分子生物學復習資料 絕對重點

1、分子生物學復習資料 （第一版） 一 名詞解釋1 Southern blot / Northern blot DNA斑跡法 / RNA轉移吸印技術。是為了檢測待檢基因或其表達產(chǎn)物的性質和數(shù)量（基因拷貝數(shù)）常用的核酸分子雜交技術。二者均屬于印跡轉移雜交術，所不同的是前者用于檢測DNA樣品；后者用于檢測RNA樣品。2 cis-acting element / trans-acting factor 順式作用元件 / 反式作用因子。均為真核生物基因中的轉錄調控序列。順式作用元件是與結構基因表達調控相關、能被基因調控蛋白特異性識別和結合的特定DNA序列，包括啟動子和上游啟動子元件、增強子、反應元件和po

2、ly（A）加尾信號。反式作用因子是能與順式作用元件特異性結合、對基因表達的轉錄起始過程有調控作用的蛋白質因子，如RNA聚合酶、轉錄因子、轉錄激活因子、抑制因子。3 VNTR / STR 可變數(shù)目串聯(lián)重復序列 / 短串聯(lián)重復。均為非編碼區(qū)的串聯(lián)重復序列。前者也叫高度可變的小衛(wèi)星DNA，重復單位約924bp,重復次數(shù)變化大,變化高度多態(tài)性；后者也叫微衛(wèi)星DNA，重復單位約26 bp，重復次數(shù)約1060次，總長度通常小于150bp 。 （參考第7題）4 viral oncogene / cellular oncogene 病毒癌基因 / 細胞癌基因。病毒癌基因指存在于逆轉錄病毒中、體外能使細胞轉化、

3、體內能導致腫瘤發(fā)生的基因；細胞癌基因也叫原癌基因，指存在于細胞內，與病毒癌基因同源的基因序列。正常情況下不激活，與細胞增殖相關，是維持機體正常生命活動所必須的，在進化上高等保守。當原癌基因的結構或調控區(qū)發(fā)生變異，基因產(chǎn)物增多或活性增強時，使細胞過度增殖，從而形成腫瘤。5 ORF / UTR 開放閱讀框 / 非翻譯區(qū)。均指在mRNA中的核苷酸序列。前者是特定蛋白質多肽鏈的序列信息，從起始密碼子開始到終止密碼子結束，決定蛋白質分子的一級功能；后者是位于前者的5端上游和3端下游的、沒有編碼功能的序列，主要參與翻譯起始調控，為前者的多肽鏈序列信息轉變?yōu)槎嚯逆溗匦琛?6 enhancer / sile

4、ncer 增強子 / 沉默子。均為順式作用元件。前者是一段含多個作用元件的短DNA序列，可特異性與轉錄因子結合，增強基因的轉錄活性，可以位于基因任何位置，通常在轉錄起始點上游-100到-300個堿基對處；后者是前者內含的負調控序列，結合特異蛋白因子時，對基因轉錄起阻遏作用。7 micro-satellite / minisatellite 微衛(wèi)星DNA / 小衛(wèi)星DNA 。衛(wèi)星DNA是出現(xiàn)在非編碼區(qū)的串聯(lián)重復序列，特點是有固定重復單位且重復單位首尾相連形成重復序列片段，串聯(lián)重復單位長短不等，重復次數(shù)大小不一。微衛(wèi)星DNA即STR；小衛(wèi)星DNA分為高度可變的小衛(wèi)星DNA（即VNTR）和端粒DNA

5、。 （參考第3題）8 SNP / RFLP 單核苷酸多態(tài)性 / 限制性片段長度多態(tài)性。 前者是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，它是人類遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上；后者是由于高度重復序列中的無間隔反向重復序列容易形成也容易突變產(chǎn)生或缺失一個酶切位點，所造成的限制性片段長度多態(tài)性，如果用同一種限制性內切酶消化不同個體的同一段DNA，由于堿基組成的變化而改變限制性內切酶識別位點，會產(chǎn)生長度不同的DNA片段。9 cloning vector/ expressing vector 克隆載體 / 表達載體。載體是與外源性DNA片段在體外連接構成重組分子

6、，然后導入宿主細胞，使外源性DNA擴增或表達的分子。克隆載體是用于克隆和擴增特定DNA片段的載體；表達載體是用于表達外源基因的載體。10 optional exon/ optional intron 外顯子選擇 / 內含子選擇。均屬于mRNA的選擇剪接方式。選擇剪接指參加拼接的外顯子可以不按其在基因組的線性分布次序拼接，內含子也可以不被切除而保留的剪接方式。外顯子選擇指在不同剪接方式中，某個或某幾個外顯子可以在成熟mRNA中保留，也可以通過剪接過程被去掉；內含子選擇指在不同剪接方式中，內含子可以被完全去掉，也可以有一個內含子被保留在成熟mRNA中。11 promoter / terminato

7、r 啟動子 / 終止子。均為真核生物基因兩側不能被轉錄且對基因表達、調控有重要作用的序列。啟動子是能與RNA聚合酶結合并起始轉錄的核苷酸序列，包括TATA盒、CAAT盒、GC盒一組序列，一般位于基因轉錄起始點上游-100-200堿基對范圍；終止子是提供轉錄停止信號的DNA序列，當mRNA轉錄到此部位后，產(chǎn)生poly(U),被結合在RNA聚合酶上的延長因子識別并與其結合，促使RNA聚合酶與DNA模板解離，終止轉錄。12 leader sequence / SD sequence 前導序列 / SD序列。前導序列指位于基因5端、第一個外顯子上游的序列，也叫5端序列，在加工過程中通常被最先剪切去除；

8、SD序列指位于原核生物mRNA5端，與核糖體16S rRNA結合的序列，一般位于mRNA的起始密碼AUG的上游510個堿基處,并且同16S rRNA 3端的序列互補，其順序及位置影響翻譯起始效率。 13 gene/ genome 基因 / 基因組。基因是負責編碼RNA或一條多肽鏈的DNA片段，即攜帶有遺傳信息的DNA序列，是控制性狀的基本遺傳單位；基因組是一個細胞或病毒的全部遺傳信息，真核生物基因組是一套完整單倍體DNA和線粒體DNA全部序列，某些病毒基因組由RNA組成。14 operon / operator 操縱子 / 操縱元件。操縱子是指按功能相關性成簇排列的結構基因，連同上游調控區(qū)和下

9、游轉錄終止信號，共同組成的一個基因表達協(xié)同單位；操縱元件是一段能被不同基因表達調控蛋白識別和結合的DNA序列，是決定基因表達效率的關鍵元件。15 gene rearrangement / gene replacement 基因重排 / 基因置換?；蛑嘏攀荄NA水平調控的重要方式之一，指某些基因片段改變原來存在順序，通過調整有關基因片段的銜接順序，再重排位一個完整的轉錄單位；基因置換是重要的基因治療方式，指將特定的目的基因導入特定的細胞，通過定位重組，以導入的正常基因置換基因組內原有的缺陷。16 domain / motif 結構域（功能域） / 基序（模序）。17 receptor / ad

10、aptor 受體 / 銜接蛋白。受體是信息分子的接收分子，是存在于細胞表面的或細胞內的蛋白分子，其作用是識別配體并將配體信號進行轉換，使之成為細胞內分子可以識別的信號并傳遞至其他分子引起細胞應答；銜接蛋白是信號轉導通路中不同信號轉導分子的接頭，可將位于其上游與下游的信號轉導分子連接起來。18 initiator caspase / effector caspase 起始者胱天蛋白酶 / 效應者胱天蛋白酶。胱天蛋白酶是哺乳動物細胞凋亡的關鍵酶。起始者胱天蛋白酶有較長原域，位于胱天蛋白酶級聯(lián)活化途徑上游，通過蛋白質相互作用自我激活；效應者胱天蛋白酶有較短原域，位于胱天蛋白酶級聯(lián)活化下游，前體能被起

11、始者胱天蛋白酶切割而活化，活化后能切割底物從而導致凋亡。19 transfection / transformation 轉染 / 轉化。均為重組DNA常用方法。前者指真核細胞主動攝取或被動導入外源性DNA片段而獲得新表型的過程；后者指將質?；蚱渌庠碊NA導入處于感受態(tài)的宿主菌并使其獲得新表型的過程。20 gene family / gene superfamily 基因家族 / 基因超家族?；蚣易逯负塑账嵝蛄谢蚓幋a產(chǎn)物結構具有一定程度同源性的基因，其編碼產(chǎn)物常常有相似功能；超基因家族是由多基因家族及單基因組成的更大的基因家族，它們結構有程度不等的同源性，但功能不一定相同。二 問答1 基因

12、的基本概念。答：基因的基本概念包括基因，基因組，結構基因，模板鏈，編碼鏈，外顯子，內含子，順式作用元件，反式作用元件，啟動子，增強子，終止子等。(參考名詞解釋)結構基因 基因中編碼RNA或蛋白質的DNA序列。模板鏈/編碼鏈 結構基因雙鏈中一條作為合成RNA的模板鏈，另一條為編碼鏈。外顯子/內含子 編碼序列 / 非編碼序列。2 基因的組織結構。答：原核生物基因結構簡單，通常是一條雙鏈環(huán)狀DNA分子，有操縱子結構。真核生物基因結構復雜，包括染色體DNA和線粒體DNA。染色體DNA位于細胞核內，雙鏈盤繞在以組蛋白分子為核心的結構表面構成核小體，核小體組成染色單體；線粒體DNA是閉環(huán)雙鏈分子，位于核外

13、。 病毒基因可以由DNA或RNA組成。RNA病毒基因有單雙鏈和正負鏈之分，DNA病毒基因有環(huán)狀DNA和線性DNA之分。3 原核生物、真核生物、人類基因組結構特點。答：原核生物的基因組結構特點：環(huán)狀雙股鏈，有操縱子結構，序列連貫，無內含子，大多為結構基因，無重疊序列，大多為單拷貝。 真核生物基因組結構特點：基因組大，核內染色體，體細胞基因組為雙倍體，大量重復序列，結構基因不連續(xù)，斷裂基因，含外顯子與內含子，絕大多數(shù)為非編碼序列。 人類基因組結構特點：人類基因組除包括真核生物基因組結構特點外，數(shù)量更大，非編碼序列更多。與細菌基因組相比，基因組大1000倍，基因數(shù)目多20倍，非編碼序列為10000倍

14、。4 重復序列種類、特征，人類基因多態(tài)性。 答：重復序列大部分是非編碼序列，功能主要與基因組穩(wěn)定性、組織形式及基因表達調控有關。根據(jù)重復序列出現(xiàn)頻率不同，可分為高重復序列DNA（105）、中重復序列DNA（10105）、單拷貝或低重復序列DNA（10）。 高重復序列可以集中在某一區(qū)域串聯(lián)排列。典型高重復序列DNA有衛(wèi)星DNA和反向重復序列。衛(wèi)星DNA出現(xiàn)在非編碼區(qū)呈串連重復排列，按照串連重復單位和重復次數(shù)，分為大衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA、微衛(wèi)星DNA。反向重復序列指兩個順序相同的拷貝在DNA鏈上反向排列，中間可以有間隔序列，也可以串聯(lián)（回文結構）。 中重復序列散在分布于基因組中，常與單拷貝基因

15、間隔排列。人類基因多態(tài)性是指人類個體之間基因組DNA的差異，這些差異產(chǎn)生的主要原因是基因組序列的變異。變異是生物遺傳基本特征之一，也是生物進化和適應環(huán)境的必然結果。基因多態(tài)性造成了生物特別是人類在生理及病理條件下對疾病、環(huán)境及應激的易感性、對環(huán)境、毒素、藥物的耐受性和反應性的千差萬別。5 病毒基因組、原核生物基因組、真核生物基因組核酸復制特點。答：DNA復制基本特點：復制都有固定起始點，復制過程中形成復制泡和復制叉，復制基本單位是復制子，復制是半保留復制，保證遺傳信息忠實傳遞，復制是半不連續(xù)復制，克服了DNA空間結構對DNA新鏈合成的制約。 原核生物有特定復制起點和終點結構，只有一個復制起點；

16、在起始點上可以連續(xù)開始新的復制；復制過程都是DNA雙鏈復制，也有復制、滾環(huán)復制、D環(huán)復制等方式。 真核生物復制需要解開和重裝核小體結構；復制過程中的引物及岡崎片斷長度小于原核生物；有多個復制位點；需要特殊機制復制端粒，涉及逆轉錄；一次復制完成以前不會啟動新一輪復制；線粒體DNA以D環(huán)模式進行復制。 不同病毒的基因組核酸以不同模式進行復制。單鏈環(huán)狀DNA可通過成環(huán)滾環(huán)模式復制，雙鏈環(huán)狀DNA可通過不同方式復制，有些病毒雙鏈環(huán)狀DNA通過RNA中間體進行復制，病毒線性DNA利用特殊末端起始引物復制，RNA病毒通過RNA復制過程復制。6 DNA損傷及其修復的主要方式。答：DNA損傷形式有：交聯(lián)、DN

17、A鏈斷裂、堿基突變、DNA重組等。 交聯(lián)包括鏈內共價交聯(lián)(堿基之間)和鏈間共價交聯(lián)（鏈與鏈之間）。 DNA鏈斷裂指DNA鏈內磷酸二酯鍵斷裂。 堿基突變包括單點突變和多點突變。點突變分為轉換（同型堿基替代）和顛換（異型堿基替代），此外還有缺失（核苷酸丟失）、插入（核苷酸增加）、倒位（核苷酸序列方向倒轉）。 DNA重組指DNA分子內發(fā)生較大片段的交換。DNA損傷修復機制有： 直接修復。如：DNA斷裂口在鏈兩端未損傷情況下可由連接酶直接修復，二聚體可被光復活酶直接修復，烷基化堿基可直接修復。 切除修復。可分為單個核苷酸切除修復和核苷酸片段切除修復。 重組修復。即先進行復制再進行切除修復。 SOS修復

18、。是DNA損傷嚴重時的應急性修復方式。 細胞周期檢查點控制是真核生物誘導修復的主要機制。7 原核生物基因表達轉錄環(huán)節(jié)的調控模式、調控方式。答：基因表達調控的環(huán)節(jié)，主要在轉錄水平。多種因素以特定的方式影響轉錄。 啟動子決定轉錄的效率與方向及模板鏈。 因子的種類與濃度調節(jié)基因的表達。 負調控：阻遏蛋白結合于DNA后抑制轉錄，分為誘導和阻遏2種情況。 正調控：調控蛋白結合于特定DNA序列后促進基因的轉錄。CAP蛋白調節(jié)糖代謝相關基因的表達；ntrC蛋白調節(jié)氮代謝相關基因的表達。 倒位蛋白通過DNA重組倒位調節(jié)基因表達。 RNA聚合酶抑制物可與RNA結合并抑制轉錄。 衰減子減弱轉錄。8 真核生物基因表

19、達各環(huán)節(jié)的基本要素。真核生物基因表達調控的環(huán)節(jié)及其主要特征。答：真核生物基因表達共有7個環(huán)節(jié)： 轉錄起始。RNA聚合酶在轉錄因子幫助下識別和結合啟動子，形成轉錄起始復合物。 RNA延伸。RNA聚合酶開始依堿基配對關系按模板鏈堿基序列加入核糖核苷酸。 轉錄終止。RNA聚合酶均有對應的終止信號，RNA聚合酶沒有明確中止信號。 轉錄產(chǎn)物的加工。mRNA前體加工：5端加帽3端加尾剪接化學修飾編輯;tRNA前體加工：剪接去除內含子剪切5端先導序列添加或修復3端CCA化學修飾。rRNA前體加工：前體剪接化學修飾。 RNA跨核膜運輸。mRNA與多種蛋白質合成核蛋白顆粒，rRNA前體在核仁合成并被加工成熟后，

20、與核糖體蛋白形成核糖體，從胞核運到胞質。 翻譯。翻譯起始階段：起始復合物前體形成起始復合物前體與mRNA結合形成起始復合物40亞基MettRNA復合物沿mRNA掃描40亞基MettRNA復合物識別密碼子。延長階段：氨基酸活化與搬運延長因子肽鏈延伸（進位、轉態(tài)、移位）。 終止階段：釋放因子RF識別終止子。 翻譯后加工。肽鏈折疊、肽鏈中氨基酸共價修飾、肽鏈水解修飾、亞單位聚合。真核生物基因表達的調控是多級調控，可發(fā)生在：DNA水平、轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平、翻譯后水平。 DNA水平：基因丟失、基因擴增與放大、基因重排、低甲基化、轉座與致癌基因的表達。 轉錄水平：轉錄起始復合物的形成是轉錄可調

21、控環(huán)節(jié)、反式作用因子是真核細胞重要基因表達調控蛋白、轉錄起始是由多種激活的反式作用因子復合調控。 轉錄后水平調控：5端加帽和3端加尾有調控意義、mRNA的選擇剪接可調控基因表達、mRNA運輸控制調節(jié)進入細胞質的mRNA量。 翻譯水平：某些mRNA翻譯起始可受特定因素調控、mRNA穩(wěn)定性調節(jié)蛋白質合成水平、小分子mRNA可調控翻譯效率。 翻譯后水平：新生肽鏈水解影響蛋白質含量、肽鏈中氨基酸共價修飾是快速調節(jié)方式、通過信號肽分揀、運輸、定位影響蛋白質功能發(fā)揮。9 蛋白質翻譯后修飾方式及其生物學意義。答：蛋白質翻譯后需要不同形式的共價修飾，才能有生物學活性。 新生肽鏈N端的甲硫氨酸在翻譯后被切除。

22、蛋白前體經(jīng)酶切修飾，激活成為功能蛋白質。 磷酸化去磷酸化修飾，決定磷蛋白的活性狀態(tài)。 糖基化修飾，包括N糖基化和O糖基化，是許多真核蛋白質產(chǎn)生生物學活性必要條件。 脂酰化修飾，使特定蛋白質定位于膜的周邊。 乙?；ヒ阴；揎棧烧{節(jié)蛋白質的活性。 二硫鍵的形成，使蛋白質的立體結構更穩(wěn)定。 金屬離子的結合，通常是酶活性中心的必需部分，參與酶的催化作用。 蛋白質異常修飾，與疾病密切相關。如：組蛋白乙?；惓Ｅc腫瘤密切相關。10 蛋白質分子在細胞內降解的決定性因素、降解途徑。答：蛋白質分子在細胞內的降解取決于其末端和內部序列。N末端有選擇性降解信號，即N末端氨基酸，分為去穩(wěn)定殘基和穩(wěn)定殘基，決定著蛋

23、白質的半衰期，有些降解信號可能是一段保守序列。 降解途徑有：溶酶體途徑、特殊細胞器內水解系統(tǒng)、細胞膜表面水解體系、內質網(wǎng)相關蛋白降解途徑（ERAD）、泛素蛋白酶體途徑（UPP）。ERAD和UPP稱為泛素蛋白酶復合體途徑。在UPP途徑中，蛋白質降解前要泛素化，然后被26S蛋白酶體降解；在ERAD途徑中，內質網(wǎng)正確識別錯誤折疊的蛋白質，將其逆向轉運到細胞漿，再被泛素蛋白體酶體系降解。11 細胞信號轉導基本概念、主要途徑、主要特點，G蛋白偶聯(lián)受體信號轉導途徑基本要素。答：細胞信號轉導是細胞針對外源信息發(fā)生的細胞應答反應全過程，即細胞識別各種外來理化信號，將其轉變?yōu)榧毎麅雀鞣N分子活性的變化，從而改變細

24、胞內某些代謝過程、影響細胞生長速度甚至誘導死亡的過程。信號轉導主要途徑：G蛋白介導的細胞信號轉導途徑：腺苷酸環(huán)化酶途徑，IP3、Ca 2+-鈣調蛋白激酶途徑，DG-蛋白激酶C途徑。 酪氨酸蛋白激酶介導的信號轉導途徑。核受體及其信號轉導途徑。 鳥苷酸環(huán)化酶信號途徑。G蛋白偶聯(lián)受體信號轉導途徑基本模式：配體與受體結合受體活化G蛋白G蛋白激活或抑制效應分子效應分子改變第二信使含量與分布第二信使作用于相應靶分子改變其構象，改變細胞代謝及基因表達。 12 細胞周期基本概念，Cyclin、CDK、CKI的主要種類及其在細胞周期調控中的作用。答：細胞周期是指細胞從一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的

25、一個有序過程。包括間期和分裂期，間期包括G1 期、S期、G2 期；分裂期包括前期、中期、后期、末期。Cyclin種類ABCDE功能S期和G2/M轉換G2/MG1期 G1/S轉換CDK功能CDK1G2/M轉換 、有絲分裂CDK2G1 期 、S期 、G1/S轉換CDK3G1/S轉換CDK4G0/ G1轉換 、G1/S轉換CDK5神經(jīng)纖維磷酸化CDK6G0/ G1轉換 、G1/S轉換CDK7CDK26活化所需要CDK8轉錄CDK9轉錄CKIINK4家族功能CIP/KIP家族功能INK4a(p16)維持細胞正常生長必需、腫瘤抑制、誘導復制衰老、抑制端粒酶活性、抑制細胞生長。P21DNA損傷反應時G1期

26、停滯、G2/M轉換INK4b(p15)誘導復制衰老、抑制端粒酶活性、抑制細胞生長。P27G1期停滯、抑癌INK4c(p18)P57生長發(fā)育中起細胞增長相反作用INK4d(p19)13 細胞凋亡的基本概念、主要功能形態(tài)特征、幾種主要的凋亡誘導信號通路及其特點。答：細胞凋亡是機體細胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的程序化死亡過程，其發(fā)生受到機體嚴密調控。形態(tài)特征為細胞皺縮、胞漿失水濃縮，胞膜完整、泡狀，凋亡后期內裹核物質和細胞器形成凋亡小體，核膜完整、核皺縮，染色質固縮聚集核膜下、最后裂解為碎片，細胞器大多完整、線粒體腫脹、通透性增加、釋放細胞色素。生物化學特征為DNA在核小體連接處斷裂形成

27、連續(xù)階梯狀小片段；凋亡相關蛋白質和酶活化；凋亡早期磷脂酰絲氨酸外翻；ATP正常合成并分解供能。 細胞凋亡誘導信號通路有外源性死亡受體途徑和內源性線粒體途徑。前者由死亡受體與相應配體結合組裝DISK，誘發(fā)caspase 8前體活化，導致下游效應者光天蛋白酶活化，切割底物使細胞凋亡；后者是由于生長因子不足，細胞脫離原來環(huán)境或DNA損傷等誘發(fā)，由Bcl2家族中促凋亡因子使細胞色素C從線粒體釋放入胞漿，與Apaf1、ATP/dATP形成凋亡體，凋亡體活化caspase 9前體，caspase 9下游途徑與死亡受體途徑相同。14 原癌基因的概念、分類、激活機制，抑癌基因的基本概念、常見抑癌基因的基本功能

28、。答：原癌基因，指存在于細胞內，正常情況下不激活，與細胞增殖相關，是維持機體正常生命活動所必須的，在進化上高等保守的序列。當原癌基因的結構或調控區(qū)發(fā)生變異，基因產(chǎn)物增多或活性增強時，使細胞過度增殖，從而形成腫瘤。原癌基因按生化功能分為三類：蛋白激酶類生長因子，G蛋白、及與其活性相關的蛋白質，核內轉錄因子?；罨瘷C制有5種：點突變，基因擴增，基因重排，染色體易位，病毒基因啟動子及增強子的插入。抑癌基因是一類抑制細胞增生，從而抑制腫瘤形成的隱性基因。抑癌基因功能：RB和p53基因調節(jié)細胞周期關卡，抑癌基因通過調節(jié)信號轉導而抑制細胞生長，DNA修復基因維持基因組穩(wěn)定。15 重組DNA技術中常用工具酶的

29、主要特點和用途，RE的命名、分類及其活性影響因素。答：基因克隆中最主要的工具酶有：限制性核酸內切酶，用于切割DNA，識別雙鏈DNA分子內部特異位點裂解磷酸二酯鍵。DNA聚合酶，用于合成DNA。 逆轉錄酶，以RNA為模板合成cDNA。T4 DNA連接酶，催化DNA片斷連接。 堿性磷酸酶，去除核酸末端磷酸。限制酶第一個字母(大寫，斜體)代表該酶的微生物(寄主菌)屬名；第2、3個字母(小寫，斜體)代表微生物種名。接下來的字母代表寄主菌的株或型。如果從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了幾種限制酶，則根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的順序用羅馬字母表示。16 基因工程載體基本概念、基本條件，基因工程常用載體的特點及主要用途。答：載體：攜帶

30、靶DNA片段（外源DNA片段）進入宿主細胞進行擴增和表達的工具?？寺≥d體：主要用來獲得大量純化的目的DNA片段（目的基因），以便進一步研究其結構和功能。表達載體：主要用來產(chǎn)生插入基因和mRNA，進而合成相關蛋白質。載體基本條件： 能自主復制； 具備篩選標記；適當大小的分子量和適當限制性內切酶酶切位點； 在細胞中拷貝數(shù)高；應配備有與宿主細胞相適應的啟動子、前導順序、加尾信號、增強子等調控DNA元件常用的載體：質粒、噬菌體、病毒載體等質粒載體。用途：保存和擴增片段小于2kb的DNA、構建cDNA文庫、目的DNA測序、制備探針。 特點：分子量較小，能在細菌內穩(wěn)定存在；具有多個遺傳標志，能對宿主細胞選

31、擇；具有多個限制性內切酶單一切點，便于外源基因插入。 缺點：所能接受的DNA片段容量??；轉化效率低。噬菌體載體，包括插入型載體和置換型載體。用途：重要的基因組文庫和cDNA文庫克隆載體。 優(yōu)點：能攜帶的外源DNA片段更長，感染能力也大于質粒載體。缺點：進行真核基因組文庫構建時，其容量仍然受到一定的限制。粘粒載體。用途：根據(jù)載體攜帶的抗藥性標記篩選陽性克隆細胞株。 特點：含質?？顾幮詷擞浐妥灾鲝椭瞥煞?，可在細菌內大量擴增；帶粘性末端區(qū)，可體外包裝；有多個限制性內切酶酶切位點；本身不大；重組體的本底很低，有利于篩選。 BAC。特點：與標準質粒載體相似，但有不同的ori和編碼ori蛋白的F因子、可容

32、納大于300kb的外源DNA、重組子可通過電脈沖穿孔高效導入細菌細胞、進入細胞的拷貝數(shù)低。YAC。用途：人類基因組計劃中作物理圖的工具。 優(yōu)點：酵母是真核細胞能克隆真核基因序列尤其是重復序列、能克隆很大的DNA片段（2Mb）。 缺點：轉化效率低，形成的克隆數(shù)少，每個細胞僅含一個拷貝。17 真核生物基因轉染的常用方法及其原理。答：磷酸鈣共沉淀法。將外源DNA或重組質粒DNA與CaCl2溶液混合后形成DNA-磷酸鈣微小顆粒加入到宿主細胞培養(yǎng)基，顆粒沉淀到細胞表面被宿主攝取，將DNA導入細胞。電穿孔法。將外源DNA與宿主細胞混合于電穿孔杯中，在高頻電流作用下，細胞膜出現(xiàn)很多小孔，使外源DNA進入宿主

33、細胞。DEAE-葡聚糖法。將外源DNA或重組質粒DNA與DEAE葡聚糖混合，DEAE葡聚糖帶大量正電荷化學基團，可與DNA帶負電荷磷酸基團結合，黏附于細胞表面，借助細胞內吞過程促進外援DNA進入細胞。脂質體。陽離子脂質體試劑與DNA混合后形成穩(wěn)定脂質雙層復合物，加入培養(yǎng)細胞，脂質體可直接與細胞融合，DNA被釋放到胞漿。顯微注射法。將外源基因通過毛細玻璃管在顯微鏡下直接注射到受精卵的細胞核。18 PCR技術的基本原理、反應體系構成及其優(yōu)化，PCR優(yōu)化的條件，主要應用。答：PCR是在試管中進行的DNA復制反應，是以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5端和3端互補的寡核苷酸片段為引物，在DN

34、A聚合酶作用下，按半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，反復重復這一過程，可使目的DNA片段得到擴增。參與PCR反應體系的因素：模板核酸；引物；緩沖液Tag DNA聚合酶；Mg 2；dNTP；反應溫度與循環(huán)次數(shù)；PCR儀等。應用：目的基因克隆，基因體外突變，DNA微量分析mRNA含量分析?？蓱糜谶z傳病的基因診斷；腫瘤的診斷、轉移確定；組織器官移植的配型選擇等等。 優(yōu)化條件: Mg2+降低濃度阻止非特異和不想要的PCR產(chǎn)物。增加濃度贏得更多的產(chǎn)量。EDTA螯合Mg2+，因而可以改變Mg2+的濃度。DNA模板濃度為了減少Taq DNA聚合酶的產(chǎn)生錯誤的可能性，使用更高濃度的DNA

35、。但是使用太多可能增加污染物的量，降低反應效率。聚合酶與Pfx相比較，TaqDNA聚合酶具有更高的錯配率（沒有可以進行校正的3到5外切酶活性）。如果需要高保真度，可以使用Pfx。Taq酶傾向在3末端增加非模板的A.為了提高效率，可以額外增加酶的量（由于Taq酶可能在重復的循環(huán)中損耗），然而這可能增加非特異的PCR產(chǎn)物.dNTP可以使用高達1.5mM dNTP。dNTP螯合Mg。過高dNTP可能增加錯配率。降低dNTP的濃度（10-50M）可以減少錯配率。大PCR片段比小的片段要求更多的dNTP。引物可以使用高達3M的引物。高引物模板比可能導致非特異擴增和引物二聚體的形成。小批量分裝儲存引物，以避免多次反復凍融。熱循環(huán)如果模板GC含量高，增加變性的時間。對于較大的PCR片段應該增加延伸的時間，但是這