電子克隆（課堂PPT）

1、.1電子克隆簡介電子克隆簡介南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院沈文飆沈文飆.2n什么是電子克隆什么是電子克隆n拼圖游戲一樣的原理拼圖游戲一樣的原理 n應(yīng)用應(yīng)用 n如何做拼圖游戲如何做拼圖游戲n常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介 n優(yōu)點與缺點的討論優(yōu)點與缺點的討論 n現(xiàn)狀與展望現(xiàn)狀與展望 .3什么是電子克隆什么是電子克隆nWatson & Crick 成功解析了成功解析了DNA分子分子二級結(jié)構(gòu)，開創(chuàng)了二級結(jié)構(gòu)，開創(chuàng)了分子生物學(xué)時代分子生物學(xué)時代nKarry Mullis 發(fā)明了發(fā)明了PCR反應(yīng)，體外反應(yīng)，體外大大規(guī)模規(guī)模、有目的有目的和和快速地快速地克隆目標(biāo)基因成

2、克隆目標(biāo)基因成為可能為可能 n信息科學(xué)技術(shù)特別是數(shù)據(jù)庫技術(shù)在戰(zhàn)后信息科學(xué)技術(shù)特別是數(shù)據(jù)庫技術(shù)在戰(zhàn)后飛速發(fā)展飛速發(fā)展.4什么是電子克隆什么是電子克隆n表達序列標(biāo)簽表達序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，EST）是對某個基因）是對某個基因cDNA克隆測序所得的部克隆測序所得的部分序列片段，長度大約為分序列片段，長度大約為200600bp n由于基因由于基因表達調(diào)控作用表達調(diào)控作用不同，同一個基因的不同，同一個基因的mRNA剪接位點和方式剪接位點和方式不同，所以同一個基不同，所以同一個基因的全長因的全長cDNA可能包含多個可能包含多個ESTnEST既代表了基因既代表了基因cDN

3、A的某一區(qū)段，也表征的某一區(qū)段，也表征了成熟了成熟mRNA可能的剪接方式可能的剪接方式.5什么是電子克隆什么是電子克隆n電子克隆技術(shù)是生物學(xué)數(shù)據(jù)庫中電子克隆技術(shù)是生物學(xué)數(shù)據(jù)庫中EST數(shù)據(jù)庫、數(shù)據(jù)庫、核酸序列數(shù)據(jù)庫、基因組數(shù)據(jù)庫，采用同源核酸序列數(shù)據(jù)庫、基因組數(shù)據(jù)庫，采用同源性序列比對和歸類分析、重疊區(qū)域性序列比對和歸類分析、重疊區(qū)域組裝組裝和和拼拼接接等方法延長等方法延長EST序列，直至沒有與之同源序列，直至沒有與之同源的序列可供拼接為止，所得到的序列可以認的序列可供拼接為止，所得到的序列可以認為是相對應(yīng)基因的為是相對應(yīng)基因的全長全長cDNA，根據(jù)所得的，根據(jù)所得的cDNA序列設(shè)計囊括開放閱讀

4、框兩端的引物，序列設(shè)計囊括開放閱讀框兩端的引物，進行進行RT-PCR克隆出相應(yīng)基因的方法克隆出相應(yīng)基因的方法 .6什么是電子克隆什么是電子克隆n傳統(tǒng)的克隆方法是利用基因特異性引物大量傳統(tǒng)的克隆方法是利用基因特異性引物大量擴增擴增cDNA末端或構(gòu)建末端或構(gòu)建cDNA文庫并采用原位文庫并采用原位雜交進行篩選，雜交進行篩選，實驗進程長、步驟繁瑣、成實驗進程長、步驟繁瑣、成本高、得率低本高、得率低；運用電子克隆的方法延伸得；運用電子克隆的方法延伸得到的到的cDNA幾乎囊括了所有疑似為目的基因的幾乎囊括了所有疑似為目的基因的cDNA序列，無論表達轉(zhuǎn)錄如何調(diào)控，都能通序列，無論表達轉(zhuǎn)錄如何調(diào)控，都能通過過

5、PCR擴增出表達的那一段基因擴增出表達的那一段基因n傳統(tǒng)的方法如同小規(guī)模地捕撈一條或幾條魚，電子克隆與之相比就如同集約化地捕撈一群魚.7拼圖游戲一樣的原理拼圖游戲一樣的原理 n相近的物種在核酸序列上有相似性，相近物相近的物種在核酸序列上有相似性，相近物種中的種中的同源基因同源基因序列在一定程度上可以代表序列在一定程度上可以代表目的基因的序列目的基因的序列n可代表程度與兩序列的相似度直接相關(guān)，加可代表程度與兩序列的相似度直接相關(guān)，加之遺傳密碼的簡并性，這種混同在理論上是之遺傳密碼的簡并性，這種混同在理論上是可行的可行的 ，但需要作，但需要作同源性檢驗同源性檢驗以克服主觀因以克服主觀因素的影響素的

6、影響.8拼圖游戲一樣的原理拼圖游戲一樣的原理n借助計算機找到具有相同或相似圖案的圖塊，借助計算機找到具有相同或相似圖案的圖塊，拼成完整的圖案，我們需要做的是進行局部拼成完整的圖案，我們需要做的是進行局部的微調(diào)。的微調(diào)。n剩下的工作就是對拼接出的剩下的工作就是對拼接出的cDNA進行可能的進行可能的開放閱讀框的分析，設(shè)計囊括開放閱讀框兩開放閱讀框的分析，設(shè)計囊括開放閱讀框兩端的引物，端的引物，RT-PCR擴增侯選基因擴增侯選基因.9應(yīng)用應(yīng)用n電子克隆主要應(yīng)用于兩個方面：電子克隆主要應(yīng)用于兩個方面：n一個是利用一個是利用EST序列檢索同源性序列，并由序列檢索同源性序列，并由此拼接此拼接cDNA序列以

7、期挖掘新基因序列以期挖掘新基因n另一方面是在全基因組已經(jīng)測序的物種中，另一方面是在全基因組已經(jīng)測序的物種中，研究整個基因組序列以推測其中可能尚未發(fā)研究整個基因組序列以推測其中可能尚未發(fā)現(xiàn)的基因現(xiàn)的基因n目前應(yīng)用比較廣泛的是第一方面目前應(yīng)用比較廣泛的是第一方面 .10應(yīng)用應(yīng)用n數(shù)據(jù)庫查詢數(shù)據(jù)庫查詢n數(shù)據(jù)庫比對數(shù)據(jù)庫比對n文件下載文件下載n序列分析序列分析n序列裝配序列裝配n分子模型分子模型n結(jié)構(gòu)分析結(jié)構(gòu)分析n功能分析功能分析.11應(yīng)用應(yīng)用n在全基因組已經(jīng)測序的物種中推測新基因的在全基因組已經(jīng)測序的物種中推測新基因的步驟如下：步驟如下：n分析和定位開放閱讀框分析和定位開放閱讀框 n虛擬翻譯并對多肽

8、鏈序列檢索比對虛擬翻譯并對多肽鏈序列檢索比對 n可靠性檢查可靠性檢查 n分析與之相關(guān)的調(diào)控序列分析與之相關(guān)的調(diào)控序列 .12如何做拼圖游戲如何做拼圖游戲n以電子克隆新的水稻以電子克隆新的水稻過氧化氫酶過氧化氫酶（catalase，CAT）基因為例，簡介延伸）基因為例，簡介延伸cDNA的流程：的流程：n以登錄號為以登錄號為CA759712的的EST在對其在核酸序在對其在核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行列數(shù)據(jù)庫中進行BLAST檢索比對時，發(fā)現(xiàn)登檢索比對時，發(fā)現(xiàn)登錄號為錄號為CB652681的序列推測為水稻的序列推測為水稻CAT基因基因的部分序列，與信息標(biāo)簽的部分序列，與信息標(biāo)簽 EST具有比較高的具有比較高的

9、同源性，該同源性，該EST序列將作為種子序列序列將作為種子序列 .13如何做拼圖游戲如何做拼圖游戲n將檢索得到的同源序列保存到將檢索得到的同源序列保存到PC機上，運行機上，運行DNAStar軟件包，將上述序列輸入，由于基軟件包，將上述序列輸入，由于基因測序是借助質(zhì)粒載體完成的，序列中難免因測序是借助質(zhì)粒載體完成的，序列中難免混有載體序列，因此需要運行程序查找載體混有載體序列，因此需要運行程序查找載體序列，對序列進行末段序列，對序列進行末段修剪修剪去掉冗余部分去掉冗余部分 .14如何做拼圖游戲如何做拼圖游戲n程序根據(jù)外顯子和內(nèi)含子的編碼規(guī)則和排布程序根據(jù)外顯子和內(nèi)含子的編碼規(guī)則和排布方式搜索和方

10、式搜索和定位開放閱讀框定位開放閱讀框，開放閱讀框是，開放閱讀框是電子克隆的重點研究對象；接著，程序?qū)Ω麟娮涌寺〉闹攸c研究對象；接著，程序?qū)Ω鞫涡蛄械闹貜?fù)序列和差異序列進行逐一檢索段序列的重復(fù)序列和差異序列進行逐一檢索和比對，并對重疊區(qū)域進行和比對，并對重疊區(qū)域進行拼接和組裝拼接和組裝，構(gòu)，構(gòu)建重疊序列群建重疊序列群n以上各步驟由程序自動完成.15如何做拼圖游戲如何做拼圖游戲n以構(gòu)建的重疊序列群為信息標(biāo)簽，進一以構(gòu)建的重疊序列群為信息標(biāo)簽，進一步檢索比對，搜索其高度同源序列步檢索比對，搜索其高度同源序列n如果發(fā)現(xiàn)了與之高度同源的未知序列，則重復(fù)上述步驟；若沒有新的發(fā)現(xiàn)，說明拼接組裝得到的EST可

11、能囊括了所以可能的目的基因序列 n根據(jù)以上步驟，得到了一個全長為根據(jù)以上步驟，得到了一個全長為1678 bp的的EST序列序列 .16如何做拼圖游戲如何做拼圖游戲n以此以此EST序列為序列為cDNA序列，對其設(shè)計囊括整序列，對其設(shè)計囊括整個開放閱讀框的特異性引物，設(shè)計得到的上個開放閱讀框的特異性引物，設(shè)計得到的上游引物為：游引物為：5-CTA-GCC-CAC-TAC-CAT-GGA-TCC-TTG-3，下游引物為：，下游引物為：5-CAG-AAT-TTC-TGT-AGC-CTT-GCT-GAT-3， n引物的具體合成可交由經(jīng)營分子生物學(xué)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的公司商業(yè)化合成 .17如何做拼圖游戲如何做拼圖游

12、戲n對延伸出的對延伸出的cDNA其作其作人工人工的可靠性驗證的可靠性驗證 n提取水稻中總提取水稻中總RNA，進行，進行RT-PCR，電泳檢，電泳檢測結(jié)果測結(jié)果 n轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究 .18常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介 nDNAStar是一款電子克隆中常用的軟件包，是一款電子克隆中常用的軟件包，它以功能全面和強大而著稱，它主要包括以它以功能全面和強大而著稱，它主要包括以下幾個應(yīng)用程序：下幾個應(yīng)用程序：EditSeq、GeneMan、GeneQuest、MapDraw、MegAlign、PrimerSelect、Protean、和、和SeqMan II .19常用軟件及網(wǎng)

13、絡(luò)資源簡介常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介nEditSeq是輸入并且修剪是輸入并且修剪DNA或蛋白質(zhì)序列的或蛋白質(zhì)序列的工具。工具。EditSeq能讀取大部分的序列格式，也能讀取大部分的序列格式，也可以通過使用鍵盤輸入，或者從其他地方復(fù)可以通過使用鍵盤輸入，或者從其他地方復(fù)制、粘貼得到。序列被打開后，制、粘貼得到。序列被打開后，EditSeq能使能使用標(biāo)準(zhǔn)或者指定的遺傳密碼進行翻譯或反翻用標(biāo)準(zhǔn)或者指定的遺傳密碼進行翻譯或反翻譯、尋找開放讀框以及進行閱讀校對譯、尋找開放讀框以及進行閱讀校對 .20常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介nGeneQuest可以發(fā)現(xiàn)注釋可以發(fā)現(xiàn)注釋DNA序列中的基因，序

14、列中的基因，并提供相關(guān)的參數(shù)，包括并提供相關(guān)的參數(shù)，包括ORF、拼接位點、拼接位點、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、重復(fù)序列、限制性內(nèi)切轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、重復(fù)序列、限制性內(nèi)切酶酶切位點等。通過應(yīng)用酶酶切位點等。通過應(yīng)用“methods”命令，命令，序列的各項相關(guān)信息和參數(shù)可以以圖形的形序列的各項相關(guān)信息和參數(shù)可以以圖形的形式展示出來。式展示出來。.21常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介nMapDraw可以制作簡單的線性圖到有注釋的可以制作簡單的線性圖到有注釋的環(huán)形圖，在展示限制性酶切位點的同時，還環(huán)形圖，在展示限制性酶切位點的同時，還可以同時展示序列的可以同時展示序列的feature、開放閱讀框及

15、、開放閱讀框及其翻譯結(jié)果。其翻譯結(jié)果。MapDraw工具主要應(yīng)用與規(guī)劃工具主要應(yīng)用與規(guī)劃酶切位點和克隆實驗，產(chǎn)生詳細和充分的結(jié)酶切位點和克隆實驗，產(chǎn)生詳細和充分的結(jié)果概括果概括 .22常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介nMegAlign提供了比對方法，進行提供了比對方法，進行DNA和蛋白和蛋白質(zhì)序列的配對和多序列比較。多序列比對可質(zhì)序列的配對和多序列比較。多序列比對可以在以在MegAlign的工作界面中進行查看和編輯。的工作界面中進行查看和編輯?？梢愿鶕?jù)隊列的結(jié)果制作進化樹，有關(guān)序列可以根據(jù)隊列的結(jié)果制作進化樹，有關(guān)序列距離的數(shù)據(jù)和殘基替代可以作成表格距離的數(shù)據(jù)和殘基替代可以作成表格

16、.23常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介nPrimerSelect能夠輔助設(shè)計引物和探針。輸入能夠輔助設(shè)計引物和探針。輸入DNA、RNA 或反向翻譯的蛋白質(zhì)模板序列后，或反向翻譯的蛋白質(zhì)模板序列后，PrimerSelect可以在計算序列的各種參數(shù)，用可以在計算序列的各種參數(shù)，用戶可以通過控制各種參數(shù)限定計算結(jié)果。在戶可以通過控制各種參數(shù)限定計算結(jié)果。在模板處理后，模板處理后，PrimerSelect按照用戶定義的參按照用戶定義的參數(shù)確定引物的位置，并給引物評分，然后篩數(shù)確定引物的位置，并給引物評分，然后篩選出模板序列上的最佳引物序列。選出模板序列上的最佳引物序列。.24常用軟件及網(wǎng)絡(luò)

17、資源簡介常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介n美國國家生物信息中心（美國國家生物信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI），），/ n美國冷泉港實驗室（美國冷泉港實驗室（Cold Spring Habor Laboratory，CSHL），），/ n歐洲分子生物學(xué)信息網(wǎng)（歐洲分子生物學(xué)信息網(wǎng)（European Molecular Biology Net，EMBnet），），/ .25常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介常用軟件

18、及網(wǎng)絡(luò)資源簡介n歐洲分子生物學(xué)實驗室（歐洲分子生物學(xué)實驗室（European Molecular Biology Laboratory，EMBL），），http:/www.embl-heidelberg.de/ n日本國立遺傳研究所（日本國立遺傳研究所（National Institute of Genetics，NIG），），http:/www.ddbj.nig.ac.jp/ n北京大學(xué)生物信息學(xué)中心（北京大學(xué)生物信息學(xué)中心（Peking University Center of Bioinformatics，PKUCBI），），http:/ .26優(yōu)點與缺點的討論優(yōu)點與缺點的討論n與傳統(tǒng)的

19、基因克隆方法相比，電子克隆有以與傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，電子克隆有以下的優(yōu)點：下的優(yōu)點：n簡便快速，成本低廉，設(shè)備簡單簡便快速，成本低廉，設(shè)備簡單 n對操作人員技術(shù)要求不高對操作人員技術(shù)要求不高n成功率高成功率高 .27優(yōu)點與缺點的討論優(yōu)點與缺點的討論n盡管電子克隆在理論上已沒有什么障礙，然盡管電子克隆在理論上已沒有什么障礙，然而在實際操作中依然存在些不足之處：而在實際操作中依然存在些不足之處：n電子克隆得到的電子克隆得到的cDNA序列是由計算機虛擬出序列是由計算機虛擬出來的，來的，現(xiàn)實中可能并不存在現(xiàn)實中可能并不存在n研究人員不可完全迷信軟件提供的結(jié)果，最研究人員不可完全迷信軟件提供的結(jié)果，最好對分析做好對分析做人工人工可靠性驗證可靠性驗