細(xì)胞工程復(fù)習(xí)重點(diǎn)

1、思 考 題1細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的基本組成與要求是什么？一、實(shí)驗(yàn)室組成（1）基本實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備室/化學(xué)實(shí)驗(yàn)室功能： 就是進(jìn)行一切與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的準(zhǔn)備工作要求： 寬敞明亮，通風(fēng)條件好 ，地面便于清潔并應(yīng)防滑處理。接種室/無菌操作室功能： 是進(jìn)行接種、繼代、細(xì)胞融合等無菌操作的場(chǎng)所。要求： 封閉性好，干燥清潔明亮， 防止空氣對(duì)流。外應(yīng)設(shè)緩沖室、更衣室，防止微生物感染。培養(yǎng)室功能： 是對(duì)接種到培養(yǎng)瓶的離體材料進(jìn)行控制培養(yǎng)的場(chǎng)所。要求： 是要能控制光照和溫度，應(yīng)保持干燥和清潔。（2）輔助實(shí)驗(yàn)室 根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)需求而定。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室生化分析室攝影室及暗室（3.） 移栽設(shè)施/溫室要求：配置人工光源并且能夠控制室內(nèi)溫度，

2、為試管苗的正常生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境。2外植體消毒的基本方法是什么？ 3無菌操作在植物離體培養(yǎng)中的作用是什么？4. 配制培養(yǎng)基時(shí)，加入一定量的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，它們?cè)陔x體培養(yǎng)過程中有哪些作用? 激素調(diào)控的一般規(guī)律是什么？植物激素或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（ growth regulators）包括：Ø 生長(zhǎng)素類Ø 細(xì)胞分裂素類(CTK)Ø 赤霉素類 (GA)Ø 乙烯（ Eth)Ø 脫落酸(ABA)§ 其中前三者為正向激素，后兩者則為負(fù)向激素。常用的主要有生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類兩大類。§生長(zhǎng)素類（ auxin）： 在作用或結(jié)構(gòu)上類似于吲哚乙酸的

3、一類物質(zhì)的統(tǒng)稱。生長(zhǎng)素是最早發(fā)現(xiàn)的植物激素。作用： 誘導(dǎo)愈傷組織形成，促進(jìn)細(xì)胞的分裂和伸長(zhǎng)，誘導(dǎo)根原基的發(fā)生和根系的生成，有調(diào)運(yùn)養(yǎng)分的效應(yīng)。使用濃度0.110mg/L。常用的生長(zhǎng)素有:吲哚乙酸 (IAA)、2， 4，二氯苯氧乙酸 (2,4-D) Ø吲哚丁酸 (IBA) 奈乙酸 (NAA)Ø細(xì)胞分裂素類(cytokinin,CTK) ： 是一類促進(jìn)細(xì)胞分裂的植物激素，細(xì)胞分裂素都為腺嘌呤的衍生物。作用： 促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，誘導(dǎo)不定芽的形成，促進(jìn)胚狀體的發(fā)育，延緩組織的衰老，打破頂端優(yōu)勢(shì)，有利于芽的增殖，常用于繼代和增殖培養(yǎng)。使用濃度0.110mg/L。常用的細(xì)胞分裂素有：&

4、#216;激動(dòng)素 (KT) Ø6-芐基腺嘌呤 (6-BA/BAP) Ø玉米素 （ ZT）異戊烯氨基嘌呤 (2-ip) Ø噻重氮苯基脲 （ TDZ） 5. 常用的植物細(xì)胞培養(yǎng)基種類有哪些？各有什么特點(diǎn)?MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽含量較高，微量元素種類較全，濃度也高。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，離子平衡性較好，具較強(qiáng)的緩沖能力，培養(yǎng)過程中較穩(wěn)定，可滿足植物的營(yíng)養(yǎng)和生理需要。其中它的硝酸鹽含量較其它培養(yǎng)基為高。廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。6 培養(yǎng)基3和（4） 24 含量高，VB1含量高，不含鉬。目前在國(guó)內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水

5、稻及其它植物的花粉和花藥培養(yǎng)和組織培養(yǎng)。5培養(yǎng)基3含量高，有機(jī)物含量較高，但含有較低的銨，這可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用。從實(shí)踐得知有些植物在5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物H培養(yǎng)基大量元素約為1/2MS，微量元素減少但含量增加，維生素種類較多。用于多種植物的花藥、胚培養(yǎng)。hite 培養(yǎng)基特點(diǎn)：是無機(jī)鹽濃度較低，有機(jī)成分含量也相對(duì)較低。適于生根培養(yǎng)。-培養(yǎng)基有機(jī)成分較復(fù)雜。它包括了所有的單糖和維生素。廣泛用于原生質(zhì)體和融合體的培養(yǎng)。6簡(jiǎn)要說明MS培養(yǎng)基的基本組成。7. 配制培養(yǎng)基時(shí)，為什么要先配母液?如何配制母液?在組織培養(yǎng)工作中， 配制培養(yǎng)基是日常工作，為了簡(jiǎn)便起見，將培

6、養(yǎng)基配方中的藥品配成一定倍數(shù)的濃縮液，用時(shí)稀釋，這種濃縮液就是母液貯備液。母液儲(chǔ)備液可一次稱量供一段時(shí)間使用， 簡(jiǎn)單方便，不僅可以提高培養(yǎng)基中微量成份稱量的準(zhǔn)確性， 還可以減少工作量，提高效率。§ 母液貯備液的配制要求ü大量元素母液配制： 10x， 20x， 50xü微量元素母液配制： 1000xü鐵鹽母液配制： 100x或200x , 分別溶解EDTA-Na2 與FeSO4· 4H2O，再充分混勻，貯存在棕色瓶中ü有機(jī)母液配制：可以分別配制100200X，也可以混在一起配制ü肌醇一般單獨(dú)配置成100x。ü生長(zhǎng)調(diào)節(jié)

7、物質(zhì)配制：分別單獨(dú)配制成母液，儲(chǔ)存于冰箱。一般濃度為0.11 mgml。并注意不同激素需加入不同助溶劑8. 如何判斷配制好的培養(yǎng)基是否良好？9. 植物培養(yǎng)基和微生物培養(yǎng)基有什么不同？第三章1植物細(xì)胞全能性的含義是什么？其實(shí)現(xiàn)的途徑是什么？每個(gè)植物生活細(xì)胞無論是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞，均具有該物種全部的遺傳信息。每個(gè)植物生活細(xì)胞均具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。細(xì)胞全能性僅是一種能力或可能性，不是所有具有全能性的細(xì)胞都能進(jìn)行全能性的表達(dá)。離體培養(yǎng)條件下，植物體細(xì)胞、性細(xì)胞、原生質(zhì)體、經(jīng)過遺傳信息修飾的細(xì)胞都可能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞全能性2什么是細(xì)胞脫分化和再分化？其實(shí)現(xiàn)的條件是什么？脫分化（ dedifferen

8、tiation） ： 培養(yǎng)條件下使一個(gè)已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過程。再分化（ Redifferentiation）： 脫分化后的分生細(xì)胞在特定的條件下，重新回復(fù)細(xì)胞分化能力，形成各種不同類型的細(xì)胞，并經(jīng)歷器官發(fā)生或胚胎發(fā)生，進(jìn)一步發(fā)育成完整植物體的過程細(xì)胞脫分化的條件： 創(chuàng)傷、外源激素。3什么是器官發(fā)生，器官發(fā)生的方式有幾種？各有什么特點(diǎn)？直接和間接器官發(fā)生的區(qū)別是什么？器官發(fā)生：是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定芽（ adventitious buds）、不定根（ adventitious roots）等器官的過程5. 器官發(fā)生的影響因素有哪些？1、

9、起始材料ü母體植株的遺傳基礎(chǔ)ü外植體的類型ü生理狀態(tài)、取材方式等2、培養(yǎng)基成分激素（ Skoog-Miller模式）、有機(jī)及無機(jī)成分3、培養(yǎng)條件光照、溫度、濕度等6體細(xì)胞胚的概念、含義及特點(diǎn)是什么？體細(xì)胞胚(somatic embryo)或胚狀體（ embryoid） ：離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)生和發(fā)育過程所形成的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞）體細(xì)胞胚的含義：Ø在離體培養(yǎng)范圍使用，以區(qū)別于無融合生殖胚；Ø體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，以區(qū)別于合子胚；Ø體細(xì)胞經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程，以區(qū)別與離體培養(yǎng)中器官發(fā)生

10、形成個(gè)體的途徑體細(xì)胞胚發(fā)生的特點(diǎn)Ø 具有明顯的雙極性： 即在發(fā)育的早期階段，從其方向相反的兩端分化出莖端和根端，具有根、芽?jī)蓸O分化的特性；Ø 存在生理隔離現(xiàn)象：胚狀體與母體組織或與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的直接聯(lián)系，處于相對(duì)獨(dú)立的狀態(tài)；Ø遺傳的相對(duì)穩(wěn)定性：?jiǎn)渭?xì)胞起源；發(fā)生數(shù)量大， 增殖率高：可再生次級(jí)胚7體細(xì)胞胚發(fā)育的過程是什么？它和器官發(fā)生形成的芽、合子胚有什么區(qū)別？8什么是胚性和非胚性愈傷組織？9外源激素對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生有什么影響？生長(zhǎng)素是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的主導(dǎo)因子。 體細(xì)胞胚胎發(fā)生中，外源生長(zhǎng)素的使用規(guī)律，在大多數(shù)植物中是相似的。誘導(dǎo)愈傷組織或胚性愈傷組織，

11、均需要高濃度的生長(zhǎng)素；當(dāng)球型胚形成后，則需要降低生長(zhǎng)素水平才能完成體細(xì)胞胚的繼續(xù)發(fā)育；生長(zhǎng)素的這一應(yīng)用規(guī)律與胚胎發(fā)育過程中內(nèi)源激素的變化是一致的10如何進(jìn)行愈傷組織的繼代培養(yǎng)？多次繼代培養(yǎng)的愈傷組織其分化能力如何？為什么？愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，保持其的旺盛分裂能力、均一的細(xì)胞群體，避其死亡，必須進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)時(shí)期：旺盛分裂時(shí)期；培養(yǎng)方法：分割成小塊，約5mm3大??；培養(yǎng)方式： 固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)。培養(yǎng)基： 與初代培養(yǎng)相同，或適當(dāng)降低激素濃度或調(diào)控激素比例。愈傷組織形態(tài)發(fā)生潛力的喪失u原因： 生理學(xué)說： 培養(yǎng)組織或細(xì)胞中的內(nèi)源激素失衡。遺傳學(xué)說： 遺傳物質(zhì)在培養(yǎng)繼代過程中

12、由于變異等原因而發(fā)生了改變或是突變。競(jìng)爭(zhēng)學(xué)說： 細(xì)胞對(duì)于生長(zhǎng)素抑制全能性表達(dá)的作用變得比較敏感；反復(fù)的繼代培養(yǎng)中，非胚性細(xì)胞的群體將會(huì)逐步增加，而胚性成分則逐漸減少。11.人工種子的概念及其結(jié)構(gòu)。人工種子又稱合成種子 （synthetic seeds）或體細(xì)胞種子 （somatic seeds）：是指將植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的體細(xì)胞胚，或能發(fā)育成完整植株的分生組織（ 不定芽、愈傷組織、胚狀體、原球莖、小鱗莖、微型薯等）包埋在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和具有保護(hù)功能的外殼形成的適宜條件下能夠發(fā)芽出苗的顆粒體。12.人工種子研制有什么意義？如何看待人工種子的發(fā)展前景及面臨的困難？人工種子的研制意義（ 1）人工種子能

13、代替試管苗快速繁殖，開創(chuàng)了種苗生產(chǎn)的又一新途徑。與試管苗相比是一種高效快速的繁殖方法，避免移栽困難，易于實(shí)現(xiàn)機(jī)械化操作，便于儲(chǔ)運(yùn)。（ 2）對(duì)優(yōu)異雜種種子、自然條件下不結(jié)實(shí)或制種困難的植物可以不通過有性制種而快速獲得大量種子。（ 3）在人工種子的包裹材料里加入各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、菌肥、農(nóng)藥等，可人為地影響控制作物生長(zhǎng)發(fā)育和抗性。人工種子存在的問題l 許多重要植物還不能培養(yǎng)出大量的高質(zhì)量的體細(xì)胞胚。l 現(xiàn)有的人工胚乳和種皮還不夠理想， 不能有效地防止微生物的腐蝕。l 人工種子的貯藏有待進(jìn)一步完善。l 人工種子的成本遠(yuǎn)高于自然種子發(fā)展前景人工種子的發(fā)展前景是客觀的它將是農(nóng)業(yè)中一種革命性的繁殖系統(tǒng)，相信

14、該技術(shù)會(huì)得到逐步完善，建立多種模式來研制人工種子，并逐步擴(kuò)大應(yīng)用范圍。第四章1.離體快速繁殖一般可分為哪幾個(gè)階段？簡(jiǎn)述其操作的一般程序。繁殖過程劃分為四個(gè)階段無菌培養(yǎng)物的建立（ stage1）程 序：外植體的選擇、消毒、接種和培養(yǎng)增殖培養(yǎng)（ stage2）方 法：反復(fù)進(jìn)行、連續(xù)的培養(yǎng)試管苗生根（ stage3）方法： 降低或去除細(xì)胞分裂素，增加碳源。植物類型不同，壯苗培養(yǎng)時(shí)可以以單個(gè)的枝或叢狀的芽苗進(jìn)行。試管苗的移植（ stage4）移栽的一般步驟：1） .開瓶鍛煉：放在較強(qiáng)光照條件下或溫室中，打開瓶口，鍛煉12周左右；2） .試管苗就可以從培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)取出，小心的洗去根上附著的培養(yǎng)基，移栽進(jìn)合適

15、的基質(zhì)中；3） .精心管理，直至成活；4） .進(jìn)一步培育成商品苗。2. 快速繁殖中，培養(yǎng)物的增殖途徑有哪幾種?各有何特點(diǎn)？（1）、腋生枝型以頂芽和腋芽發(fā)育進(jìn)行增殖的特點(diǎn)：利用外植體上已有的芽分生組織，促使其萌發(fā)形成枝條或芽， 方法簡(jiǎn)單，能高度保持遺傳穩(wěn)定性，繁殖速度較慢。適用于絕大多數(shù)植物的繁殖，對(duì)具有特殊觀賞價(jià)值的嵌合體(chimera)園藝植物來說，也是唯一能夠保持其原有嵌合特性的繁殖途徑。（2）、不定芽型不定芽增殖的特直接分化途徑產(chǎn)生的不定芽：遺傳穩(wěn)定、繁殖速度較快間接分化途徑產(chǎn)生的不定芽：容易產(chǎn)生變異點(diǎn)：利用不定芽增殖對(duì)于繁殖園藝上的嵌合體（ chimera）植物來說，容易引起嵌合體的

16、分離。3、體細(xì)胞胚（ somatic embryo）型特 點(diǎn)：最理想的繁殖方式，增殖系數(shù)高；遺傳相對(duì)穩(wěn)定；具有雙極性結(jié)構(gòu)，可以免去生根步驟；有利于實(shí)行機(jī)械化操作。目前只有少數(shù)植物能產(chǎn)生胚狀體，再生植株有返幼特性3.試管苗有什么特點(diǎn)？試管苗的特點(diǎn)Ø葉的特點(diǎn) ： 葉面積較小，功能不全，易失水，合作用能力低。Ø根的特點(diǎn) ： 無根或生根率低，根與莖輸導(dǎo)組織不相通，根吸收功能低。Ø莖的特點(diǎn)： 有的植物莖的輸導(dǎo)組織發(fā)育也不完善，木質(zhì)化程度低。Ø光合作用能力： 增殖階段，試管苗基本處于異養(yǎng)狀態(tài)，很少或不進(jìn)行光合作用；生根階段，異養(yǎng)兼自養(yǎng)。4.外植體選擇應(yīng)注意哪些問題？

17、供體植株的基因型： 遺傳性狀是否優(yōu)良？培養(yǎng)難易？實(shí)用價(jià)值？Ø外植體類型： 取材難易？再生難易？遺傳變異？Ø增殖類型： 誘導(dǎo)的難易？繁殖速度？遺傳穩(wěn)定性？5.植物離體快速無性繁殖有什么特點(diǎn)？主要適用于哪些植物類型？起始材料少，生長(zhǎng)周期短、繁殖速度“快” ，每年以數(shù)萬倍乃至數(shù)百萬倍的速度進(jìn)行繁殖，不受自然條件干擾，實(shí)現(xiàn)工廠化育苗；p生產(chǎn)無病毒種苗，防止品種退化； 體積微小、不攜帶病原菌，便于儲(chǔ)運(yùn)和種質(zhì)材料交換，減少病蟲害的傳播；能夠有效地保持優(yōu)良品種的特性，使原來難以通過無性繁殖的植株進(jìn)行無性繁p殖。已廣泛應(yīng)用于花卉、 蔬菜、 果樹、藥材和林木的種苗生產(chǎn)。6.防治植物病毒病有哪

18、些方法？物理方法： X射線、紫外線、超短波、高溫?zé)崽幚淼取ｂg化病毒，從而達(dá)到抑制病毒蔓延的目的。化學(xué)方法：采用化學(xué)抑制劑，干擾病毒在植物體內(nèi)的復(fù)制。生物學(xué)方法：選用抗病毒品種、采用種子繁殖或莖尖培養(yǎng)等方法。7.簡(jiǎn)述莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒的一般方法。（1）供體植株的選擇和預(yù)處理供體植株的選擇： 了解植物病毒種類及分布，確定莖尖大小，材料的典型性，外植體健康程度等。預(yù)處理： 莖尖培養(yǎng)可與熱處理、化學(xué)療法相結(jié)合。（2）莖尖組織的分離頂芽、側(cè)芽等表面消毒解剖鏡下無菌操作去除幼葉、葉原基切取含1-2個(gè)葉原基的生長(zhǎng)點(diǎn)（ 0.10.2mm） 即刻轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基。（3）莖尖分生組織的培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基有MS、 Whi

19、te、 Morel、農(nóng)事場(chǎng)、革新等配方8.影響莖尖分生組織培養(yǎng)去除病毒的因素都有哪些?9.病毒檢測(cè)的方法？1、 指示植物鑒定法2、血清學(xué)鑒定法3、電子顯微鏡檢查法4、分子檢測(cè)法10.如何進(jìn)行無病毒苗的保存和繁殖？第五章 植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)1.植物單細(xì)胞培養(yǎng)的方法有哪些？1、平板培養(yǎng)（ plating culture）2、懸浮培養(yǎng)（ suspension culture）3、看護(hù)培養(yǎng)（ nursing culture）4、微室培養(yǎng)（ micro-chamber culture）5、飼養(yǎng)層培養(yǎng)（ feeder layer culture）2.一個(gè)好的懸浮細(xì)胞系有哪些特征？Ø

20、分散性良好：懸浮培養(yǎng)液中的細(xì)胞團(tuán)較小。Ø 均一性好：細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。Ø 細(xì)胞生長(zhǎng)迅速：細(xì)胞生長(zhǎng)量一般23d甚至更短時(shí)間便可增加一倍3. 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)系統(tǒng)？各有什么特點(diǎn)？1、分批培養(yǎng)培養(yǎng)系統(tǒng)封閉，只允許氣體和揮發(fā)性代謝物質(zhì)與外界交換；ü培養(yǎng)基體積固定，當(dāng)其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí)，細(xì)胞即停止生長(zhǎng)；ü為使成批培養(yǎng)的細(xì)胞不斷增殖，必須在懸浮培養(yǎng)液達(dá)最大重量時(shí)盡快進(jìn)行繼代培養(yǎng)；ü用適當(dāng)?shù)臄嚢璺椒ㄊ褂坞x細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)在培養(yǎng)液中均勻分布；操作簡(jiǎn)單，可直接放大。ü 2、連續(xù)培養(yǎng)通過調(diào)節(jié)流入和流出培養(yǎng)液的速度可使培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)速

21、度相對(duì)一致，形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)狀態(tài)，使細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一直有細(xì)胞收獲，但濃度不高，細(xì)胞分裂快，易變異，開放式的培養(yǎng)易造成污染，對(duì)設(shè)備復(fù)雜，技術(shù)要求較高。4. 植物細(xì)胞固定化的常用方法有哪些？為什么說植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)更有利于次生生物的生成？按照其支持物不同可分為兩類包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：常用的支持物有瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、膠原蛋白、聚丙烯酰胺等；附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。5. 培養(yǎng)條件下植物細(xì)胞生長(zhǎng)與次生產(chǎn)物合成的關(guān)系有哪幾類？生長(zhǎng)偶聯(lián)型： 產(chǎn)物合成發(fā)生在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，到達(dá)靜止期后合成停止。Ø非生長(zhǎng)偶聯(lián)型： 產(chǎn)物合成出現(xiàn)在細(xì)胞生長(zhǎng)

22、停止時(shí)。Ø中間型： 產(chǎn)物合成出現(xiàn)在細(xì)胞生長(zhǎng)開始下降時(shí)合成，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或停止生長(zhǎng)期時(shí)產(chǎn)物都不合成。6.影響植物次生產(chǎn)物合成的因素有哪些？通過哪些途徑可以提高植物培養(yǎng)細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量？細(xì)胞系： 選擇穩(wěn)定高產(chǎn)的細(xì)胞系。培養(yǎng)工藝：誘導(dǎo)子的添加、前體飼喂、添加競(jìng)爭(zhēng)途徑代謝產(chǎn)物抑制劑、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化與控制等。培養(yǎng)技術(shù)： 固定化培養(yǎng)技術(shù)、兩步培養(yǎng)法、兩相培養(yǎng)技術(shù)。 培養(yǎng)設(shè)備： 選擇或設(shè)計(jì)合適的生物反應(yīng)器。第六章 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交1. 原生質(zhì)體、亞原生質(zhì)體、核質(zhì)體、胞質(zhì)體的概念。原生質(zhì)體(protoplast) ：去掉細(xì)胞壁的細(xì)胞或是由質(zhì)膜包裹的具有生活力的裸露細(xì)胞。

23、亞原生質(zhì)體(subprotoplast)： 在原生質(zhì)體分離過程中，有時(shí)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)含物的斷裂而形成一些較小的原生質(zhì)體，它可以具有細(xì)胞核或沒有細(xì)胞核。核質(zhì)體(nuclearplast)： 由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體。胞質(zhì)體（ cytoplast） ： 不含細(xì)胞核而僅含有部分細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體2. 原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法。3. 為什么原生質(zhì)體要培養(yǎng)在等滲培養(yǎng)基中？培養(yǎng)過程中如何管理？原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中的管理及時(shí)添加新鮮培養(yǎng)基Ø 逐步降低培養(yǎng)基的滲透壓Ø 及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)基中的激素成份4. 影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素有哪些？（1）、原生質(zhì)體的活力（2、）原生質(zhì)體的起始

24、密度（3、）原生質(zhì)體的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境（4、）基因型5. 細(xì)胞融合有哪幾類？（1）自發(fā)融合（ spontaneous fusion） ：去壁后的同種原生質(zhì)體之間常發(fā)生融合形成同核體，頻率一般在830%之間。它是由于不同細(xì)胞間胞間連絲的擴(kuò)展和粘聯(lián)造成的，不屬于細(xì)胞雜交的范疇。（2）誘導(dǎo)融合：過人工誘導(dǎo)的方式，使不同來源的原生質(zhì)體之間發(fā)生融合，形成異核體.6. 簡(jiǎn)述PEG融合與電融合的原理及各自特點(diǎn)。PEG的作用機(jī)理：PEG分子具有輕微的負(fù)極性，可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果使原生質(zhì)體發(fā)生粘連。在洗脫過程中， PEG將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷

25、重排。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的重排隊(duì)導(dǎo)致一個(gè)原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合。PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：q融合成本低，勿需特殊設(shè)備；q異核率較高， 可重復(fù)性強(qiáng)；qPEG誘導(dǎo)的融合過程不受物種限制；q毒性低。缺點(diǎn)：q融合過程繁瑣；q一些植物種原生質(zhì)體質(zhì)膜性質(zhì)強(qiáng)弱不一,常出現(xiàn)對(duì)PEG敏感,而破碎的現(xiàn)象；qPEG的分子量大小,濃度高低的使用不當(dāng)也可影響融合的效果電融原理：q當(dāng)原生質(zhì)體處于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，通電后電流即通過原生質(zhì)體，在非均勻的交變電場(chǎng)中時(shí)，發(fā)生雙向電泳而進(jìn)入電場(chǎng)反應(yīng)強(qiáng)的區(qū)域，同時(shí)，原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下，發(fā)生極化而產(chǎn)生偶極子，使原生質(zhì)體沿電場(chǎng)線

26、運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞緊密接觸排列成串；然后給予短暫的高壓脈沖，導(dǎo)致接觸面的細(xì)胞膜擊穿，隨后緊密接觸的細(xì)胞膜發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞融合。為了穩(wěn)定這個(gè)過程，在短期內(nèi)需要施加交流電壓。（ 2）電融合的優(yōu)點(diǎn)：ü不存在對(duì)原生質(zhì)體的毒害問題；ü融合效率高，重復(fù)性好，融合率達(dá)60以上；ü融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便，對(duì)融合原生質(zhì)體數(shù)易于控制等。 7. 原生質(zhì)體融合的基本過程是什么？膜融合、胞質(zhì)融合和核融合8. 雜種細(xì)胞的選擇方法有哪些？1. 細(xì)胞系互補(bǔ)選擇法2. 物理特性差異選擇法3. 生長(zhǎng)特性差異選擇法9. 體細(xì)胞雜種的鑒定方法有哪些？10. 什么是細(xì)胞質(zhì)雜種？胞質(zhì)雜種有什么作用？（三）細(xì)胞質(zhì)雜種（

27、cybrid）細(xì)胞質(zhì)雜種： 指具有一個(gè)親本的核，而細(xì)胞質(zhì)為雜合或另一親本的體細(xì)胞雜種。由以下途徑產(chǎn)生對(duì)稱融合： 融合后的某一階段一個(gè)親本的核或染色體被排除。不對(duì)稱融合： 使一個(gè)親本的核失活或去核。細(xì)胞質(zhì)雜種的意義：為核外遺傳物質(zhì)交流重組及研究核質(zhì)互作提供了機(jī)會(huì)。第七章 植物花藥和花粉培養(yǎng)及單倍體育種1通過離體培養(yǎng)獲得單倍體的途徑有哪些？花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)未授粉子房/胚珠培養(yǎng)2花藥培養(yǎng)中如何選擇外植體？（ 1）供體材料選擇：供試材料的遺傳背景：選擇易培養(yǎng)的材料、雜合性的材料。供試材料的生理狀態(tài)：開花期的早晚、生長(zhǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)等（ 2）花粉的發(fā)育時(shí)期選擇：只有花粉發(fā)育到一定時(shí)期對(duì)離體培養(yǎng)最敏感，才

28、可能被誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷或胚狀體。一般情況下，對(duì)大多數(shù)植物來說，在單核期的花粉比較容易培養(yǎng)成功。單核中晚期到有絲分裂期是最適培養(yǎng)時(shí)期。3花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)有什么不同？共同點(diǎn)： 培養(yǎng)目的相同，獲得單倍體植株。n不同點(diǎn)： 花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)；花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾，易于觀察雄核發(fā)育的全過程，技術(shù)更復(fù)雜4花藥培養(yǎng)過程中花藥為什么要經(jīng)過低溫處理？（1）降低了小孢子新陳代謝，延長(zhǎng)花粉的壽命,中斷正常的配子體發(fā)育，促進(jìn)花藥營(yíng)養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)運(yùn)；（2）低溫能改變紡錘絲的軸向, 破壞紡錘絲的微管蛋白而阻止紡錘絲形成，打破有絲分裂正常過程, 導(dǎo)致細(xì)胞分化；（3）阻止了細(xì)胞在預(yù)處理時(shí)的細(xì)胞周期，一

29、旦培養(yǎng)在25度-28度下重新返回有絲分裂；（4）低溫、饑餓脅迫作用。5何謂花粉的二型性和E花粉？天然花粉群體（同一花藥）中，存在兩類不同的花粉。一類為正?；ǚ?，它們的細(xì)胞質(zhì)較濃，發(fā)育較一致，染色較深；另一類為異?；ǚ?，其特征是花粉體積較小，細(xì)胞質(zhì)較淡、染色較淺，發(fā)育遲緩 (Dunwell， 1992)。Sunderland等在研究花藥培養(yǎng)的發(fā)育途徑中發(fā)現(xiàn)后一類花粉具有雄核發(fā)育能力，形成花粉胚，因此稱為胚性花粉或E花粉6花粉植株的發(fā)生主要有哪些途徑？（1）培養(yǎng)初期小孢子的發(fā)育途徑1、小孢子的發(fā)育途徑2. 營(yíng)養(yǎng)核發(fā)育途徑3. 生殖核發(fā)育途徑4. 由生殖核、營(yíng)養(yǎng)核共同發(fā)育途徑（2、）培養(yǎng)晚期小孢子的

30、發(fā)育過程通過胚狀體形成花粉植株通過愈傷組織分化形成花粉植株7. 單倍體的特點(diǎn)是什么？體細(xì)胞染色體數(shù)減半；生長(zhǎng)發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減?。?雌、雄配子嚴(yán)重?cái)∮械牟荒苓M(jìn)入有性世代。8. 花藥培養(yǎng)的一般程序？（1.）材料準(zhǔn)備（2）.花藥接種及誘導(dǎo)培養(yǎng)（3.）分化培養(yǎng)（4）.生根、壯苗培養(yǎng)及馴化移植（5.）單倍體植株的鑒定及其二倍化第八章、植物胚胎培養(yǎng)1胚胎培養(yǎng)、胚培養(yǎng)、 “ 胚挽救” 的概念。胚培養(yǎng)（ embryo culture）：指在無菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來，置于培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。胚挽救” 技術(shù)：一些植物由于胚發(fā)育不良或中途敗育等生殖障礙，導(dǎo)致種子不能萌發(fā)；在遠(yuǎn)緣雜交中

31、， 雜種的不親和性，使雜種胚在發(fā)育過程中途敗育等；可以利用胚胎培養(yǎng)技術(shù)，分離發(fā)育不良的種子，或即將敗育前的種胚進(jìn)行培養(yǎng)，促使胚繼續(xù)發(fā)育至成熟，使雜交育種或遠(yuǎn)緣雜交獲得成功，這種技術(shù)稱為“胚挽救” 技術(shù)胚胎培養(yǎng)：對(duì)植物胚及胚器官（胚乳、胚珠、子房）的離體培養(yǎng)。2. 胚培養(yǎng)的類型有哪兩種？離體胚培養(yǎng)有什么意義？胚培養(yǎng)一般包括幼胚培養(yǎng)和成熟胚培養(yǎng)兩種方式。植物胚培養(yǎng)的意義（1、）用于胚的挽救（2、）打破種子的休眠，提早結(jié)實(shí)，縮短育種年限（3、）使生活力低下或無活力的種子萌發(fā)（4、）克服珠心胚的干擾，使植物合子胚正常發(fā)育（5、）種子活力的快速測(cè)定（6、）誘導(dǎo)胚性愈傷及建立高頻再生體系（7、）用于理論研

32、究3. 幼胚培養(yǎng)時(shí)胚的發(fā)育方式有哪幾種？各有何特點(diǎn)？（1、）胚性發(fā)育(embryonal development)/合子胚發(fā)育幼胚接種到培養(yǎng)基上以后，仍然按照在活體內(nèi)的發(fā)育方式發(fā)育，最后形成成熟胚，再按種子萌發(fā)途徑出苗形成完整植株。（2、）早熟萌發(fā)(precocious germination) 幼胚接種后，離體胚不繼續(xù)其胚性生長(zhǎng)，而是在培養(yǎng)基上迅速萌發(fā)成幼苗，通常稱之為早熟萌發(fā)。（3、）脫分化形成愈傷組織(callus)幼胚在離體培養(yǎng)中首先發(fā)生細(xì)胞增殖，形成愈傷組織。愈傷組織可分化為胚狀體或不定芽。4什么是早熟萌發(fā)？如何克服？幼胚早熟萌發(fā)：在含有無機(jī)鹽、 有機(jī)物和蔗糖的培養(yǎng)基上，離體培養(yǎng)的幼

33、胚越過正常胚胎發(fā)育階段， 在未達(dá)到生理和形態(tài)成熟的情況下， 萌發(fā)長(zhǎng)成幼苗， 稱早熟萌發(fā)。 早熟萌發(fā)成的幼苗往往畸形、細(xì)弱，甚至不能存活防止幼胚早熟萌發(fā)的方法： 提高培養(yǎng)基滲透壓胚齡越小要求的滲透壓（ 糖濃度） 越高；提高無機(jī)鹽濃度， 可加入適量的NaCl以提高滲透壓， 濃度一般為0 20 4， 超過0 8對(duì)胚有毒害作用；加人1 l5 5甘露醇提高滲透壓， 甘露醇可以部分地代替蔗糖， 使幼胚在等滲條件下繼續(xù)胚性發(fā)育ü5在實(shí)際操作中如何確定胚囊的發(fā)育時(shí)期？最好的辦法是根據(jù)胚囊發(fā)育時(shí)期和花粉發(fā)育時(shí)期的相關(guān)性來確定胚囊發(fā)育時(shí)期6植物胚乳有哪些類型？胚乳培養(yǎng)的最適宜時(shí)期是什么時(shí)間？胚乳培養(yǎng)有什

34、么作用和意義？被子植物胚乳按發(fā)育初期是否形成細(xì)胞壁可三種類型：A、核型胚乳（ nuclear type）B、細(xì)胞型胚乳（ cellular type）C、沼生目型胚乳（ helobial type）胚乳發(fā)育時(shí)期可分為：早期、旺盛生長(zhǎng)期和成熟期， 旺盛生長(zhǎng)期是取材的最佳時(shí)期。意義：（1）再生植株多為三倍體，產(chǎn)生無籽果實(shí)；（2）可以從胚乳愈傷中分離和篩選各種類型的非整倍體植株；Ø（3）研究胚和胚乳的關(guān)系及胚乳組織的功能；Ø（4）胚乳細(xì)胞是研究淀粉、蛋白質(zhì)和脂類天然產(chǎn)物代謝途徑的理想系統(tǒng)；Ø（5）胚乳培養(yǎng)再生植株證明了全能性理論7離體授粉、受精的意義是什么？簡(jiǎn)述其一般方

35、法?？朔h(yuǎn)源雜交不孕克服自交不親和性誘導(dǎo)單倍體植株用于花粉生理和受精生理的研究胚珠授粉方法哺育法：將胚珠表面先蘸滿有助于花粉發(fā)然后撒上花粉進(jìn)行培養(yǎng)。該法是解決胚珠存活率和花粉發(fā)芽、花粉發(fā)生矛盾時(shí)的做法。柱頭接近法：將花粉撒在本種植物的柱頭上，切下柱頭接種在培養(yǎng)基上，然后在柱頭周圍接種異種植物裸露胚珠，花粉在本種植物的柱頭哺育下發(fā)芽，花粉管伸長(zhǎng)并進(jìn)入胚珠受精。該法使解決花粉發(fā)芽和胚珠培養(yǎng)在培養(yǎng)基組成上發(fā)生矛盾時(shí)所采用的方法子房授粉方法：花粉涂抹法：毛筆粘取花粉，涂抹于柱頭，或在剝離子房時(shí)用柱頭直接粘取花粉后培養(yǎng)?；ǚ蹜乙鹤⑸浠蛞敕?：在子房壁或頂端切開一個(gè)小口，把花粉懸液用無菌微量注射器注入，

36、或引入子房，進(jìn)行培養(yǎng)。ü花粉懸液： 10-20mg/L硼酸+5蔗糖，每滴懸液含花粉100-300粒第九章 植物體細(xì)胞無性系變異及突變體篩選1體細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳變異有何特點(diǎn)？（1）、體細(xì)胞無性系變異的普遍性變異可發(fā)生在各種培養(yǎng)類型中；變異發(fā)生在各種植物的培養(yǎng)中。（2）、體細(xì)胞無性系變異的局限性與自然發(fā)生的變異、理化誘變的變異類型相似。表型上： 主要是植株形態(tài)、生長(zhǎng)勢(shì)、育性、某些抗性等性狀的變異；生理生化上： 容易出現(xiàn)同功酶譜、次生代謝的消長(zhǎng)等變異；遺傳上： 涉及單基因或多基因性狀、隱性或顯性突變。3、體細(xì)胞無性系變異的嵌合性嵌合性： 指同一有機(jī)體中同時(shí)存在有遺傳組成不同的細(xì)胞，它是組織

37、培養(yǎng)中常見的現(xiàn)象。2哪些因素會(huì)影響培養(yǎng)物的遺傳變異？1、供體植物供體植物倍性水平：正常二倍體的穩(wěn)定基因型：遺傳背景純合的穩(wěn)定外植體來源：分化程度高的易變異2、 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式培養(yǎng)方式、激素及其它附加成分均會(huì)誘導(dǎo)體細(xì)胞變異的發(fā)生。3、 繼代培養(yǎng)的時(shí)間及植株再生方式繼代時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞變異的幾率就越高；頂芽和腋芽的再生方式變異少，間接再生方式變異多。3從細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制上理解體細(xì)胞無性系變異的機(jī)制。細(xì)胞層次上：染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)的變異1、 DNA核內(nèi)重復(fù)復(fù)制： DNA在核內(nèi)重復(fù)復(fù)制，但不發(fā)生細(xì)胞分裂，其結(jié)果是染色體組數(shù)增加，形成同源多倍體。2、染色體斷裂與重組： 結(jié)果是在體細(xì)胞中出現(xiàn)染色體易位

38、、缺失、倒位等多種類型的結(jié)構(gòu)變異。3、非正常有絲分裂： 結(jié)果出現(xiàn)染色體的非整倍性變異分子層次上：點(diǎn)突變DNA 總量變異轉(zhuǎn)座因子的激活 DNA 甲基化變化細(xì)胞器DNA 的修飾4體細(xì)胞無性系變異的誘導(dǎo)和選擇方法。培養(yǎng)細(xì)胞的誘發(fā)變異誘變方法1）物理誘變2）化學(xué)誘變3）復(fù)合因子誘變4）轉(zhuǎn)座子插入誘變體細(xì)胞突變體的篩選方法（1）在田間從再生植株中選擇有用的細(xì)胞突變體通過田間觀察、考種來發(fā)現(xiàn)和選擇有用性狀的變異植株，是一種最簡(jiǎn)單、直接的方法。（2）在細(xì)胞水平利用選擇壓選擇有用的細(xì)胞突變體在細(xì)胞、愈傷組織或器官培養(yǎng)階段向培養(yǎng)基中加入選擇壓，從而選擇出有用的抗性細(xì)胞系。5體細(xì)胞無性系變異的應(yīng)用途徑。Ø

39、; 農(nóng)業(yè)上： 創(chuàng)造育種中間材料或直接篩選新品種；Ø 次生代謝物生產(chǎn)中： 高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選；Ø 理論研究中： 遺傳研究、發(fā)育生物學(xué)研究、生化代謝途徑研究1. 動(dòng)物細(xì)胞工程無菌操作的基本要點(diǎn)有哪些？1）紫外線只對(duì)能照射到的部位有消毒殺菌作用，故臺(tái)面上的物品不要放置過多或重疊放置；紫外線照射期間臺(tái)面上勿放置培養(yǎng)用品和培養(yǎng)用液等，以免受射線影響；紫外線對(duì)臺(tái)面流動(dòng)的空氣無意義，空氣的消毒靠超凈工作臺(tái)的空氣過濾裝置。（2）燒過的器械要冷卻后才能使用，如鑷子應(yīng)冷卻后才能夾取組織，否則可能造成組織細(xì)胞損傷；塑料、橡膠器件宜用75%酒精擦洗，勿將酒精接觸里面。膠塞、橡皮頭等過燈時(shí)時(shí)間要短，以

40、免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞。（3）已吸過培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管內(nèi)培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)等成分燒焦后會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，吸管再用時(shí)會(huì)將其帶如培養(yǎng)液中；（4）開啟、關(guān)閉長(zhǎng)有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時(shí)，火焰滅菌時(shí)間要短，防止因溫度過高燒死細(xì)胞；（5）進(jìn)行培養(yǎng)操作時(shí)，不要用手觸及已消毒物品，如不慎接觸，要用火焰燒灼或取備用品更換（6）吸取不同液體、處理不同的細(xì)胞要用不同的吸管，以避免液體間、細(xì)胞間的交叉污染。（7）面向操作野時(shí)勿大聲講話或咳嗽，以免噴出的唾沫把細(xì)菌等帶入工作臺(tái)面造成污染。（8）操作人員應(yīng)注意自身安全。（9）操作完畢后，清理物品，75%酒精擦洗臺(tái)面。2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分有哪些

41、，在離體培養(yǎng)中的作用是什么？動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求高葡萄糖、必需氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、微量元素、細(xì)胞生長(zhǎng)因子及激素、貼附因子等。1.葡萄糖： 碳水化合物是細(xì)胞生長(zhǎng)主要能量來源,其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分.主要有葡萄糖,核糖,脫氧核糖,丙酮酸鈉和醋酸等。細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。2、氨基酸：是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料。在培養(yǎng)基中添加至少12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細(xì)胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源，在

42、缺少谷氨酰胺時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡.3.維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。4.無機(jī)離子與微量元素：培養(yǎng)液中無機(jī)鹽的主要功能是幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡.此外,通過提供鈉,鉀和鈣離子,幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞膜功能.培養(yǎng)液的滲透壓是一個(gè)非常重要的因素, 細(xì)胞通?？赡褪?60mOsm/kg 320 mOsm/kg。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動(dòng).細(xì)胞生長(zhǎng)除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。 5、生長(zhǎng)因子和激素 已證實(shí)：各種激素、生長(zhǎng)因子對(duì)于維持細(xì)胞的功能、保持細(xì)

43、胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對(duì)許多細(xì)胞生長(zhǎng)有促生長(zhǎng)作用，如胰島素，它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對(duì)某一類細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用，如氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，泌乳素有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)作用等。 6 其它 水解乳蛋白、膠原是另外兩種較好的天然培養(yǎng)基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解產(chǎn)物，呈蛋黃色粉末狀，富含氨基酸。一般配制成05溶液，微酸性。膠原是從動(dòng)物真皮中提取的，具改善細(xì)胞表面特性促使其附著生長(zhǎng)的作用。3.常用的培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類有哪些？1天然培養(yǎng)基 血清：常用胎牛血清（FBS）、小牛血清（CS），一般濃度10。 雞血漿，雞胚浸出液：含纖維蛋白原和一

44、些營(yíng)養(yǎng)成分 水解乳蛋白 鼠尾膠原優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果良好。缺點(diǎn)：成分復(fù)雜，個(gè)體差異大，來源有限2、合成培養(yǎng)基人工合成培養(yǎng)基，常用如下 (1).MEM(minimum essential medium)細(xì)胞培養(yǎng)基系列 (2).DMEM（Dulbeccos modified Eagle medium)細(xì)胞培養(yǎng)基系列(3)RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列(4).M199細(xì)胞培養(yǎng)基系列 (7)F-10,F-12細(xì)胞培養(yǎng)基系列(8) DMEM-F123、無血清培養(yǎng)基 4.無血清培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)研究中有什么特殊意義？血清在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中有什么作用？使用無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn) (1）可避免血清批次間的質(zhì)量變動(dòng)

45、，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性。（2）避免血清源性污染。（3）避免血清組分對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的影響。（4）有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化。（5）可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。血清在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的作用（1）營(yíng)養(yǎng) 提供有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需的激素、生長(zhǎng)因子或提供合成培養(yǎng)基所缺乏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。（2）提供結(jié)合蛋白，結(jié)合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起重要作用。 （3）提供貼壁細(xì)胞固著于適當(dāng)?shù)母街嫠璧馁N壁因子和伸展因子，使細(xì)胞很好地貼壁（4）保護(hù) 提供蛋白酶抑制劑，使細(xì)胞免受蛋白酶的損傷。一些細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、

46、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因?yàn)橐鹊鞍酌敢呀?jīng)被廣泛用于貼壁細(xì)胞的消化傳代。（5）解毒 血清還含有一些微量元素和離子，他們?cè)诖x解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。 5.目前常用的合成培養(yǎng)基有哪些？有哪些優(yōu)點(diǎn)？人工合成培養(yǎng)基，常用如下 (1).MEM(minimum essential medium)細(xì)胞培養(yǎng)基系列 (2).DMEM（Dulbeccos modified Eagle medium)細(xì)胞培養(yǎng)基系列(3)RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列(4).M199細(xì)胞培養(yǎng)基系列 (7)F-1

47、0,F-12細(xì)胞培養(yǎng)基系列(8) DMEM-F12優(yōu)點(diǎn)：提供近似體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，又便于控制和提供標(biāo)準(zhǔn)化的生存環(huán)境。6.BSS有哪些功能？常用的BSS有哪些？1、 水與平衡鹽溶液 balance saline solution,BSS）： 1）培養(yǎng)用水:體外培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)水質(zhì)特別敏感，對(duì)水的純度要求較高。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時(shí)也會(huì)影響細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會(huì)含有某些金屬離子，一般不作為培養(yǎng)用水。配制培養(yǎng)用液應(yīng)使用經(jīng)石英蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。存放時(shí)間一般不應(yīng)超過2周。 2). 平衡鹽溶液：主要是由無機(jī)鹽

48、、葡萄糖組成。作用：提供緩沖系統(tǒng)，維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定提供細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分。用于洗滌組織、細(xì)胞的漂洗、配制其他培養(yǎng)用液。幾種常用的BSSRingerPBSEarleHanksD-HanksD-Hanks與Hanks的一個(gè)主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hanks常用于配制胰酶溶液。配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌第十二章 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)名詞解釋： 1、原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)(Primary Culture)：亦稱初代培養(yǎng)，指直接從機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行

49、第一次培養(yǎng)的過程。2、傳代培養(yǎng) 繼代培養(yǎng)（ Secondary Culture ）：亦稱傳代培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱繼代培養(yǎng). 3、接觸抑制 細(xì)胞從接種到長(zhǎng)滿底物表面后，由于細(xì)胞繁殖數(shù)量增多相互接觸后，不再增加。一般的正常細(xì)胞并不互相重疊于其上面而生長(zhǎng)；但是，轉(zhuǎn)化細(xì)胞或癌瘤細(xì)胞則接觸抑制下降，他們互相之間可在上面或下面經(jīng)過而重疊生長(zhǎng)。4、密度抑制 細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。5、細(xì)胞克隆

50、6、細(xì)胞系 7、細(xì)胞株8、動(dòng)物細(xì)胞固定化培養(yǎng)問答題：1、 體外培養(yǎng)細(xì)胞有哪些類型及各自特點(diǎn)？在體外按照培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不同，主要可分為以下幾類：成纖維細(xì)胞型、上皮型細(xì)胞、游走型細(xì)胞、多形型細(xì)胞 （1）成纖維細(xì)胞型：本型細(xì)胞的形態(tài)似在體內(nèi)生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞；形態(tài)：長(zhǎng)梭形，細(xì)胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長(zhǎng)，細(xì)胞核位于中央，胞質(zhì)向外伸出2-3個(gè)長(zhǎng)短不同的突起，中有卵圓形核.生長(zhǎng)特點(diǎn)：細(xì)胞一般并不緊靠相連；生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀、漩渦狀走向，細(xì)胞間間隙較大。來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織.如人胚肺細(xì)胞。如：真正的成纖維細(xì)胞 心肌，平滑肌 （2）上皮型細(xì)胞形態(tài):扁平狀，不規(guī)則。細(xì)胞貼壁后呈不規(guī)則多角形，

51、中央有扁圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層細(xì)胞，呈現(xiàn)“鋪路石狀”。生長(zhǎng)特點(diǎn): 易相連成片相靠緊密相連成薄層鋪石狀 生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少脫離細(xì)胞群?jiǎn)为?dú)行動(dòng)。來源:內(nèi)胚層和外胚層。如皮膚、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等。Hela細(xì)胞呈現(xiàn)為典型的上皮細(xì)胞型。 （3）游走型細(xì)胞： 不常見，具有類似巨噬細(xì)胞樣的特征。本型細(xì)胞在支持物上散在生長(zhǎng)，一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，速度快且不規(guī)則。此型細(xì)胞不很穩(wěn)定，有時(shí)亦難和其它型細(xì)胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細(xì)胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細(xì)胞形態(tài)。如單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)

52、的細(xì)胞中的顆粒型白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。 （4）多形型細(xì)胞：形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞，不常見，一般分胞體和胞突兩部分，胞突細(xì)長(zhǎng)形類似絲狀偽足；胞體略呈多角形，但較規(guī)則。如神經(jīng)組織細(xì)胞如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。非貼附型細(xì)胞懸浮型細(xì)胞：指細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)不必貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)。 見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。形態(tài)特點(diǎn)：胞體始終為球形。優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，培養(yǎng)效率高，利于大量生產(chǎn)，與培養(yǎng)基充分接觸無需消化傳代，易于收獲細(xì)胞。缺點(diǎn):不如貼附生長(zhǎng)型觀察方便，而且并非所有的培養(yǎng)細(xì)胞都

53、能懸浮生長(zhǎng);純化不方便，不能通過離心將死、活細(xì)胞分離。貼壁細(xì)胞經(jīng)懸浮適應(yīng)后也可以長(zhǎng)期懸浮培養(yǎng)3、兼性貼壁細(xì)胞實(shí)際情況下，所培養(yǎng)的細(xì)胞并不一定呈現(xiàn)某種典型的形態(tài)，能影響細(xì)胞形態(tài)的因素很多，在不同培養(yǎng)條件下可以互相轉(zhuǎn)變，細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征僅是對(duì)培養(yǎng)物判斷或識(shí)別的一種參考性指標(biāo)，如果想明確某一培養(yǎng)物的確切類型，必須借助于更為特異的鑒定方法。2.體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要什么樣的條件？1、恒定的溫度:37 2、pH：最適為7.27.4 3、氣體 需要O2、CO2 （95%空氣、5% CO2）二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物,也是細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需成分,它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH值.4、營(yíng)養(yǎng)：要求高，需要氨

54、基酸、維生素、輔酶、核酸、激素、生長(zhǎng)因子等。5、無菌2、 細(xì)胞系的生長(zhǎng)過程包括哪些主要階段？每一生長(zhǎng)階段各有什么特征？(1)原代培養(yǎng)（初代培養(yǎng)）特點(diǎn)：這個(gè)階段細(xì)胞比較活躍，有細(xì)胞分裂，但不旺盛；原代細(xì)胞培養(yǎng)通常為異質(zhì)性(2)傳代期特點(diǎn):細(xì)胞增殖旺盛，在細(xì)胞整個(gè)生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)， 一般情況下，可傳代1050代； 反復(fù)傳代可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化；能維持二倍體核型，被稱為二倍體核型；細(xì)胞應(yīng)在初代或傳代早期凍存為好；十代內(nèi)凍存。(3)衰退期 此期細(xì)胞雖仍存活，但增殖很慢或基本停止，細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，進(jìn)而細(xì)胞發(fā)生衰退、死亡。3、 每代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線包括哪幾個(gè)主要時(shí)期？各期細(xì)胞有什

55、么特點(diǎn)？潛伏期2）指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長(zhǎng)，活力最佳，適用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。持續(xù)35天。 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖狀況可以細(xì)胞群體倍增時(shí)間及細(xì)胞分裂指數(shù)等來判斷。在此階段，若細(xì)胞處于理想的培養(yǎng)條件，將不斷生長(zhǎng)繁殖，細(xì)胞數(shù)量日漸增加。細(xì)胞將接觸而連成一片，漸次鋪滿培養(yǎng)器皿底物，提供細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域逐漸減少甚至消失。因接觸抑制而細(xì)胞運(yùn)動(dòng)停止、密度抑制而細(xì)胞終止分裂。細(xì)胞不再繁殖而進(jìn)入平臺(tái)期。3生長(zhǎng)停滯期。特點(diǎn)：細(xì)胞雖已停止生長(zhǎng)，但仍存在代謝活動(dòng)并可繼續(xù)存活一定的時(shí)間。若及時(shí)分離培養(yǎng)、進(jìn)行傳代，將細(xì)胞分開接種至新的培養(yǎng)器皿并補(bǔ)充以新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞將于培養(yǎng)器皿中成為下一代的細(xì)胞而再次繁殖。否則細(xì)胞因中毒而發(fā)生死亡。4、衰亡期 達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期的細(xì)胞群體，由于生長(zhǎng)環(huán)境的繼續(xù)惡化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的短缺，群體中細(xì)胞死亡率逐漸上升，以致細(xì)胞死亡數(shù)超過新生細(xì)胞數(shù)，群體中活細(xì)胞數(shù)下降。4、 動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法？舉例說明培養(yǎng)的基本過程。懸滴培養(yǎng)法 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 灌注小室培養(yǎng)法 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 克隆培養(yǎng)法5、 貼壁細(xì)胞傳代時(shí)采用何種方法，其技術(shù)關(guān)鍵是什么？6、 為保證好的凍存復(fù)蘇效果，需要考慮那些問題？慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。在細(xì)胞凍存時(shí)