分子生物學(xué)課程論文精

1、PCR技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用的研究進展王亞純09120103摘要：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreactionPCR是最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一，通過變性、退火和延伸的循環(huán)來完成核酸分子的大量擴增.定量PCR技術(shù)是克服了原有的PCR技術(shù)存在的不足，能準(zhǔn)確敏感地測定模板濃度及檢測基因變異等，快速PCR技術(shù)快速PCR在保證PCR反應(yīng)特異性、靈敏性和保真度的前提下，在更短時間內(nèi)完成對核酸分子的擴增.mRNA差異顯示PCR技術(shù)是在基因轉(zhuǎn)錄水平上研究差異表達和性狀差異的有效方法之一.近年來已經(jīng)開展了許多這三方面的研究工作，本文就定量PCR技術(shù)、快速PCR技術(shù)、mRNA差異顯示PCR技術(shù)作一綜述

2、，以便更好地理解及應(yīng)用這項技術(shù)。關(guān)鍵字：定量PCR;熒光PCR;快速PCR;DNA聚合酶；mRNA差異顯示PCR0前言聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreactionPCR技術(shù)由于PCR簡便易行、靈敏度高等優(yōu)點，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。但是，由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)不能準(zhǔn)確定量，且操作過程中易污染而使得假陽性率高等缺點，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制1。鑒于此，對PCR產(chǎn)物進行準(zhǔn)確定量便成為迫切的需要。幾經(jīng)探索，先后出現(xiàn)了多種定量PCR(quantitativePCR,Q-PCR方法，其中結(jié)果較為可靠的是競爭性PCR和熒光定量PCR(fluorescencequantitativePC

3、RFQ-PCR。隨著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)檢測的不斷發(fā)展，人們越來越希望在保證PCR反應(yīng)特異性、靈敏性、保真度的同時，能夠盡量縮短反應(yīng)的時間，即實現(xiàn)快速PCR(RapidPCRorFastPCR快速PCR技術(shù)不僅可使樣品在有限的時間內(nèi)可以盡快得到擴增，而且可以顯著增加可檢測的樣品數(shù)量，顯然，在大批量樣本檢測和傳染病快速診斷等方面將會有重要的應(yīng)用前景。例如，快速PCR在臨床檢測中可大大加快疾病的診斷效率；在生物恐怖襲擊時能有效幫助快速鑒定可疑物中有害生物的存在與否；同時，由于PCR已經(jīng)滲入到現(xiàn)代生物學(xué)研究的各個方面，快速PCR的實現(xiàn)必然可以使許多科學(xué)研究工作的進展顯著加快，最終影響到整個生物學(xué)發(fā)展的速度

4、。近年來，快速PCR技術(shù)得到了可喜的進展。從聚合酶的改進、添加劑的開發(fā)以及熱循環(huán)儀的革新創(chuàng)造三個不同途徑上分別進行的研發(fā)表明。生物的性狀和生物對各種生物、理化及致病因子的應(yīng)答，本質(zhì)上都是基因在時間上或空間上選擇性表達，即基因的差異表達的結(jié)果，因而，獲取差異表達的基因信息，將有助于了解生物的生理變化和病理改變的分子機制20研究基因差異表達主要技術(shù)有：消減文庫篩選、差異雜交、代表性差異分析、基因表達序列分析、電子消減技術(shù)3和mRNA差異顯示PCR技術(shù)等（mRNADifferentialDisplayPCR,簡稱DD-PCR4。迄今為止，上面的幾種方法已成功地用于基因差異表達的研究。尤其是mRNA差

5、異顯示PCR技術(shù)，雖然發(fā)明只有短短十幾年，已經(jīng)取得了令人矚目的科研成果，原因是它具備需要總RNA的量極少，不需要純化的mRNA,操作簡便、快速、靈敏等優(yōu)點5-8,故已被許多生命科學(xué)實驗室作為一種重要工具，應(yīng)用于體內(nèi)和體外差異表達基因的篩選，研究基因功能9?，F(xiàn)將定量PCR技術(shù)、快速PCR技術(shù)、mRNA差異顯示PCR技術(shù)研究情況作一綜述作簡要綜述。1定量PCR技術(shù)定量PCR（PolymeraseChainReaction技術(shù)有廣義概念和狹義概念。廣義概念的定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進行PCR起始模板量的定量。狹義概念的定量PCR技術(shù)（嚴格意義

6、的定量PCR技術(shù)）是指用外標(biāo)法（熒光雜交探針保證特異性）通過監(jiān)測PCR過程（監(jiān)測擴增效率）達到精確定量起始模板數(shù)的目的，同時以內(nèi)對照有效排除假陰性結(jié)果（擴增效率為零。廣義概念下的定量PCR技術(shù)可以分為五種類型：（1）外參法+終產(chǎn)物分析，是指樣本與陽性參照在兩個反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型沒有對樣本進行質(zhì)控監(jiān)測，易出現(xiàn)假陰假陽結(jié)果，沒有監(jiān)測擴增效率，定量不準(zhǔn)。(2)內(nèi)參法+終產(chǎn)物分析，是指樣本與陽性參照在一個反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型對樣本進行質(zhì)控監(jiān)測，排除假陰結(jié)果，但是定量不準(zhǔn)。(3)外標(biāo)法+過程監(jiān)測，這種類型監(jiān)測擴增效率，陽性樣本定量準(zhǔn)，但是無法排除假陰結(jié)果。(4)內(nèi)參法+過程監(jiān)測，由于樣本與陽性

7、參照在一個容器內(nèi)反應(yīng)，用同樣的Taq酶和反應(yīng)參與物，存在競爭性抑制，起始模板量濃度高的反應(yīng)會抑制起始模板量濃度低的反應(yīng)，所以定量不準(zhǔn)。(5)外標(biāo)法+過程監(jiān)測+內(nèi)對照，這種類型監(jiān)測擴增效率，陽性樣本定量準(zhǔn)，同時排除假陰結(jié)果。這種類型是應(yīng)該提倡的。1.1 競爭性PCR技術(shù)定量PCR技術(shù)是對傳統(tǒng)PCR技術(shù)的進一步發(fā)展和補充，在定量過程中需借助各種形式的參照物。參照物是一種已知含量的標(biāo)準(zhǔn)模板，按其是否與待測樣品在同一反應(yīng)體系中擴增而分為內(nèi)參照和外參照。鑒于PCR擴增過程中管與管之間的擴增效率存在差異，理想的定量PCR應(yīng)該使用內(nèi)參照。競爭性PCR即是采用內(nèi)參照的一種定量PCR方法，通過消除管問及樣品間的

8、變異，從而達到較為精確的基因定量10。該方法是將待測基因與已知濃度的內(nèi)參照模板在同一反應(yīng)管中共同擴增，由于二者具有相同引物的結(jié)合位點并采用同一引物進行擴增，因此二者競爭引物、脫氧核甘酸以及DNA聚合酶，以致當(dāng)一種模板量逐漸增加時，另一種模板的擴增產(chǎn)物就會逐漸減少。兩模板的擴增產(chǎn)物量可分別用以下公式表示：Y待測=X待測(1+En；Y內(nèi)參照=X內(nèi)參照(1+En,其中X待測為起始拷貝量；Y待測為擴增產(chǎn)物量。由于在同一反應(yīng)體系中擴增，兩模板的循環(huán)次數(shù)n保持一致，如果使兩者間的擴增效率E也相同，就存在如下關(guān)系：Y待測/Y內(nèi)參照=X待測/X內(nèi)參照。當(dāng)兩模板的產(chǎn)物量相同時，則兩模板的反應(yīng)起始拷貝數(shù)相等，由此

9、可對待測模板進行精確定量。具體檢測方法是將已知濃度的內(nèi)參照模板倍比稀釋后分別與恒定量的待測基因一起擴增，以參照模板的起始拷貝數(shù)為橫軸，以兩模板擴增產(chǎn)物量的比率為縱軸，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為1的點所對應(yīng)的參照模板的起始拷貝數(shù)即為待測基因的拷貝數(shù)。由上述定量原理可知，保持兩模板擴增效率E的一致性是定量的關(guān)鍵，為此要求參照模板應(yīng)與待測基因具有相似的大小及序列，相同的引物結(jié)合位點。止匕外，參照模板還應(yīng)在擴增后易于分離檢測。因此，對于競爭性PCR的研究重點主要集中在建立高效、穩(wěn)定、可靠的模板方面，現(xiàn)已取得了較滿意的結(jié)果11-13。1. 2熒光定量PCR技術(shù)熒光定量PCR（RQ-PCR技術(shù)）是通過在PCR

10、反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進行定量分析。Ct值（cyclethreshold,Ct,即PCR擴增過程中擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)，它與模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，模板DNA量越多，熒光達閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。1.1.1 Taqman技術(shù)Taqman技術(shù)由美國PE公司開發(fā)，現(xiàn)已廣泛用于基因檢測。該技術(shù)的原理是利用Taq酶的5'-

11、3'外切酶活性，在傳統(tǒng)PCR技術(shù)一對特異性引物的基礎(chǔ)上增加了一條熒光雙標(biāo)記探針。該探針可與上、下游引物之間的DNA模板序列特異性結(jié)合。探針的5'端標(biāo)以熒光報告基團，如FAM（62竣基熒光素；3'端標(biāo)以熒光淬滅基團，如TAMRA（62竣基四甲基諾丹明。當(dāng)探針保持完整時，兩個基團的空間距離非常接近，構(gòu)成熒光能量傳遞（FRET關(guān)系，5'端熒光報告基團發(fā)出的熒光信號被3'端淬滅基團吸收，使其不能被儀器檢測。當(dāng)兩個基團發(fā)生分離后，兩者間的FRET關(guān)系被破壞，淬滅基團的抑制作用解除，報告基團的熒光信號便得到釋放。在PCR退火復(fù)性期，探針與DNA模板特異性結(jié)合。在PC

12、R延伸階段，Taq酶在引物的引導(dǎo)下，以四種脫氧核甘酸為底物，按堿基配對原則沿著模板合成新鏈，當(dāng)移動至探針結(jié)合的位置時便發(fā)揮其5'-3'外切酶活性將探針降解成單核甘酸，使得熒光報告基團與淬滅基團分離，前者的熒光信號釋放并被檢測。由此可見，每合成一條新鏈就有一個探針被裂解并釋放出一個熒光信號。根據(jù)這種關(guān)系，通過檢測PCR反應(yīng)液中的熒光強度，再經(jīng)校正計算后即可得出初始模板的數(shù)量。Taqman技術(shù)現(xiàn)主要用于病毒的定量分析，病原體的分型鑒定，基因的快速診斷分析14-16o1.1.2 AmpliSensor技術(shù)該技術(shù)與TaqmanPCR的區(qū)別在于其采用的是復(fù)合探針。一個探針上標(biāo)以熒光報告基

13、團，另一個探針上標(biāo)以熒光淬滅基團，后者的5'端較前者多出7個堿基(GCGTCCC。兩探針之間能因堿基互補而結(jié)合，此時兩基團靠近而形成FRET結(jié)構(gòu)，報告基團的熒光信號被淬滅基團吸收。當(dāng)兩探針分開后，其間的FRET關(guān)系受到破壞，淬滅基團的抑制作用解除，報告基團的熒光信號得到釋放。在PCR擴增前需將該復(fù)合探針與一個半套式PCR引物連接，該引物的5'端應(yīng)具有一段與長探針上多出的7個堿基互補的序列，以便DNA連接酶能將該引物與短探針連接。擴增時該探針2引物復(fù)合物作為半套式引物摻入到模板，并釋放出淬滅探針，使原有的FRET結(jié)構(gòu)破壞，從而釋放出報告基團的熒光信號，其強度與被擴增的模板數(shù)相對應(yīng)

14、。MateraG等17用AmpliSensor技術(shù)對丙型肝炎病毒(hepatitisCvirusHCV的基因型進行檢測，發(fā)現(xiàn)此方法具有很高的特異性，能準(zhǔn)確檢測待測標(biāo)本中DNA的基因型和含量。1.1.3 Lightcycler技術(shù)Lightcycler技術(shù)是Roche公司新近開發(fā)的一種PCR定量技術(shù)。該技術(shù)的特點18,19也是將熒光報告基團和淬滅基團分別標(biāo)記在兩個不同的探針上，形成熒光探針和淬滅探針。熒光報告基團標(biāo)于探針的5'端，熒光淬滅基團標(biāo)于探針的3'端，兩探針能分別與模板同一條鏈中相鄰的核甘酸序列進行雜交。當(dāng)探針游離時能檢測到報告基團的熒光信號；如果反應(yīng)體系中存在特異性模板

15、，PCR復(fù)性階段兩探針即會與之雜交，此時兩探針上的熒光報告基團和淬滅基團相距很近，形成FRET關(guān)系，前者的熒光信號被后者吸收，即發(fā)生熒光淬滅。由于熒光淬滅的程度與被擴增的模板量相對應(yīng)，因此可達到定量的目的。KearnsAM等20,21報道，Light-cycler技術(shù)在對病毒DNA的快速分型和定量方面有特殊的優(yōu)勢。1.1.4 Molecularbeacon技術(shù)亦稱分子信標(biāo)技術(shù)是一種單鏈DNA形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在其一端有一報告基團，在另一端有一淬滅基團，當(dāng)它形成發(fā)火結(jié)構(gòu)時，由于熒光報告基團與淬滅基團想互靠近，兩者之間發(fā)生熒光信號能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescentresonanceenergytr

16、ansferFRET,當(dāng)熱循環(huán)溫度達到分子beacon的解鏈溫度時，其構(gòu)象改變，與模板結(jié)合而完全伸展成線性分子，使得FRET消失，報告基團發(fā)出熒光信號。2快速PCR技術(shù)隨著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)檢測的不斷發(fā)展，人們越來越希望在保證PCR反應(yīng)特異性、靈敏性、保真度的同時，能夠盡量縮短反應(yīng)的時間，即實現(xiàn)快速PCR(RapidPCRorFastPCR快速PCR技術(shù)不僅可使樣品在有限的時間內(nèi)可以盡快得到擴增，而且可以顯著增加可檢測的樣品數(shù)量，顯然，在大批量樣本檢測和傳染病快速診斷等方面將會有重要的應(yīng)用前景。例如，快速PCR在臨床檢測中可大大加快疾病的診斷效率；在生物恐怖襲擊時能有效幫助快速鑒定可疑物中有害生物

17、的存在與否；同時，由于PCR已經(jīng)滲入到現(xiàn)代生物學(xué)研究的各個方面，快速PCR的實現(xiàn)必然可以使許多科學(xué)研究工作的進展顯著加快，最終影響到整個生物學(xué)發(fā)展的速度。近年來，快速PCR技術(shù)得到了可喜的進展。從聚合酶的改進、添加劑的開發(fā)以及熱循環(huán)儀的革新創(chuàng)造三個不同途徑上分別進行的研發(fā)表明，快速PCR技術(shù)不僅對普通擴增，且對實時定量擴增都具有可實現(xiàn)性，并已有相關(guān)的部分試劑或儀器在市場上推出。從研發(fā)角度，目前技術(shù)的發(fā)展重點主要集中在熱聚合酶融合蛋白及芯片式PCR儀的研制兩個方面。2. 1快速PCR的實現(xiàn)途徑快速PCR技術(shù)原理仍建立在常規(guī)PCR原理的基礎(chǔ)上。常規(guī)的PCR反應(yīng)過程通常是三大階段的循環(huán)，即變性階段、

18、退火階段和延伸階段(在某些情況下，退火階段和延伸階段可以合并，反應(yīng)時間是以上三個階段的總時間加上各階段間溫度變化的時間。要實現(xiàn)快速PCR,其根本問題就是要縮短這三大階段的持續(xù)時間或溫度變化的時間。在PCR中，變性階段的目的將雙鏈DNA在高溫下變性為單鏈DNA,所用時間取決于聚合酶的耐受溫度，常用的聚合酶耐受95C,若提高聚合酶的耐受溫度，則變性階段的時間可以縮短；退火階段的目的是使單鏈DNA相互間正確配對形成雙鏈DNA,主要取決于模板的復(fù)雜程度以及引物和模板之間的結(jié)合能力，要縮短這一階段的持續(xù)時間可以通過加入一些穩(wěn)定單鏈DNA形成或促進雙鏈DNA形成的添加劑來實現(xiàn)。而延伸階段的持續(xù)時間主要取決

19、于DNA聚合酶的延伸速率，可以通過發(fā)現(xiàn)新的高效DNA聚合酶、對現(xiàn)有DNA聚合酶的改進以及加入能增強酶活性的輔助因子等來獲得更高的延伸速率，從而縮短延伸過程的時間。至于各階段間溫度變化的時間則主要取決于熱循環(huán)儀的工作效率，可以通過選擇傳熱性能更優(yōu)良的材料、改進熱循環(huán)儀的工作原理或采用微小體積反應(yīng)等方式使PCR儀的傳熱效率提高，進而大大縮短溫度變化所占用的時間，最終使整個反應(yīng)的速率得到提圖。3. 2用于實現(xiàn)快速PCR的DNA聚合酶在PCR循環(huán)中，延伸階段的持續(xù)時間主要取決于DNA聚合酶的延伸速率，提高聚合酶的延伸活性和延伸速率無疑會縮短整個PCR反應(yīng)所需的時間。由于PCR反應(yīng)常用的Taq、Pfu等

20、DNA聚合酶在其天然的生物體中主要用于DNA損傷的修復(fù)以及重組等，因此它們的延伸活性和延伸速率比較低22o為了獲得具有高延伸活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，研究者通過基因工程的手段將DNA聚合酶與能和DNA鏈相互作用的蛋白質(zhì)功能域以融合蛋白的形式相結(jié)合，或直接利用定點突變的方法篩選出具有高延伸活性的DNA聚合酶。Wang等22通過將蛋白Sso7d與DNA聚合酶融合得到了具有快速延伸能力的DNA聚合酶。Sso7d是從Sulfolobussolfataricus中分離到的一種雙鏈DNA結(jié)合蛋白23。它大量存在于嗜熱古細菌中，被認為在穩(wěn)定基因組DNA中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，將Sso7d與A家族或B家

21、族的DNA聚合酶以融合蛋白的形式連接在一起后，由于Sso7d對雙鏈DNA具有一定的親和力，可以識別退火后的雙鏈，從而使聚合酶快速找到延伸起始點，有效地增強了原DNA聚合酶的延伸速度。例如，與Ss07d融合的PfuDNA聚合酶可以在2min內(nèi)延伸10k的DNA片段，而一般的PfuDNA聚合酶相同時間下即使提高酶的用量也只能合成2k的DNA片段。同時，融合后DNA聚合酶與雙鏈DNA的作用是較弱的，這就避免了強相互作用所導(dǎo)致的阻礙DNA聚合酶在DNA鏈上移動的不利結(jié)果。此外還發(fā)現(xiàn)Sso7d可以增加聚合酶對體系中高鹽濃度的耐受性，可便于對PCR反應(yīng)進一步優(yōu)化。與Ss07d相類似，在DNA拓撲異構(gòu)酶V中

22、發(fā)現(xiàn)的螺旋O發(fā)夾O螺旋結(jié)構(gòu)蛋白也是一種DNA非特異性結(jié)合蛋白24。它在中性pH的條件下部分帶正電，因此可以與帶負電的DNA磷酸骨架相互作用。Pavlov等25將它與PfuDNA聚合酶相融合后發(fā)現(xiàn)可以增加DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性、提高酶對高鹽濃度的耐受性，并增加酶的延伸活性。目前，商品化的快速PCR聚合酶主要是Takara公司的Taq聚合酶，該酶除了延伸速率提高之外，還可耐受更高的變性溫度，推薦98c變性1s,因此變性階段的時間也縮短了不少。Machida等26在大批量樣本的擴增中評價了快速Taq聚合酶，擴增產(chǎn)物正常，但未與其它常規(guī)用Taq酶比較。在Qiu等27的工作中，評價了TaqDNA聚合酶、

23、LAOTaqDNA聚合酶與AmpliTaqDNA聚合酶對PCR產(chǎn)物中嵌合體（chimeras,突變（mutiation和異源雙鏈（heteroduplex的產(chǎn)生的影響。在其試驗體系中ZOTaq具有最高的反應(yīng)速率，但形成PCR假象（artifact的總幾率較高，達20%;LAOTaq具有最高的保真度，反應(yīng)速率居中，形成PCR假象的總幾率為15%;AmpliTaq形成PCR假象的幾率為7%。ZOTaq（8.7%與LAOTaq（6.2%比AmpliTaq（2.5%容易形成嵌合體。ZOTaq形成嵌合體和異源雙鏈的頻率比AmpliTaq高幾乎三倍。該工作提示利用ZOTaq酶快速擴增的同時部分程度上犧牲了

24、保真度。3mRNA差異顯示PCR技術(shù)4. 1mRNA差異顯示PCR技術(shù)的主要原理在生命過程的某一時期，生物細胞轉(zhuǎn)錄和表達的基因只有很少一部分，而且在不同的發(fā)育階段、不同的生理狀態(tài)和不同類型細胞的基因轉(zhuǎn)錄和表達也不盡相同，因此，研究mRNA的差異，相對于研究DNA差異，排除了內(nèi)含子的影響，使研究更接近于生命活動的實質(zhì)。mRNA差異顯示PCR技術(shù)是根據(jù)真核生物細胞中絕大多數(shù)mRNA均帶有3'polyA1的結(jié)才特點(除極少部分mRNA,如組蛋白mRNA外。以此為依據(jù)，設(shè)計3端引物Oligo-dTnM(M分別代表A、C、G,這3種引物，稱之為錨錠引物28-29。利用錨定引物將不同來源的細胞或不

25、同生理狀態(tài)的同種細胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并用此引物和5'端的隨機引物對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，隨后進行熒光染色或硝酸銀染色或放射自顯影，通過比較找出差異表達的cDNA條帶30。從凝膠上切割下這些差異性條帶，用相同的引物和條件進行PCR再擴增，克隆所得PCR產(chǎn)物進行核甘酸序列分析，將分析結(jié)果與基因序列數(shù)據(jù)庫中的序列作同源比較，就可知分離的是已知基因序列，還是未知基因序列；同時分析結(jié)果可以用作探針從cDNA文庫或基因組DNA文庫中篩選到全長的cDNA序列或基因組克隆。3.2差異顯示PCR技術(shù)應(yīng)用中的優(yōu)點3.2.1極少的總RNA的需要量差異顯示PCR技術(shù)總RN

26、A需要量極少，一次試驗僅需要0.20.02p,g在這一點上，是其他的差異表達研究方法無法比擬的，這種方法使得尤其對材料來源困難的生物體的差異表達的研究得以實現(xiàn)5o同時用純化的總RNA和純化的mRNA做模板都可以獲得相同差異表達結(jié)果，因為錨定引物Oligo-dTnM能特異性結(jié)合于mRNA的poly(A尾部，而轉(zhuǎn)運RNA和核糖體RNA的存在不影響差異顯示PCR的結(jié)果31。3.2.2敏感度高其他研究差異表達的方法適用于高轉(zhuǎn)錄水平的mRNA的差異比較，而低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA的差異比較卻顯得無能為力。差異顯示PCR技術(shù)對于篩選低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA的結(jié)果得到很大改善，使低轉(zhuǎn)錄水平mRNA進行差異顯示PCR

27、的可能性大大提高32-33。3.2.1操作簡單快捷差異顯示PCR技術(shù)操作簡單快捷，從RNA的純化，差異顯示PCR、差異電泳、差異帶分離純化，差異鑒定、陽性結(jié)果的序列分析，整個可以在23周完成，這是其他方法無法比擬的6。3.3差異顯示PCR技術(shù)應(yīng)用中的不足雖然差異顯示PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于差異表達基因的研究，并且仍在不斷地優(yōu)化和改進，但是，差異顯示PCR技術(shù)在實際應(yīng)用中仍存在一些問題31,34-35。3.3.1假陽性高差異顯示PCR技術(shù)假陽性差異帶過高，差異顯示PCR時的差異帶往往不能在Northern雜交和反向Northern雜交中重現(xiàn)。差異條帶經(jīng)回收后，必須再次擴增才能用于Northern雜

28、交、克隆及序列分析等，有時2次PCR反應(yīng)經(jīng)常擴增出多條帶，影響隨后的雜交鑒定3403.3.2獲得的片段短mRNA的平均長度1.2kb,差異顯示PCR所彳#cDNA片段的長度多在100400bp之間，平均長度約300bp，這些片段大多數(shù)位于mRNA3端300bp左右的非翻譯區(qū)，這段mRNA在不同生物間差別較大，基因文庫中常不包括這部分。差異顯示PCR的cDNA并不是都能找到與之同源的序列。另外，由于同一生物3端的非翻譯區(qū)較為相似，對cDNA進行測序之后并不能預(yù)測其功能和作進一步的分析。為了得到翻譯區(qū)的序列，常用的方法是篩選cDNA文庫或者應(yīng)用RACE方法獲取全基因，但篩選cDNA文庫非常耗時，并

29、且同一物種，不同的基因3端的非翻譯區(qū)非常相似，篩庫工作很可能是徒勞的35o3.3.3稀有mRNA差異顯示困難PCR高度靈敏，易擴增展示稀有mRNA片段，這既是該方法的優(yōu)點，也是該方法的不足之處，因為稀有的mRNA在雜交時顯示不出表達信號。因此，該方法傾向于分離高拷貝數(shù)的cDNA序列，如何提高分離稀有mRNA效率有待進一步的研究31。3小結(jié)與展望基因分析的定量化是對基因診斷的要求和未來發(fā)展的趨勢。總的來說，定量PCR技術(shù)的研究方興未艾，還有諸多問題有待解決，如競爭性PCR中競爭性模板制備較難，且與待6測模板的擴增效率也難以達到完全相同；Taqman技術(shù)中Taq酶的外切酶活性能影響定量；Ampli

30、Sensor技術(shù)仍無法區(qū)分引物二聚體形成的非特異擴增信號，且每次PCR反應(yīng)前需進行AmpliSensor標(biāo)記，增加了操作步驟及成本；分子信標(biāo)技術(shù)所用探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定性還不理想；以及Lightcycler技術(shù)因兩個探針均與模板結(jié)合而影響了擴增效率等；止匕外，熒光定量PCR技術(shù)均存在探針標(biāo)記的成本較高，不便普及的問題，分析靈敏度仍需不斷提高。以上表明對定量PCR技術(shù)的研究還需不斷深入。相信在不久的將來，會有結(jié)果更精確、成本更低的定量PCR技術(shù)出現(xiàn)，在實驗研究及臨床診斷上得到廣泛的應(yīng)用。PCR技術(shù)總體來講已經(jīng)成為一個較為成熟的技術(shù)，但隨著研究和應(yīng)用領(lǐng)域不斷增長的新需求，PCR仍存在相當(dāng)巨大的改進

31、空間。這其中，快速PCR技術(shù)的探索無疑是一項重要的拓展工作。如上所述，通過提高酶的活性、加入適合的添加劑以及對熱循環(huán)儀中使用的溫度改變方式進行改進，已經(jīng)從不同程度上實現(xiàn)了快速PCRo如果能將三者的優(yōu)勢有機地結(jié)合起來，則擴增速度有望進一步提高我們認為，針對該技術(shù)的面向普及應(yīng)用的評價仍需深入，在實際使用過程中也不能單純盲目地求快，而應(yīng)當(dāng)根據(jù)研究對象的不同，在保證PCR反應(yīng)的特異性、靈敏性以及高產(chǎn)量的情況下實現(xiàn)快速PCR。從目前的研究結(jié)果看，各種快速PCR試劑(包括酶，添加劑在PCR反應(yīng)的特異性、靈敏度、產(chǎn)量方面的系統(tǒng)評價顯然不夠，應(yīng)該引起研究者的重視。隨著更多新方法的發(fā)明，隨著各學(xué)科間交叉合作的深

32、入，快速PCR技術(shù)會進一步完善和系統(tǒng)化，給所有生物學(xué)工作者帶來新的驚喜。mRNA差異顯示PCR是一種比較靈活、全面的檢測細胞和組織差異表達基因的方法，該方法具有其他許多方法無法比擬的優(yōu)點，但是也存在一些問題，近年來的科學(xué)研究針對一些問題已經(jīng)做了改進，人們相信，隨著時間的推移，該方法必然在促進差異基因的研究中作出更大貢獻。參考文獻：1ChungHW.ReversetranscriptasePCR(RT-PCRandquantitative-competitivePCR(QC-PCR.ExpMolMed,2001,33(1Suppl:85-97.2李玉京，李子銀，李振聲.真核生物mRNA差顯技術(shù)(

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