化合物對三種腫瘤細胞干預下的細胞毒性實驗

1、化合物對三種腫瘤細胞干預下的細胞毒性實驗一、材料與方法1. 實驗材料1.1實驗材料Hela細胞（宮頸癌細胞）、Eca-706細胞(食管癌細胞)、PC-12細胞（神經膠質瘤細胞）、53種化合物1.2主要儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱：力申HF151生物安全柜：阿爾泰實驗室設備（北京）有限公司BHC-1300A2低速大容量離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司LC-4016相差倒置顯微鏡：寧波舜宇儀器有限公司XD30高端研究級倒置顯微：德國蔡司Axio Observer A1恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠H21-4液氮罐：成都金鳳液氮容器有限公司YDS-65-216分析天平：賽多利斯科學儀器（北京

2、）有限公司BSA224S-CW全光柵酶標儀：美國莫賽飛世爾Mltiskan GO調速多用振蕩器：金壇市華峰儀器有限公司HY-4KQ5200DB型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司1.3主要試劑 表1名稱廠家貨號/批號PBS磷酸鹽緩沖液粉劑北京中杉金橋ZLI-9062胎牛血清美國Hyclone16000-004,Lot#GM K0070DMEM培養(yǎng)基（高糖）美國gibco12800-017 ,Lot#16556970.25%胰酶美國gibco25200-056, Lot#1627654青霉素-鏈霉素雙抗美國gibco15140-122 ,Lot#1631430MTT（噻唑藍）美國sigma

3、M-2128DMSO（二甲基亞砜）美國sigma67-68-5，Lot#67-68-5CCK-8上海貝博BB-4202-2，BB150011 2. 實驗方法2.1試劑配制、抗體稀釋及53種化合物的溶解 DMEM培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基粉末溶于1L經0.22µm孔徑濾膜過濾后的超純水中，用NaHCO3調PH值至7.2-7.6之間。10%血清完全培養(yǎng)基：10ml的胎牛血清加入90ml的DMEM培養(yǎng)基中，添加1ml的青-鏈霉素雙抗溶液。MTT溶液：稱取150mgMTT，溶于30ml未過濾的PBS中，用0.22 m的濾膜過濾后待用。53種化合物的濃溶液：10mg化合物加入200l DMSO溶解

4、，再加9.80 ml完全培養(yǎng)基配成終濃度為1mg/ml的化合物濃溶液（有些化合物200l DMSO不能溶解，具體DMSO用量見結果與分析）。凍存液：6ml無血清培養(yǎng)基中加入3ml胎牛血清和1ml DMSO（培養(yǎng)基：血清：DMSO=6:3:1）。2.2 Hela細胞、Eca-706細胞、PC-12細胞培養(yǎng)基本操作方法2.2.1細胞復蘇1、從液氮中取出凍存的細胞，立刻置于37水浴鍋中快速晃動凍存管使細胞快速解凍；2、將細胞轉移至15ml離心管中，1000rpm，6min離心后，棄培養(yǎng)基；3、用DMEM完全培養(yǎng)基 1ml重懸細胞，并接種到25ml培養(yǎng)瓶中；4、顯微鏡下觀察細胞密度合適并且無細胞聚團后

5、，置于37，飽和濕度，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.2.2細胞傳代1、觀察培養(yǎng)瓶中細胞貼壁融合達90%時，即可進行細胞的傳代2、開啟生物安全柜紫外消毒30min，以75%乙醇擦拭臺面滅菌，并預先準備細胞培養(yǎng)瓶、15ml離心管、無菌過濾的PBS、0.25%胰酶溶液、DMEM完全培養(yǎng)基，3、取出長滿細胞的培養(yǎng)瓶，倒空瓶中的培養(yǎng)基，加入2ml過濾滅菌的PBS緩沖液反復沖洗2遍，倒空PBS緩沖液，每瓶中加入1ml的0.25%的胰酶溶液，使胰酶溶液平鋪在細胞層面上，緩緩搖動細胞培養(yǎng)瓶，待細胞70%脫落時加入1ml的DMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶的消化作用，并用1ml移液器反復沖洗培養(yǎng)瓶底將未脫落的細胞沖洗

6、下來，轉移液體至15ml的離心管中，1800rpm離心5min，小心吸棄離心管中的液體，并用1ml的完全培養(yǎng)基重懸沉淀的細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞調整合適的細胞密度接種到培養(yǎng)瓶中于37，飽和濕度，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.2.3細胞凍存1、消化、離心步驟同細胞傳代；2、離心后棄去培養(yǎng)基，加入1ml的細胞凍存液重懸混勻后移至2ml的凍存管中；3、凍存管中細胞經4（30min）、-20（30min）、-80（過夜）的程序降溫后，轉移至液氮中凍存。2.3 MTT法對53種化合物的篩查實驗2.3.1 Hela細胞、Eca-706細胞、PC-12細胞的接種1、消化、離心、重懸的步驟同細胞傳代；2、

7、取50l細胞懸液用于細胞計數板進行計數，計數后調整細胞濃度至1 ×105個/ml待用；3、將細胞接種到96孔板中，接種Hela和PC-12細胞時每孔加50 l細胞懸液（5000個細胞/孔），接種Eca-706時每孔加100 l細胞懸液（10000個細胞/孔），每孔用完全培養(yǎng)基補加至200 l，邊緣孔用200l無菌PBS進行填充。 4、將接種好的細胞放入37，飽和濕度，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.3.2 Hela細胞、Eca-706細胞、PC-12細胞的饑餓處理1、顯微鏡下觀察待96孔板中的細胞鋪至孔底約50%時開始進行饑餓處理（其中Hela和Eca-706細胞培養(yǎng)24h，PC-1

8、2細胞培養(yǎng)約65h）；2、具體操作步驟：先棄去96孔板中的DMEM完全培養(yǎng)基，用無菌PBS洗去殘留的培養(yǎng)基后，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，放入37，飽和濕度，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.3.3 對Hela細胞、Eca-706細胞、PC-12細胞分別進行化合物處理1、進行饑餓處理24h以后，在顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)；2、加入濃度梯度的化合物，每種化合物設置6個濃度梯度3個重復，所配化合物原濃度為1mg/ml，設置的6個濃度梯度分別為20g/ml、10g/ml、5g/ml、2.5g/ml、1.25g/ml、0.625g/ml；3、陽性對照：順鉑（順鉑的6個濃度梯度同化合物相同）空白對照：只

9、加含化合物培養(yǎng)基陰性對照：加完全培養(yǎng)基和細胞4、37，飽和濕度，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，顯微鏡下觀察不同化合物對細胞的作用效果。2.3.4 MTT檢測1、對上述化合物處理后的細胞每孔加入20l MTT溶液（終濃度0.5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)放入37，飽和濕度，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育；2、孵育4h后，棄掉上清，每孔加入150 l DMSO，并在調速多用振蕩器上低速震蕩10min使結晶充分溶解（甲瓚）；3、酶標儀檢測490nm吸光值，并記錄數據。2.3.5 利用CCK-8做出Hela細胞、Eca-706細胞、PC-12細胞的生長曲線1、接種細胞：Hela細胞、Eca-

10、706細胞、PC-12細胞的分別接種4000個/孔、5000個/孔、5000個/孔，每組5個重復，共8個時間點，每孔用完全培養(yǎng)基補至200 l體系，放入37，飽和濕度，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。2、饑餓處理接種細胞培養(yǎng)24h后，饑餓處理24h，之后更換完全培養(yǎng)基，開始計時0h；3、分別在1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h加入cck-8 20l進行檢測（加入CCK-8后3h分別檢測450nm波長吸光值），并記錄數據。二、結果與分析1、化合物的溶解情況1.1 化合物溶解方法化合物使用含有1/ 50 DMSO的完全培養(yǎng)基來溶解，對不溶或溶解不完全的化合物加大DMSO用量

11、溶解，DMSO的使用情況見表2：表2：DMSO體積化合物1倍體積DMSOXG-1，XG-2,XG-3,XG-4，XG-5,XG-12，XG-13，XG-16，XG-21，HCC-1，HCC-8，HCC-10，HCC-11，LY-1，LY-2，LY-4，LY-5，LY-7，LY-9，LY-10，LY-11,ZL-1，ZL-32倍體積DMSOXG-9，XG-10，XG-15，XG-19，XG-20，XG-22HCC-2，HCC-3，HCC-6，HCC-9，LY-3，LY-8，ZL-2，ZL-4，ZL-5，ZL-63倍體積DMSOXG-6,XG-7,XG-8，XG-11，XG-14，XG-17,XG

12、-18，HCC-4，HCC-5，HCC-7LY-6，ZL-84倍體積DMSOHCC-12，ZL-71.2 藥物溶解后的狀態(tài)統(tǒng)計見表3表3溶解狀態(tài)化合物完全溶解LY-11，HCC-8乳狀/絮狀XG-1，XG-2，XG-4，XG-6，XG-7，XG-8，XG-9，XG-10，XG-11，XG-12，XG-13，XG-14，XG-15， XG-17，XG-18，XG-19，XG-20，XG-21，XG-22HCC-2，HCC-3，HCC-4，HCC-5，HCC-6，HCC-7，HCC-9，HCC-10，HCC-11，HCC-12，LY-1，LY-2，LY-3，LY-4，LY-5，LY-6，LY-7，

13、LY-8，LY-10，ZL-2，ZL-3，ZL-4，ZL-5，ZL-6，ZL-7，ZL-8析出晶體XG-3，XG-5，XG-16,LY-9，HCC-1，ZL-1圖1：藥物溶解狀態(tài)圖2、Hela細胞、Eca-706細胞、PC-12細胞化合物處理 Eca-706、PC-12、Hela細胞經化合物處理前后分別在50倍下顯微鏡下觀察，化合物處理前細胞分布均勻，形態(tài)均一；化合物處理后，與陰性對照組對比，部分化合物組細胞形態(tài)隨著濃度梯度的增加，懸浮細胞數目增加，孔內整體細胞數目減少。圖2：如圖所示從左到右分別是：Eca-706、PC-12、Hela細胞化合物處理前50倍顯微鏡下圖片圖3：不同濃度化合物LY

14、-2對Hela細胞處理24h后的50倍顯微鏡下的細胞形態(tài)圖圖4：不同化合物處理后MTT檢測圖5：不同濃度化合物XG-10對Eca-706細胞處理24h后的50倍顯微鏡下的細胞形態(tài)圖6：不同化合物處理后MTT檢測圖7：不同濃度化合物XG-16對PC-12細胞處理24h后的50倍顯微鏡下的細胞形態(tài)圖8：不同化合物處理后MTT檢測3、化合物對不同腫瘤細胞的IC503.1 hela細胞不同化合物對hela細胞的IC50（濃度單位：g/ml）化合物IC50化合物IC50化合物IC50HCC-17.311LY-113.328XG-18.043HCC-20.024LY-212.270XG-25.238HCC

15、-30.286LY-30.387XG-33.037HCC-430.920LY-40.087XG-51.091HCC-58.143LY-50.356XG-628.580HCC-66.183LY-65.727XG-788.660HCC-720.120LY-83.761XG-81.898HCC-84.471LY-96.184XG-93.849HCC-90.813LY-104.550XG-100.039HCC-103.695LY-110.813XG-110.627HCC-110.193XG-120.206HCC-1233.520XG-147.290ZL-2XG-150.617ZL-3XG-1611.3

16、40ZL-4XG-177.020ZL-5a XG-180.109ZL-6XG-195.253ZL-7XG-202.129ZL-8XG-219.880順鉑47.730XG-225.5803.2 PC-12細胞不同化合物對PC-12細胞的IC50（濃度單位：g/ml）化合物IC50化合物IC50化合物IC50HCC-157.19LY-131.91XG-1274.7HCC-21.353LY-290.82XG-26.953HCC-31.776LY-326.58XG-37.768HCC-4LY-4XG-49.815HCC-5LY-53.995XG-5HCC-6LY-63.750XG-6HCC-7LY-7

17、67.93XG-7HCC-8LY-834.31XG-82.953HCC-9LY-9XG-918.55HCC-10-LY-10XG-101.657HCC-115.396LY-11XG-112.469HCC-1258.57XG-122.663ZL-2540.3XG-130.3845ZL-3XG-1416.61ZL-40.2025XG-159.320ZL-529.55XG-162.391ZL-6XG-17ZL-7XG-187.117ZL-8XG-190.5801順鉑XG-20XG-21XG-223.3 Eca-706細胞不同化合物對Eca-706細胞的IC50（濃度單位：g/ml）化合物IC50化合物IC50化合物IC50HCC-1LY-121.1XG-1HCC-21.850LY-2176.4XG-219.87HCC-33.733LY-3XG-320.22HCC-4LY-4XG-48.751HCC-527.4LY-56.986XG-524.16HCC-6109.1LY-65.120XG-622.75HCC-70.1228LY-7XG-722.13HCC-8LY-8XG-80.1618HCC-9L