成像流式細胞儀原理及應(yīng)用

1、二代流式技術(shù)產(chǎn)品-成像流式細胞分析邱又彬Merck&Millipore旗下品牌Amnis于近期推出了新一代高速細胞成像系統(tǒng)ImageStreamX Mark II。這是第三代ImageStream成像流式細胞儀，具有無與倫比的細胞分析能力。顯微鏡可提供詳細的細胞圖像和形態(tài)信息，是研究細胞功能的重要工具。然而，顯微圖像的解釋卻是主觀、定性且費力的。流式細胞儀擅長定量的表型分析，可產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上可靠的結(jié)果，不過，流式細胞儀卻缺乏成像能力，因此無法了解亞細胞定位。ImageStream系列開創(chuàng)性地將流式細胞檢測與熒光顯微成像結(jié)合于一體，既能提供細胞群的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，又可以獲得單個細胞的圖像，從而提

2、供了細胞形態(tài)學(xué)、細胞結(jié)構(gòu)和亞細胞信號分布的完整信息。ImageStreamX Mark II能實時捕獲每個流動細胞最多12幅高分辨率圖像，檢測速率可達5000細胞/秒，并具有更強熒光靈敏度。ImageStreamX Mark II的這些功能可以對細胞形態(tài)、熒光探針的強度和定位進行檢測，進而為科學(xué)家提供廣泛的圖像分析應(yīng)用，包括細胞間相互作用、吞噬、凋亡和自噬、核易位、形態(tài)變化等。ImageStreamX Mark II的特征如下：速度更快：Mark II對進樣速度進行了提升，每秒可以分析多達5000個細胞，簡單易用的補償向?qū)Э梢灾笇?dǎo)您輕松完成多色補償運算。操作更簡單：全新而直觀的用戶界面提供了每

3、一個細胞的圖像及實時繪圖相關(guān)的圖形化控件。樣品適應(yīng)性更強：Mark II可選配7個激光；樣品容量20-200 l，增加了實驗的靈活性，適用于多用戶實驗室。樣品利用率更高：Mark II將樣品利用率提高到了95%，更適用于稀有的細胞樣品，而且未使用的樣品也可回收用于進一步分析。從2005年開始，Amnis量化成像流式分析儀被廣泛應(yīng)用于各個研究領(lǐng)域。其中超過300篇的文章發(fā)表在高水平的同行評議雜志（peer-reviewed journal）上。這些研究領(lǐng)域包括生物化學(xué)、藥物研發(fā)、血液、免疫、微生物、海洋、腫瘤、寄生蟲、干細胞、毒理、病毒等等。并且由于Amnis與眾不同的實驗理念和卓越性能，使得這

4、個名單不斷變長。1. 生物化學(xué)：經(jīng)典的生物化學(xué)技術(shù)主要用于分子定位和共定位檢測，這非常適合使用Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)，比如轉(zhuǎn)錄因子從細胞質(zhì)到細胞核的轉(zhuǎn)位、分子在亞細胞器間的運輸、蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)和細胞間的共定位。它可以獲取復(fù)雜樣品每個細胞中探針定位和共定位的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果，這對于傳統(tǒng)生物化學(xué)研究是極大的補充和拓展。示例1：T細胞-抗原遞呈細胞中NF-B的轉(zhuǎn)運：NF-B在與抗原遞呈細胞（APC）和特異性多肽連接的轉(zhuǎn)基因T細胞中從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞核的轉(zhuǎn)位。在此使用Similarity參數(shù)是指兩幅圖像間像素信號的相似性，即Similarity值越高代表NF-B（綠色）和7-AAD染核（紅色）信號相

5、似度越高。示例2：抗體-藥物耦聯(lián)復(fù)合物與內(nèi)涵體和溶酶體的共定位：熒光特異性標記的抗體-藥物耦聯(lián)復(fù)合物（ADC）通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞后與內(nèi)涵體和溶酶體的共定位。此處endosome/lysosomecolocalization的衡量是通Bright Detail Similarity參數(shù)實現(xiàn)的，它代表的是兩幅圖像中熒光亮點的位置。示例3：ImageStream系統(tǒng)中利用FRET（熒光能量共振轉(zhuǎn)移）檢測蛋白質(zhì)間的相互作用： FRET（熒光能量共振轉(zhuǎn)移）：在熒光顯微鏡下可以看到，熒光團可以在吸收一個波長的光之后發(fā)射出波長較長的光；當?shù)诙€熒光團離第一個熒光團足夠近的時候，它就可以從第一熒光團獲取

6、能量，發(fā)射出波長更長的光。FRET對于熒光團之間的距離很敏感，如果發(fā)生了FRET，說明熒光團之間的距離大約是在10 nm。當用兩個熒光團分別標記蛋白時，可以通過供體和受體熒光團間的FRET來推斷蛋白質(zhì)間的距離。ImageStream可以定量分析稀有細胞亞群中的FRET，來衡量細胞內(nèi)蛋白相互作用和細胞間連接。區(qū)別胞內(nèi)發(fā)生和未發(fā)生FRET蛋白的位置可以改進我們對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的理解。下圖所示，受體1和受體2分別用PE（供體）和AF647（受體）標記。收集細胞圖片用488 nm激光激發(fā)。受刺激的樣品中可以檢測到AF647熒光團，說明發(fā)生了FRET現(xiàn)象。2. 藥物研發(fā)：藥物研發(fā)的目標是找到高質(zhì)量的、可

7、以改善治療效果的候選藥物。利用相關(guān)信息分析可以很快的減少候選藥物的數(shù)量，選出那些既不影響效果又不會引起不可預(yù)見的致命后果的候選藥物，這會節(jié)省藥品公司為了淘汰某些候選藥物進行臨床實驗而花費的時間和金錢。Amnis的量化成像流式分析系統(tǒng)的一些應(yīng)用非常適合鑒定藥物的性質(zhì)，包括細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞間相互作用、化學(xué)因子誘導(dǎo)的細胞形變、細胞死亡、共定位和吞噬。而且，這些應(yīng)用非常適于全血白細胞這樣的異源、原代細胞。示例 1：抗體-藥物耦聯(lián)復(fù)合物與內(nèi)涵體和溶酶體的共定位：熒光特異性標記的抗體-藥物耦聯(lián)復(fù)合物（ADC）通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞后與內(nèi)涵體和溶酶體的共定位。此處endosome/lysosomecol

8、ocalization的衡量是通Bright Detail Similarity參數(shù)實現(xiàn)的，它代表的是兩幅圖像中熒光亮點的位置。示例 2：條碼：篩選候選藥物需要對大量樣品進行快速分析。ImageStream可以將時程、劑量因素結(jié)合起來放在1管中進行實驗，這大大提高了系統(tǒng)的通量。這個過程是這樣實現(xiàn)的，每個樣品會基于特定的時間點和處理方式被染上特定強度的熒光染料，就像給它們打上了條形碼。系統(tǒng)會根據(jù)熒光顏色及其強度自動確定細胞群體，反推出標記樣品。下圖展示的例子是，在不同的時間點添加不同劑量的TNF-對胞內(nèi)NF-B從細胞質(zhì)向細胞核發(fā)生轉(zhuǎn)位程度的測量。在ImageStream系統(tǒng)中，可以用AlexaF

9、luor 405、488和 660和四種不同的濃度做排列組合來標記64個樣品在一個管中完成測量。在10到15分鐘內(nèi)接收600000張圖片，為了進一步定量分析圖片，可以根據(jù)樣品顏色和強度的排列組合進行反推。電子表格中是Similarity打分的平均值，這種結(jié)果可以以heatmap的形式呈現(xiàn)。注：AlexaFluor 405、488和 660染THP-1細胞會產(chǎn)生四種熒光密度形式negative、dim、med、bright，三種染料就會有64種染料-熒光密度組合。其作用原理是，本身沒有熒光，其ester group使其進入細胞，如果是活細胞的話，酯酶（esterase）使其ester group

10、裂解，使AF成為熒光形式succinimidyl ester group形式并與細胞內(nèi)蛋白胺基共價連接；死細胞不會發(fā)光。細胞分裂時平均分配到兩個子代細胞內(nèi)。與蛋白連接的共價鍵非常牢固，即使經(jīng)過固定、打孔仍可以保持在細胞內(nèi)。3. 血液學(xué)：血液學(xué)家通常會使用顯微鏡和流式細胞術(shù)兩種方式來對血細胞、造血系統(tǒng)和血系統(tǒng)寄生蟲進行研究和分類。Amnis獨有的對大量懸浮細胞進行圖像定量分析能力使得其特別適合血液學(xué)領(lǐng)域。這方面應(yīng)用包括，將免疫表型和形態(tài)學(xué)結(jié)合起來對紅細胞生成不同階段進行劃分，鑒定鐮刀血細胞或者寄生蟲感染的血紅細胞，定量分析吞噬、共定位、化學(xué)因子誘導(dǎo)的形變、血細胞特異性亞群中的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。示例：

11、紅系細胞分化：造血干細胞向紅系細胞分化過程中，在向紅細胞分化時中會發(fā)生收縮、進而脫核的現(xiàn)象。同時，血型糖蛋白A的表達逐漸增加，而CD71逐漸降低。這個實驗向我們展示的是ImageStream在將強度、形態(tài)和定位結(jié)合起來將細胞進行分類的獨特能力。下圖所示的是細胞核脫出的過程，利用Delta centroid XY 來衡量細胞核DRAQ5染色和血型糖蛋白A之間的位置關(guān)系。Delta centroid XY是指兩個圖像選區(qū)中心點間的距離。4. 免疫學(xué)：先天和獲得性免疫系統(tǒng)中的細胞保證人體免受病原體的攻擊。免疫系統(tǒng)中不同類型的細胞的區(qū)別不僅是細胞表面標志物的差別，還有對于不同病原體或是刺激的反應(yīng)。將定

12、量圖像分析工具和流式細胞術(shù)的大樣本量結(jié)合起來，ImageStream可以獨特的將多種應(yīng)用使用在免疫學(xué)領(lǐng)域，包括轉(zhuǎn)錄因子的細胞核轉(zhuǎn)位、T細胞和抗原遞呈細胞的相互作用和免疫突觸上的蛋白質(zhì)聚集、化學(xué)因子誘導(dǎo)的形變和吞噬。示例 1：NF-B在與抗原遞呈細胞結(jié)合的T細胞中的轉(zhuǎn)位：NF-B在與抗原遞呈細胞（APC）和特異性多肽連接的轉(zhuǎn)基因T細胞中從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞核的轉(zhuǎn)位。在此使用Similarity參數(shù)是指兩幅圖像間像素信號的相似性，即Similarity值越高代表NF-B（綠色）和7-AAD染核（紅色）信號相似度越高。示例 2：鼠巨噬細胞的吞噬作用：免疫表型鑒定鼠巨噬細胞系RAW（橙色）對酵母聚糖的內(nèi)

13、化作用。37度條件下，分別在加入酵母聚糖15、30、60分鐘時檢測發(fā)生內(nèi)化作用細胞的百分比。內(nèi)化作用的衡量參數(shù)是Internalization，是指細胞內(nèi)某物質(zhì)熒光與代表整個細胞熒光的比值。示例 3：HIV引起的特異性的NFAT轉(zhuǎn)位：來源于HIV陽性病人的外周血中HIV激活T細胞核中NFAT的入核現(xiàn)象。在HIV四聚體陽性細胞（橙色）中，HIV鞘蛋白gag特異性刺激NFAT（綠色）轉(zhuǎn)移到細胞核（紅色）中。Similarity參數(shù)是指兩幅圖像間像素信號的相似性，分值與DRAQ5核染色和NFAT信號的重疊性相關(guān)。Similarity參數(shù)打分越高，樣品中發(fā)生轉(zhuǎn)位的細胞越多。5. 微生物學(xué)：微生物因其致

14、病性對于人類健康和疾病預(yù)防十分重要。Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)由于其具有圖像參數(shù)，所以可以基于形態(tài)學(xué)對細菌進行分類，并且可以檢測它們的復(fù)制過程。致病菌有一套跨越機體免疫系統(tǒng)的方法，其中包括對吞噬細胞內(nèi)化作用的抑制。微生物與宿主細胞的相互作用是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，可以用Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)研究這個過程，包括自身免疫系統(tǒng)對病原體的內(nèi)吞和清除、胞內(nèi)細菌的維持和擴增以及細菌感染對于宿主細胞信號通路和存活的影響。示例：有害細菌鑒定和成絲化分析：從培養(yǎng)或是殘余食物當中獲得的細菌可以定量的分析其大小、形態(tài)和特異性FISH探針的熒光強度。成絲化無論是復(fù)制缺陷造成的，還是對宿主免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，都

15、可以測量。衡量細菌成絲程度使用的是尺寸參數(shù)Length，測量的是選區(qū)（細胞）長度。第二幅圖是用特異性FISH探針檢測變質(zhì)食物中的沙門氏菌。6. 海洋學(xué)：海水的成分和物種對于研究海洋環(huán)境中復(fù)雜的相互作用是非常關(guān)鍵的。浮游生物種類和數(shù)量是漁業(yè)生產(chǎn)、水質(zhì)監(jiān)測和保持物種多樣性的重要指標。因為這些海洋生物是漂浮的，具有復(fù)雜的形態(tài)，Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)對于鑒定硅藻的數(shù)量、測量海藻細胞分裂和研究以浮游生物為食生物的分布十分理想。示例：分析碼頭纜繩上微生物的形態(tài)和體積：定量分析培養(yǎng)基或者海水中特殊的硅藻和其他浮游生物的體積、形態(tài)、熒光強度、結(jié)構(gòu)以及熒光探針或者葉綠體的定位和共定位。形態(tài)學(xué)參數(shù)Aspe

16、ct Ratio測量圖像選區(qū)（細胞）中短軸與長軸的長度比值，尺寸參數(shù)Area測量圖像選區(qū)（細胞）面積。7. 腫瘤學(xué)：腫瘤學(xué)的研究主要涉及癌癥的發(fā)展過程和治療方法。腫瘤學(xué)家不僅使用顯微鏡對癌細胞進行鑒定和分類，還要鑒定化學(xué)藥物引起的凋亡細胞中細胞核的片段化，或是追蹤治療性單克隆抗體的結(jié)合和內(nèi)化過程。Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)可以將免疫表型和量化的形態(tài)學(xué)參數(shù)結(jié)合起來，將其應(yīng)用于潛在轉(zhuǎn)移細胞總的稀有亞細胞群的鑒定，比如循環(huán)腫瘤細胞（CTC）。示例 1：抗體藥物耦聯(lián)復(fù)合物與內(nèi)涵體或溶酶體的共定位：熒光特異性標記的抗體-藥物耦聯(lián)復(fù)合物（ADC）通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞后與內(nèi)涵體和溶酶體的共定位。此處

17、endosome/lysosomecolocalization的衡量是通Bright Detail Similarity參數(shù)實現(xiàn)的，它代表的是兩幅圖像中熒光亮點的位置。示例2：凋亡系數(shù)： DNA固縮和片段化是細胞凋亡一個顯著的標志。通過測量細胞核圖像中最亮部分的面積和強度，凋亡細胞有亮點的細胞核圖像可以和正常、健康細胞核染色圖像區(qū)別開。這使得自動鑒定細胞凋亡成為可能。結(jié)構(gòu)分析參數(shù)Bright Detail Intensity測量的是所選區(qū)域內(nèi)某像素范圍內(nèi)的顆粒數(shù)。8. 寄生蟲學(xué)：寄生蟲是人類健康的大敵，它可以引起疾病甚至死亡，比如瘧疾、非洲嗜睡病、黑熱病和萊姆病。人類對于寄生蟲如何感染機體和宿

18、主免疫系統(tǒng)以及如何清除外來入侵的理解對于開發(fā)有效治療方法至關(guān)重要。Amnis量化成像流式分析不僅可以檢測被感染細胞，還可以確定細胞內(nèi)寄生的寄生蟲的數(shù)量以及它們對亞細胞信號通路的影響。示例：椎體蟲：椎體蟲可以引起非洲嗜睡病。下圖所示是定量研究GFP標記分子入核現(xiàn)象的兩個例子。直方圖顯示的是每個細胞的GFP圖像和DRAQ5染核圖像的一致性，用similarity這個參數(shù)來打分表示。Similarity參數(shù)是指兩幅圖像間像素信號的相似性。Similarity打分高說明GFP圖像和DRAQ5染核圖像高度相似（GFP轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)）。低的Similarity打分說明沒有發(fā)生核轉(zhuǎn)位。9. 干細胞：在體內(nèi)，

19、干細胞具有分化成各種細胞的能力。闡明這個過程可以促使我們更好的理解動物發(fā)育的過程和制定出更好的替代受損組織的治療方案。由于干細胞在向終末分化細胞分化過程中通常會涉及到明顯的細胞形變，所以Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)十分適于這方面的研究。測量維持干細胞多潛能性蛋白的細胞定位或是衡量干細胞分化過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)可以分析大樣本量細胞的特點簡化了稀有干細胞的鑒定和分類。示例：紅系細胞分化：造血干細胞向紅系細胞分化過程中，在向紅細胞分化時中會發(fā)生收縮、進而脫核的現(xiàn)象。同時，血型糖蛋白A的表達逐漸增加，而CD71逐漸降低。這個實驗向我們展示的是ImageStream在將

20、強度、形態(tài)和定位結(jié)合起來將細胞進行分類的獨特能力。下圖所示的是細胞核脫出的過程，利用Delta centroid XY 來衡量細胞核DRAQ5染色和血型糖蛋白A之間的位置關(guān)系。Delta centroid XY是指兩個圖像選區(qū)中心點間的距離。10. 毒理學(xué)：環(huán)境中的健康風(fēng)險和藥物劑量評估是毒理學(xué)研究的核心問題。微核分析常用于評價候選化合物或藥物的基因毒性，這種毒性會誘導(dǎo)染色體片段化，使得在細胞分裂過程中無法分配到子代細胞中。傳統(tǒng)上，統(tǒng)計這種微核的數(shù)量要使用顯微鏡手動進行。Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)將高速細胞成像和圖像定量分析結(jié)合起來，可以大大推動這個研究領(lǐng)域，使得快速、自動化鑒定細胞內(nèi)微核成為可能。示例：微核檢測：微核分析是評價藥物和其他化學(xué)試劑基因毒性的最好方法。從下面這個實驗可以看出，ImageStream僅僅使用明場和細胞核染色的圖像就可以快速對細胞群中凋亡、雙核和微核事件進行分類。傳統(tǒng)上，細胞生物學(xué)家不得不在手動熒光顯微鏡（耗時）和流式細胞術(shù)（快速分析大量細胞，但無法對胞內(nèi)細胞核成像）之間進行選擇。Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)將精準的數(shù)字成像和分析能力結(jié)合起來，解決了這個問題。形態(tài)學(xué)參數(shù)Aspect Ratio測量圖像選區(qū)（細胞）中短軸與長軸的長度比值，尺寸參數(shù)Area測量圖像選區(qū)（細胞）面積