溶解于水配制成10mg/ml的濃度，必要時于室溫磁力攪拌24h助溶。把溶液中NaCl的濃度調(diào)至0.1mol/L，并用酚和酚/氯仿各抽提一次，回收水相。合DNA溶液快速通17號皮下注射針頭12次，以剪切DNA。加入2倍體積用冰預(yù)冷的乙醇沉淀DNA。離心回收DNA并重溶于水，配制成10mg/ml的濃度，測定溶液的OD260值并計算出精確的DNA濃度，然后煮沸10min，分裝成小份保存于-20。使用前置沸水浴中加熱5min，然后迅速在冰浴中驟冷。預(yù)雜交液中應(yīng)含有100g/ml經(jīng)變性

40、并被打斷的鮭魚精子DNA六、常用凝膠的技術(shù)參數(shù)1葡聚糖凝膠的某些技術(shù)數(shù)據(jù)種類干顆粒直徑（）分子量分級范圍床體積毫升/克干分子篩得水值溶脹最少平衡時間（h）柱頭壓力（kPa）(2.5cm直徑柱)肽及球形蛋白質(zhì)葡聚糖（線性分子）室溫沸水浴Sephadex G-1040 1207007002 31.0±0.131Sephadex G-1040 120150015002.53.51.5±3.531Sephadex G-25粗級100300 (5100目)中級50150 (100200目)1,0005,0001005,000461.5±0.262細(xì)級20800(200400

41、目)超細(xì)1040Sephadex G-50粗級100200中級501501,500500細(xì)級208030,00010,0009115.0±0.362超細(xì)1040Sephadex G-75401203,0001,000超細(xì)104070,000950,00012157.5±0.52433.9215.86Sephadex G-100401204,0001,000超細(xì)10401,500,000150,000152010.0±1.04852.359.41Sephadex G-150401205,0001,0002030超細(xì)1040400,000150,000182215.0

42、±1.57250.883.53Sephadex G-200401205000100030401040800,000200,000202520.0±2.07250.391.572.聚丙烯酰胺凝膠的技術(shù)數(shù)據(jù)型號排阻的下限(分子量)分級分離范圍(分子量)膨脹后的床體積(ml/g干凝膠)膨脹所需最少時間(室溫,h)Bio-gel-P-21,6002002,0003.824Bio-gel-P-43,6005004,0005.824Bio-gel-P-64,6001,0005,0008.824Bio-gel-P-1010,0005,00017,00012.424Bio-gel-P-30

43、30,00020,00050,00014.91012Bio-gel-P-6060,00030,00070,00019.01012Bio-gel-P-100100,00040,000100,00019.024Bio-gel-P-150150,00050,000150,00024.024Bio-gel-P-200200,00080,000200,00034.048Bio-gel-P-300300,000100400,00040.0483瓊脂糖凝膠的技術(shù)數(shù)據(jù)型號瓊脂糖含量%（W/W）排阻的下限（分子量）分級分離的范圍（分子量）生產(chǎn)廠家Sepharose 4B40.3×1063×1

44、06PharmaciaSepharose 2B22×10625×106Sagavac 10102.5×1051×1042.5×105SeravacSagavac 887×1052.5×1047×105Sagavac 662×1065×1042×106Sagavac 4415×1062×10515×106Sagavac 22150×1065×10515×107Bio-gel A-0.5M100.5×106<1&#

45、215;1040.5×106Bio-RadBio-gel A-1.5M81.5×106<1×1041.5×106Bio-gel A-5M65×1061×1045×106Bio-gel A-15M415×1064×10415×106Bio-gel A-50M250×1061×10550×106Bio-gel A-150M1150×1061×106150×1064各處凝膠所允許的最大操作壓凝膠最大靜水壓（kPa）SephadexG-1

46、09.8G-159.8G-259.8G-509.8G-754.95瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍凝膠濃度（%）線性DNA長度（bp）0.51000300000.7800120001.0500100001.240070001.520030002.05020006染料在變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度凝膠濃度（%）溴酚藍(lán)二甲苯青FF5035bp140bp6026bp106bp8019bp75bp10012bp55bp2008bp28bp7染料在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度凝膠濃度（%）溴酚藍(lán)二甲苯青FF3.5100bp460bp5.065bp260bp8.045bp160bp12.020bp70bp15.015bp50bp20.012bp45bp七、氨基酸的特性氨基酸名稱三字母縮寫單字母縮寫質(zhì)量側(cè)鏈電離的pHa值結(jié)構(gòu)式 丙氨酸（alanine）AlaA89.09精氨酸（arginine）ArgR174.212.48天冬酰氨（asparagine）AsnN132.1天冬氨酸（aspartic acid）AspD133.13.86半胱氨酸（systeine）CysC121.12谷