分子生物學(xué)課程論文精

1、PCR技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用的研究進(jìn)展王亞純09120103摘要：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreactionPCR是最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一，通過變性、退火和延伸的循環(huán)來完成核酸分子的大量擴(kuò)增.定量PCR技術(shù)是克服了原有的PCR技術(shù)存在的不足，能準(zhǔn)確敏感地測定模板濃度及檢測基因變異等，快速PCR技術(shù)快速PCR在保證PCR反應(yīng)特異性、靈敏性和保真度的前提下，在更短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)核酸分子的擴(kuò)增.mRNA差異顯示PCR技術(shù)是在基因轉(zhuǎn)錄水平上研究差異表達(dá)和性狀差異的有效方法之一.近年來已經(jīng)開展了許多這三方面的研究工作，本文就定量PCR技術(shù)、快速PCR技術(shù)、mRNA差異顯示PCR技術(shù)作一綜述

2、，以便更好地理解及應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)。關(guān)鍵字：定量PCR;熒光PCR;快速PCR;DNA聚合酶；mRNA差異顯示PCR0前言聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreactionPCR技術(shù)由于PCR簡便易行、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。但是，由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)不能準(zhǔn)確定量，且操作過程中易污染而使得假陽性率高等缺點(diǎn)，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制1。鑒于此，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量便成為迫切的需要。幾經(jīng)探索，先后出現(xiàn)了多種定量PCR(quantitativePCR,Q-PCR方法，其中結(jié)果較為可靠的是競爭性PCR和熒光定量PCR(fluorescencequantitativePC

3、RFQ-PCR。隨著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)檢測的不斷發(fā)展，人們?cè)絹碓较Ｍ诒ＷCPCR反應(yīng)特異性、靈敏性、保真度的同時(shí)，能夠盡量縮短反應(yīng)的時(shí)間，即實(shí)現(xiàn)快速PCR(RapidPCRorFastPCR快速PCR技術(shù)不僅可使樣品在有限的時(shí)間內(nèi)可以盡快得到擴(kuò)增，而且可以顯著增加可檢測的樣品數(shù)量，顯然，在大批量樣本檢測和傳染病快速診斷等方面將會(huì)有重要的應(yīng)用前景。例如，快速PCR在臨床檢測中可大大加快疾病的診斷效率；在生物恐怖襲擊時(shí)能有效幫助快速鑒定可疑物中有害生物的存在與否；同時(shí)，由于PCR已經(jīng)滲入到現(xiàn)代生物學(xué)研究的各個(gè)方面，快速PCR的實(shí)現(xiàn)必然可以使許多科學(xué)研究工作的進(jìn)展顯著加快，最終影響到整個(gè)生物學(xué)發(fā)展的速度

4、。近年來，快速PCR技術(shù)得到了可喜的進(jìn)展。從聚合酶的改進(jìn)、添加劑的開發(fā)以及熱循環(huán)儀的革新創(chuàng)造三個(gè)不同途徑上分別進(jìn)行的研發(fā)表明。生物的性狀和生物對(duì)各種生物、理化及致病因子的應(yīng)答，本質(zhì)上都是基因在時(shí)間上或空間上選擇性表達(dá)，即基因的差異表達(dá)的結(jié)果，因而，獲取差異表達(dá)的基因信息，將有助于了解生物的生理變化和病理改變的分子機(jī)制20研究基因差異表達(dá)主要技術(shù)有：消減文庫篩選、差異雜交、代表性差異分析、基因表達(dá)序列分析、電子消減技術(shù)3和mRNA差異顯示PCR技術(shù)等（mRNADifferentialDisplayPCR,簡稱DD-PCR4。迄今為止，上面的幾種方法已成功地用于基因差異表達(dá)的研究。尤其是mRNA差

5、異顯示PCR技術(shù)，雖然發(fā)明只有短短十幾年，已經(jīng)取得了令人矚目的科研成果，原因是它具備需要總RNA的量極少，不需要純化的mRNA,操作簡便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)5-8,故已被許多生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室作為一種重要工具，應(yīng)用于體內(nèi)和體外差異表達(dá)基因的篩選，研究基因功能9?，F(xiàn)將定量PCR技術(shù)、快速PCR技術(shù)、mRNA差異顯示PCR技術(shù)研究情況作一綜述作簡要綜述。1定量PCR技術(shù)定量PCR（PolymeraseChainReaction技術(shù)有廣義概念和狹義概念。廣義概念的定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進(jìn)行PCR起始模板量的定量。狹義概念的定量PCR技術(shù)（嚴(yán)格意義

6、的定量PCR技術(shù)）是指用外標(biāo)法（熒光雜交探針保證特異性）通過監(jiān)測PCR過程（監(jiān)測擴(kuò)增效率）達(dá)到精確定量起始模板數(shù)的目的，同時(shí)以內(nèi)對(duì)照有效排除假陰性結(jié)果（擴(kuò)增效率為零。廣義概念下的定量PCR技術(shù)可以分為五種類型：（1）外參法+終產(chǎn)物分析，是指樣本與陽性參照在兩個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型沒有對(duì)樣本進(jìn)行質(zhì)控監(jiān)測，易出現(xiàn)假陰假陽結(jié)果，沒有監(jiān)測擴(kuò)增效率，定量不準(zhǔn)。(2)內(nèi)參法+終產(chǎn)物分析，是指樣本與陽性參照在一個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型對(duì)樣本進(jìn)行質(zhì)控監(jiān)測，排除假陰結(jié)果，但是定量不準(zhǔn)。(3)外標(biāo)法+過程監(jiān)測，這種類型監(jiān)測擴(kuò)增效率，陽性樣本定量準(zhǔn)，但是無法排除假陰結(jié)果。(4)內(nèi)參法+過程監(jiān)測，由于樣本與陽性

7、參照在一個(gè)容器內(nèi)反應(yīng)，用同樣的Taq酶和反應(yīng)參與物，存在競爭性抑制，起始模板量濃度高的反應(yīng)會(huì)抑制起始模板量濃度低的反應(yīng)，所以定量不準(zhǔn)。(5)外標(biāo)法+過程監(jiān)測+內(nèi)對(duì)照，這種類型監(jiān)測擴(kuò)增效率，陽性樣本定量準(zhǔn)，同時(shí)排除假陰結(jié)果。這種類型是應(yīng)該提倡的。1.1 競爭性PCR技術(shù)定量PCR技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)PCR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和補(bǔ)充，在定量過程中需借助各種形式的參照物。參照物是一種已知含量的標(biāo)準(zhǔn)模板，按其是否與待測樣品在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增而分為內(nèi)參照和外參照。鑒于PCR擴(kuò)增過程中管與管之間的擴(kuò)增效率存在差異，理想的定量PCR應(yīng)該使用內(nèi)參照。競爭性PCR即是采用內(nèi)參照的一種定量PCR方法，通過消除管問及樣品間的

8、變異，從而達(dá)到較為精確的基因定量10。該方法是將待測基因與已知濃度的內(nèi)參照模板在同一反應(yīng)管中共同擴(kuò)增，由于二者具有相同引物的結(jié)合位點(diǎn)并采用同一引物進(jìn)行擴(kuò)增，因此二者競爭引物、脫氧核甘酸以及DNA聚合酶，以致當(dāng)一種模板量逐漸增加時(shí)，另一種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物就會(huì)逐漸減少。兩模板的擴(kuò)增產(chǎn)物量可分別用以下公式表示：Y待測=X待測(1+En；Y內(nèi)參照=X內(nèi)參照(1+En,其中X待測為起始拷貝量；Y待測為擴(kuò)增產(chǎn)物量。由于在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增，兩模板的循環(huán)次數(shù)n保持一致，如果使兩者間的擴(kuò)增效率E也相同，就存在如下關(guān)系：Y待測/Y內(nèi)參照=X待測/X內(nèi)參照。當(dāng)兩模板的產(chǎn)物量相同時(shí)，則兩模板的反應(yīng)起始拷貝數(shù)相等，由此

9、可對(duì)待測模板進(jìn)行精確定量。具體檢測方法是將已知濃度的內(nèi)參照模板倍比稀釋后分別與恒定量的待測基因一起擴(kuò)增，以參照模板的起始拷貝數(shù)為橫軸，以兩模板擴(kuò)增產(chǎn)物量的比率為縱軸，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為1的點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的參照模板的起始拷貝數(shù)即為待測基因的拷貝數(shù)。由上述定量原理可知，保持兩模板擴(kuò)增效率E的一致性是定量的關(guān)鍵，為此要求參照模板應(yīng)與待測基因具有相似的大小及序列，相同的引物結(jié)合位點(diǎn)。止匕外，參照模板還應(yīng)在擴(kuò)增后易于分離檢測。因此，對(duì)于競爭性PCR的研究重點(diǎn)主要集中在建立高效、穩(wěn)定、可靠的模板方面，現(xiàn)已取得了較滿意的結(jié)果11-13。1. 2熒光定量PCR技術(shù)熒光定量PCR（RQ-PCR技術(shù)）是通過在PCR

10、反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。Ct值（cyclethreshold,Ct,即PCR擴(kuò)增過程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，它與模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，模板DNA量越多，熒光達(dá)閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。1.1.1 Taqman技術(shù)Taqman技術(shù)由美國PE公司開發(fā)，現(xiàn)已廣泛用于基因檢測。該技術(shù)的原理是利用Taq酶的5'-

11、3'外切酶活性，在傳統(tǒng)PCR技術(shù)一對(duì)特異性引物的基礎(chǔ)上增加了一條熒光雙標(biāo)記探針。該探針可與上、下游引物之間的DNA模板序列特異性結(jié)合。探針的5'端標(biāo)以熒光報(bào)告基團(tuán)，如FAM（62竣基熒光素；3'端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)，如TAMRA（62竣基四甲基諾丹明。當(dāng)探針保持完整時(shí)，兩個(gè)基團(tuán)的空間距離非常接近，構(gòu)成熒光能量傳遞（FRET關(guān)系，5'端熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被3'端淬滅基團(tuán)吸收，使其不能被儀器檢測。當(dāng)兩個(gè)基團(tuán)發(fā)生分離后，兩者間的FRET關(guān)系被破壞，淬滅基團(tuán)的抑制作用解除，報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)便得到釋放。在PCR退火復(fù)性期，探針與DNA模板特異性結(jié)合。在PC

12、R延伸階段，Taq酶在引物的引導(dǎo)下，以四種脫氧核甘酸為底物，按堿基配對(duì)原則沿著模板合成新鏈，當(dāng)移動(dòng)至探針結(jié)合的位置時(shí)便發(fā)揮其5'-3'外切酶活性將探針降解成單核甘酸，使得熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，前者的熒光信號(hào)釋放并被檢測。由此可見，每合成一條新鏈就有一個(gè)探針被裂解并釋放出一個(gè)熒光信號(hào)。根據(jù)這種關(guān)系，通過檢測PCR反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度，再經(jīng)校正計(jì)算后即可得出初始模板的數(shù)量。Taqman技術(shù)現(xiàn)主要用于病毒的定量分析，病原體的分型鑒定，基因的快速診斷分析14-16o1.1.2 AmpliSensor技術(shù)該技術(shù)與TaqmanPCR的區(qū)別在于其采用的是復(fù)合探針。一個(gè)探針上標(biāo)以熒光報(bào)告基

13、團(tuán)，另一個(gè)探針上標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)，后者的5'端較前者多出7個(gè)堿基(GCGTCCC。兩探針之間能因堿基互補(bǔ)而結(jié)合，此時(shí)兩基團(tuán)靠近而形成FRET結(jié)構(gòu)，報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收。當(dāng)兩探針分開后，其間的FRET關(guān)系受到破壞，淬滅基團(tuán)的抑制作用解除，報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)得到釋放。在PCR擴(kuò)增前需將該復(fù)合探針與一個(gè)半套式PCR引物連接，該引物的5'端應(yīng)具有一段與長探針上多出的7個(gè)堿基互補(bǔ)的序列，以便DNA連接酶能將該引物與短探針連接。擴(kuò)增時(shí)該探針2引物復(fù)合物作為半套式引物摻入到模板，并釋放出淬滅探針，使原有的FRET結(jié)構(gòu)破壞，從而釋放出報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)，其強(qiáng)度與被擴(kuò)增的模板數(shù)相對(duì)應(yīng)

14、。MateraG等17用AmpliSensor技術(shù)對(duì)丙型肝炎病毒(hepatitisCvirusHCV的基因型進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)此方法具有很高的特異性，能準(zhǔn)確檢測待測標(biāo)本中DNA的基因型和含量。1.1.3 Lightcycler技術(shù)Lightcycler技術(shù)是Roche公司新近開發(fā)的一種PCR定量技術(shù)。該技術(shù)的特點(diǎn)18,19也是將熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別標(biāo)記在兩個(gè)不同的探針上，形成熒光探針和淬滅探針。熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)于探針的5'端，熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)于探針的3'端，兩探針能分別與模板同一條鏈中相鄰的核甘酸序列進(jìn)行雜交。當(dāng)探針游離時(shí)能檢測到報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)；如果反應(yīng)體系中存在特異性模板

15、，PCR復(fù)性階段兩探針即會(huì)與之雜交，此時(shí)兩探針上的熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相距很近，形成FRET關(guān)系，前者的熒光信號(hào)被后者吸收，即發(fā)生熒光淬滅。由于熒光淬滅的程度與被擴(kuò)增的模板量相對(duì)應(yīng)，因此可達(dá)到定量的目的。KearnsAM等20,21報(bào)道，Light-cycler技術(shù)在對(duì)病毒DNA的快速分型和定量方面有特殊的優(yōu)勢。1.1.4 Molecularbeacon技術(shù)亦稱分子信標(biāo)技術(shù)是一種單鏈DNA形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在其一端有一報(bào)告基團(tuán)，在另一端有一淬滅基團(tuán)，當(dāng)它形成發(fā)火結(jié)構(gòu)時(shí)，由于熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)想互靠近，兩者之間發(fā)生熒光信號(hào)能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescentresonanceenergytr

16、ansferFRET,當(dāng)熱循環(huán)溫度達(dá)到分子beacon的解鏈溫度時(shí)，其構(gòu)象改變，與模板結(jié)合而完全伸展成線性分子，使得FRET消失，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光信號(hào)。2快速PCR技術(shù)隨著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)檢測的不斷發(fā)展，人們?cè)絹碓较Ｍ诒ＷCPCR反應(yīng)特異性、靈敏性、保真度的同時(shí)，能夠盡量縮短反應(yīng)的時(shí)間，即實(shí)現(xiàn)快速PCR(RapidPCRorFastPCR快速PCR技術(shù)不僅可使樣品在有限的時(shí)間內(nèi)可以盡快得到擴(kuò)增，而且可以顯著增加可檢測的樣品數(shù)量，顯然，在大批量樣本檢測和傳染病快速診斷等方面將會(huì)有重要的應(yīng)用前景。例如，快速PCR在臨床檢測中可大大加快疾病的診斷效率；在生物恐怖襲擊時(shí)能有效幫助快速鑒定可疑物中有害生物

17、的存在與否；同時(shí)，由于PCR已經(jīng)滲入到現(xiàn)代生物學(xué)研究的各個(gè)方面，快速PCR的實(shí)現(xiàn)必然可以使許多科學(xué)研究工作的進(jìn)展顯著加快，最終影響到整個(gè)生物學(xué)發(fā)展的速度。近年來，快速PCR技術(shù)得到了可喜的進(jìn)展。從聚合酶的改進(jìn)、添加劑的開發(fā)以及熱循環(huán)儀的革新創(chuàng)造三個(gè)不同途徑上分別進(jìn)行的研發(fā)表明，快速PCR技術(shù)不僅對(duì)普通擴(kuò)增，且對(duì)實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增都具有可實(shí)現(xiàn)性，并已有相關(guān)的部分試劑或儀器在市場上推出。從研發(fā)角度，目前技術(shù)的發(fā)展重點(diǎn)主要集中在熱聚合酶融合蛋白及芯片式PCR儀的研制兩個(gè)方面。2. 1快速PCR的實(shí)現(xiàn)途徑快速PCR技術(shù)原理仍建立在常規(guī)PCR原理的基礎(chǔ)上。常規(guī)的PCR反應(yīng)過程通常是三大階段的循環(huán)，即變性階段、

18、退火階段和延伸階段(在某些情況下，退火階段和延伸階段可以合并，反應(yīng)時(shí)間是以上三個(gè)階段的總時(shí)間加上各階段間溫度變化的時(shí)間。要實(shí)現(xiàn)快速PCR,其根本問題就是要縮短這三大階段的持續(xù)時(shí)間或溫度變化的時(shí)間。在PCR中，變性階段的目的將雙鏈DNA在高溫下變性為單鏈DNA,所用時(shí)間取決于聚合酶的耐受溫度，常用的聚合酶耐受95C,若提高聚合酶的耐受溫度，則變性階段的時(shí)間可以縮短；退火階段的目的是使單鏈DNA相互間正確配對(duì)形成雙鏈DNA,主要取決于模板的復(fù)雜程度以及引物和模板之間的結(jié)合能力，要縮短這一階段的持續(xù)時(shí)間可以通過加入一些穩(wěn)定單鏈DNA形成或促進(jìn)雙鏈DNA形成的添加劑來實(shí)現(xiàn)。而延伸階段的持續(xù)時(shí)間主要取決

19、于DNA聚合酶的延伸速率，可以通過發(fā)現(xiàn)新的高效DNA聚合酶、對(duì)現(xiàn)有DNA聚合酶的改進(jìn)以及加入能增強(qiáng)酶活性的輔助因子等來獲得更高的延伸速率，從而縮短延伸過程的時(shí)間。至于各階段間溫度變化的時(shí)間則主要取決于熱循環(huán)儀的工作效率，可以通過選擇傳熱性能更優(yōu)良的材料、改進(jìn)熱循環(huán)儀的工作原理或采用微小體積反應(yīng)等方式使PCR儀的傳熱效率提高，進(jìn)而大大縮短溫度變化所占用的時(shí)間，最終使整個(gè)反應(yīng)的速率得到提圖。3. 2用于實(shí)現(xiàn)快速PCR的DNA聚合酶在PCR循環(huán)中，延伸階段的持續(xù)時(shí)間主要取決于DNA聚合酶的延伸速率，提高聚合酶的延伸活性和延伸速率無疑會(huì)縮短整個(gè)PCR反應(yīng)所需的時(shí)間。由于PCR反應(yīng)常用的Taq、Pfu等

20、DNA聚合酶在其天然的生物體中主要用于DNA損傷的修復(fù)以及重組等，因此它們的延伸活性和延伸速率比較低22o為了獲得具有高延伸活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，研究者通過基因工程的手段將DNA聚合酶與能和DNA鏈相互作用的蛋白質(zhì)功能域以融合蛋白的形式相結(jié)合，或直接利用定點(diǎn)突變的方法篩選出具有高延伸活性的DNA聚合酶。Wang等22通過將蛋白Sso7d與DNA聚合酶融合得到了具有快速延伸能力的DNA聚合酶。Sso7d是從Sulfolobussolfataricus中分離到的一種雙鏈DNA結(jié)合蛋白23。它大量存在于嗜熱古細(xì)菌中，被認(rèn)為在穩(wěn)定基因組DNA中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，將Sso7d與A家族或B家

21、族的DNA聚合酶以融合蛋白的形式連接在一起后，由于Sso7d對(duì)雙鏈DNA具有一定的親和力，可以識(shí)別退火后的雙鏈，從而使聚合酶快速找到延伸起始點(diǎn)，有效地增強(qiáng)了原DNA聚合酶的延伸速度。例如，與Ss07d融合的PfuDNA聚合酶可以在2min內(nèi)延伸10k的DNA片段，而一般的PfuDNA聚合酶相同時(shí)間下即使提高酶的用量也只能合成2k的DNA片段。同時(shí)，融合后DNA聚合酶與雙鏈DNA的作用是較弱的，這就避免了強(qiáng)相互作用所導(dǎo)致的阻礙DNA聚合酶在DNA鏈上移動(dòng)的不利結(jié)果。此外還發(fā)現(xiàn)Sso7d可以增加聚合酶對(duì)體系中高鹽濃度的耐受性，可便于對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化。與Ss07d相類似，在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶V中

22、發(fā)現(xiàn)的螺旋O發(fā)夾O螺旋結(jié)構(gòu)蛋白也是一種DNA非特異性結(jié)合蛋白24。它在中性pH的條件下部分帶正電，因此可以與帶負(fù)電的DNA磷酸骨架相互作用。Pavlov等25將它與PfuDNA聚合酶相融合后發(fā)現(xiàn)可以增加DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性、提高酶對(duì)高鹽濃度的耐受性，并增加酶的延伸活性。目前，商品化的快速PCR聚合酶主要是Takara公司的Taq聚合酶，該酶除了延伸速率提高之外，還可耐受更高的變性溫度，推薦98c變性1s,因此變性階段的時(shí)間也縮短了不少。Machida等26在大批量樣本的擴(kuò)增中評(píng)價(jià)了快速Taq聚合酶，擴(kuò)增產(chǎn)物正常，但未與其它常規(guī)用Taq酶比較。在Qiu等27的工作中，評(píng)價(jià)了TaqDNA聚合酶、

23、LAOTaqDNA聚合酶與AmpliTaqDNA聚合酶對(duì)PCR產(chǎn)物中嵌合體（chimeras,突變（mutiation和異源雙鏈（heteroduplex的產(chǎn)生的影響。在其試驗(yàn)體系中ZOTaq具有最高的反應(yīng)速率，但形成PCR假象（artifact的總幾率較高，達(dá)20%;LAOTaq具有最高的保真度，反應(yīng)速率居中，形成PCR假象的總幾率為15%;AmpliTaq形成PCR假象的幾率為7%。ZOTaq（8.7%與LAOTaq（6.2%比AmpliTaq（2.5%容易形成嵌合體。ZOTaq形成嵌合體和異源雙鏈的頻率比AmpliTaq高幾乎三倍。該工作提示利用ZOTaq酶快速擴(kuò)增的同時(shí)部分程度上犧牲了

24、保真度。3mRNA差異顯示PCR技術(shù)4. 1mRNA差異顯示PCR技術(shù)的主要原理在生命過程的某一時(shí)期，生物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的基因只有很少一部分，而且在不同的發(fā)育階段、不同的生理狀態(tài)和不同類型細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)也不盡相同，因此，研究mRNA的差異，相對(duì)于研究DNA差異，排除了內(nèi)含子的影響，使研究更接近于生命活動(dòng)的實(shí)質(zhì)。mRNA差異顯示PCR技術(shù)是根據(jù)真核生物細(xì)胞中絕大多數(shù)mRNA均帶有3'polyA1的結(jié)才特點(diǎn)(除極少部分mRNA,如組蛋白mRNA外。以此為依據(jù)，設(shè)計(jì)3端引物Oligo-dTnM(M分別代表A、C、G,這3種引物，稱之為錨錠引物28-29。利用錨定引物將不同來源的細(xì)胞或不

25、同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并用此引物和5'端的隨機(jī)引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，隨后進(jìn)行熒光染色或硝酸銀染色或放射自顯影，通過比較找出差異表達(dá)的cDNA條帶30。從凝膠上切割下這些差異性條帶，用相同的引物和條件進(jìn)行PCR再擴(kuò)增，克隆所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行核甘酸序列分析，將分析結(jié)果與基因序列數(shù)據(jù)庫中的序列作同源比較，就可知分離的是已知基因序列，還是未知基因序列；同時(shí)分析結(jié)果可以用作探針從cDNA文庫或基因組DNA文庫中篩選到全長的cDNA序列或基因組克隆。3.2差異顯示PCR技術(shù)應(yīng)用中的優(yōu)點(diǎn)3.2.1極少的總RNA的需要量差異顯示PCR技術(shù)總RN

26、A需要量極少，一次試驗(yàn)僅需要0.20.02p,g在這一點(diǎn)上，是其他的差異表達(dá)研究方法無法比擬的，這種方法使得尤其對(duì)材料來源困難的生物體的差異表達(dá)的研究得以實(shí)現(xiàn)5o同時(shí)用純化的總RNA和純化的mRNA做模板都可以獲得相同差異表達(dá)結(jié)果，因?yàn)殄^定引物Oligo-dTnM能特異性結(jié)合于mRNA的poly(A尾部，而轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA的存在不影響差異顯示PCR的結(jié)果31。3.2.2敏感度高其他研究差異表達(dá)的方法適用于高轉(zhuǎn)錄水平的mRNA的差異比較，而低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA的差異比較卻顯得無能為力。差異顯示PCR技術(shù)對(duì)于篩選低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA的結(jié)果得到很大改善，使低轉(zhuǎn)錄水平mRNA進(jìn)行差異顯示PCR

27、的可能性大大提高32-33。3.2.1操作簡單快捷差異顯示PCR技術(shù)操作簡單快捷，從RNA的純化，差異顯示PCR、差異電泳、差異帶分離純化，差異鑒定、陽性結(jié)果的序列分析，整個(gè)可以在23周完成，這是其他方法無法比擬的6。3.3差異顯示PCR技術(shù)應(yīng)用中的不足雖然差異顯示PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于差異表達(dá)基因的研究，并且仍在不斷地優(yōu)化和改進(jìn)，但是，差異顯示PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些問題31,34-35。3.3.1假陽性高差異顯示PCR技術(shù)假陽性差異帶過高，差異顯示PCR時(shí)的差異帶往往不能在Northern雜交和反向Northern雜交中重現(xiàn)。差異條帶經(jīng)回收后，必須再次擴(kuò)增才能用于Northern雜

28、交、克隆及序列分析等，有時(shí)2次PCR反應(yīng)經(jīng)常擴(kuò)增出多條帶，影響隨后的雜交鑒定3403.3.2獲得的片段短mRNA的平均長度1.2kb,差異顯示PCR所彳#cDNA片段的長度多在100400bp之間，平均長度約300bp，這些片段大多數(shù)位于mRNA3端300bp左右的非翻譯區(qū)，這段mRNA在不同生物間差別較大，基因文庫中常不包括這部分。差異顯示PCR的cDNA并不是都能找到與之同源的序列。另外，由于同一生物3端的非翻譯區(qū)較為相似，對(duì)cDNA進(jìn)行測序之后并不能預(yù)測其功能和作進(jìn)一步的分析。為了得到翻譯區(qū)的序列，常用的方法是篩選cDNA文庫或者應(yīng)用RACE方法獲取全基因，但篩選cDNA文庫非常耗時(shí)，并

29、且同一物種，不同的基因3端的非翻譯區(qū)非常相似，篩庫工作很可能是徒勞的35o3.3.3稀有mRNA差異顯示困難PCR高度靈敏，易擴(kuò)增展示稀有mRNA片段，這既是該方法的優(yōu)點(diǎn)，也是該方法的不足之處，因?yàn)橄∮械膍RNA在雜交時(shí)顯示不出表達(dá)信號(hào)。因此，該方法傾向于分離高拷貝數(shù)的cDNA序列，如何提高分離稀有mRNA效率有待進(jìn)一步的研究31。3小結(jié)與展望基因分析的定量化是對(duì)基因診斷的要求和未來發(fā)展的趨勢。總的來說，定量PCR技術(shù)的研究方興未艾，還有諸多問題有待解決，如競爭性PCR中競爭性模板制備較難，且與待6測模板的擴(kuò)增效率也難以達(dá)到完全相同；Taqman技術(shù)中Taq酶的外切酶活性能影響定量；Ampli

30、Sensor技術(shù)仍無法區(qū)分引物二聚體形成的非特異擴(kuò)增信號(hào)，且每次PCR反應(yīng)前需進(jìn)行AmpliSensor標(biāo)記，增加了操作步驟及成本；分子信標(biāo)技術(shù)所用探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定性還不理想；以及Lightcycler技術(shù)因兩個(gè)探針均與模板結(jié)合而影響了擴(kuò)增效率等；止匕外，熒光定量PCR技術(shù)均存在探針標(biāo)記的成本較高，不便普及的問題，分析靈敏度仍需不斷提高。以上表明對(duì)定量PCR技術(shù)的研究還需不斷深入。相信在不久的將來，會(huì)有結(jié)果更精確、成本更低的定量PCR技術(shù)出現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)研究及臨床診斷上得到廣泛的應(yīng)用。PCR技術(shù)總體來講已經(jīng)成為一個(gè)較為成熟的技術(shù)，但隨著研究和應(yīng)用領(lǐng)域不斷增長的新需求，PCR仍存在相當(dāng)巨大的改進(jìn)

31、空間。這其中，快速PCR技術(shù)的探索無疑是一項(xiàng)重要的拓展工作。如上所述，通過提高酶的活性、加入適合的添加劑以及對(duì)熱循環(huán)儀中使用的溫度改變方式進(jìn)行改進(jìn)，已經(jīng)從不同程度上實(shí)現(xiàn)了快速PCRo如果能將三者的優(yōu)勢有機(jī)地結(jié)合起來，則擴(kuò)增速度有望進(jìn)一步提高我們認(rèn)為，針對(duì)該技術(shù)的面向普及應(yīng)用的評(píng)價(jià)仍需深入，在實(shí)際使用過程中也不能單純盲目地求快，而應(yīng)當(dāng)根據(jù)研究對(duì)象的不同，在保證PCR反應(yīng)的特異性、靈敏性以及高產(chǎn)量的情況下實(shí)現(xiàn)快速PCR。從目前的研究結(jié)果看，各種快速PCR試劑(包括酶，添加劑在PCR反應(yīng)的特異性、靈敏度、產(chǎn)量方面的系統(tǒng)評(píng)價(jià)顯然不夠，應(yīng)該引起研究者的重視。隨著更多新方法的發(fā)明，隨著各學(xué)科間交叉合作的深

32、入，快速PCR技術(shù)會(huì)進(jìn)一步完善和系統(tǒng)化，給所有生物學(xué)工作者帶來新的驚喜。mRNA差異顯示PCR是一種比較靈活、全面的檢測細(xì)胞和組織差異表達(dá)基因的方法，該方法具有其他許多方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，但是也存在一些問題，近年來的科學(xué)研究針對(duì)一些問題已經(jīng)做了改進(jìn)，人們相信，隨著時(shí)間的推移，該方法必然在促進(jìn)差異基因的研究中作出更大貢獻(xiàn)。參考文獻(xiàn)：1ChungHW.ReversetranscriptasePCR(RT-PCRandquantitative-competitivePCR(QC-PCR.ExpMolMed,2001,33(1Suppl:85-97.2李玉京，李子銀，李振聲.真核生物mRNA差顯技術(shù)(

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