溴水氧化亞甲藍(lán)熒光法測(cè)定頭孢氨芐與頭孢拉定

1、溴水氧化亞甲藍(lán)熒光法測(cè)定頭孢氨芐與頭孢拉定劉 奇1*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金 （20805011）項(xiàng)目資助作者簡(jiǎn)介：劉奇(1964 - ) , 男, 河南信陽(yáng)人, 副教授電子郵箱：E-mail:liuqils518 ，楊紅瑞，王愛(ài)軍（河南師范大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）摘要：基于頭孢菌素與Br2發(fā)生氧化反應(yīng)，剩余的Br2能氧化亞甲藍(lán)（MB）使其熒光強(qiáng)度降低，通過(guò)測(cè)定亞甲藍(lán)的熒光間接測(cè)定頭孢菌素的含量，結(jié)合-環(huán)糊精（-CD）可以顯著增敏亞甲藍(lán)的熒光，建立了一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的測(cè)定頭孢氨芐與頭孢拉定的新方法。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定頭孢氨芐與頭孢拉定的線性范圍分別為0.

2、0012.8 mg/L、0.00082.2 mg/L，檢出限分別為0.0002 mg/L、0.0006 mg/L。本方法操作方便, 穩(wěn)定性好, 靈敏度高,檢出限低，可作為痕量頭孢氨芐與頭孢拉定的檢出分析方法。關(guān)鍵詞：-環(huán)糊精；亞甲基藍(lán)；頭孢氨芐；頭孢拉定；溴酸鉀-溴化鉀；熒光方法 頭孢菌素類抗生素是一類臨床使用極為廣泛的廣譜抗生素。頭孢氨芐(cephalexin, CPX)和頭孢拉定(cephradine, CPD)同屬于第一代頭孢菌素類抗生素,與同類藥物相比對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌具有更強(qiáng)的抗菌作用,且價(jià)格較低廉,故使用更為廣泛。對(duì)此類頭孢菌素的測(cè)定已見(jiàn)報(bào)道的方法有分光光度法 1-3 、熒光法4-7

3、、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法 8-9、高效液相色譜法10、電化學(xué)分析法11等。但分光光度法的靈敏度不夠，高效液相色譜法所需設(shè)備較昂貴,難于普及，而已報(bào)道的熒光法以及化學(xué)發(fā)光法均需對(duì)此類藥物先在強(qiáng)酸介質(zhì)或強(qiáng)堿介質(zhì)中水浴加熱水解20 min使其生成熒光產(chǎn)物，分析過(guò)程較長(zhǎng)且步驟繁瑣。本文基于Br2既能氧化頭孢菌素，又能與亞甲基藍(lán)（MB）發(fā)生氧化反應(yīng)，使MB熒光強(qiáng)度降低，加入適量的-環(huán)糊精后，-環(huán)糊精與MB形成包合物，使MB熒光強(qiáng)度增至原來(lái)的2倍，建立了一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的測(cè)定頭孢氨芐與頭孢拉定的新方法。與文獻(xiàn)4-7相比較，本法具有更高的靈敏度和更低的檢測(cè)限，而且操作更簡(jiǎn)單，已直接應(yīng)用于頭孢氨芐與頭孢拉定膠

4、囊中CPX和CPD含量的測(cè)定，結(jié)果令人滿意。 1 實(shí)驗(yàn)部分1.1 儀器與主要試劑FP-6500型熒光光譜儀日本JASCO公司；UV-1700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)SHIMADZU；BS-110S 型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。-環(huán)糊精（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，使用前經(jīng)沸水重合晶兩次，化學(xué)純）：1.0×10-2 mol/L；亞甲基藍(lán)（上海試劑三廠）：1.0×10-4 mol/L； 鹽酸: 5 mol/L；KBrO3（上海試劑二廠）-KBr（北京化工廠）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液12：250 mg/L（準(zhǔn)確稱取0.0250 g KBrO3，0.2500 g KBr與100 mL容量瓶中

5、，并用二次蒸餾水稀釋至刻度），每次使用前稀釋成25 mg/L的工作液；頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品（CPX，中國(guó)藥品生物制品檢定所）儲(chǔ)備液：100 mg/L（保存在棕色瓶中），每次使用前稀釋成10 mg/L的工作液；頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)品（CPD，中國(guó)藥品生物制品檢定所）儲(chǔ)備液：100 mg/L（保存在棕色瓶中），每次使用前稀釋成10 mg/L的工作液；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。1.2 實(shí)驗(yàn)方法在10 mL比色管中依次加入10 mg/L的頭孢菌素溶液3 mL，5 mol/L 鹽酸0.4 mL，25 mg/L KBrO3-KBr溶液0.6 mL搖勻，反應(yīng)10 min；然后加入1.0×10-

6、4 mol/L亞甲基藍(lán)溶液1.0 mL，反應(yīng)10 min后再加入3 mL的-CD，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置30 min后，以660 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度F，在同樣的條件下掃描其紫外-可見(jiàn)光譜。2 結(jié)果與討論2.1 熒光光譜及紫外-可見(jiàn)光譜按的實(shí)驗(yàn)步驟，分別繪制了在5 mol/L的HCl介質(zhì)環(huán)境中，亞甲基藍(lán)在-CD和水溶液中的熒光光譜圖和紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖。由圖1可看出，-CD加入后，MB的熒光強(qiáng)度大大提高（曲線1e和1f）；頭孢菌素加入后，由于頭孢菌素與Br2發(fā)生氧化反應(yīng)，減少了Br2對(duì)亞甲藍(lán)的氧化，使得亞甲藍(lán)的熒光進(jìn)一步增強(qiáng)（曲線1a和1c；曲線1b和1d），這樣可以在

7、較低濃度下測(cè)定頭孢菌素的含量；不管是熒光強(qiáng)度F還是吸光度A加入-CD后均大大提高；這些證明-CD可以作為增敏MB的敏化劑。圖1 熒光發(fā)射光譜Fig. 1 Emission spectra 圖2 紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖Fig. 2 Absorption spectraCHCl: 2×10-1 mol/L；CCPD: 3mg/L；CCPX: 3mg/L；C KBrO3-KBr: 1.5 mg/L；CMB: 1×10-5 mol/L；C-CD: 3×10-3 mol/L2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化反應(yīng)介質(zhì)及酸度確定分別以不同濃度的HCl為反應(yīng)介質(zhì)測(cè)定亞甲藍(lán)的熒光強(qiáng)度F，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

8、：在5 mol/LHCl溶液的介質(zhì)中熒光強(qiáng)度最大，進(jìn)一步研究表明HCl溶液加入量超過(guò)0.4 mL后，隨著HCl濃度增大熒光強(qiáng)度減小，本實(shí)驗(yàn)選擇5 mol/L HCl溶液加入量為0.4 mL。 KBrO3-KBr溶液用量選擇在0.12.0 mL體積范圍內(nèi)，試驗(yàn)了25 mg/L KBrO3-KBr溶液的用量對(duì)亞甲藍(lán)熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，隨著KBrO3-KBr溶液用量的增加，其F值先保持不變而后隨著KBrO3-KBr溶液的用量的增加而下降，如圖3所示，當(dāng)KBrO3-KBr溶液的用量在0.4mL時(shí)，體系中的頭孢菌素已經(jīng)反應(yīng)完全，當(dāng)KBrO3-KBr溶液的用量超過(guò)0.4mL時(shí)，與頭孢菌素反應(yīng)后剩余的

9、KBrO3-KBr在酸性介質(zhì)中可以氧化亞甲藍(lán)，使亞甲藍(lán)的熒光強(qiáng)度降低，為提高其靈敏度選擇KBrO3-KBr溶液的用量為0.6 mL。圖3 KBrO3-KBr的量Fig. 3 Effect of KBrO3-KBra: CPD+ KBrO3-KBr+MB+-CD； b: CPX+ KBrO3-KBr+MB+-CDCHCl: 2×10-1 mol/L；CCPD: 3mg/L；CCPX: 3mg/L；C KBrO3-KBr: 1.5 mg/L；CMB: 1×10-5 mol/L；C-CD: 3×10-3 mol/L -環(huán)糊精的量的影響按照實(shí)驗(yàn)方法，只改變-CD的加入量，

10、結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著-CD濃度的增大，體系熒光強(qiáng)度依次增大，當(dāng)-CD加入量大于2.5 mL時(shí)，F(xiàn)幾乎保持不變，故選擇-環(huán)糊精加入量為3 mL。 溫度的選擇按照實(shí)驗(yàn)方法，分別測(cè)定了在0，10，20，30和40條件下不同溫度對(duì)熒光強(qiáng)度F的影響。隨著溫度的增加，體系的熒光強(qiáng)度F逐漸減??；原因是隨著T的增大，-CD/MB包合物穩(wěn)定性逐漸降低，MB失去了-CD疏水性空腔對(duì)其激發(fā)態(tài)的屏蔽保護(hù)作用，導(dǎo)致F隨T增大而減小。從線性范圍和實(shí)驗(yàn)條件來(lái)綜合考慮的話，本文選擇室溫作為實(shí)驗(yàn)溫度。2.2.5 加入順序和反應(yīng)時(shí)間的影響實(shí)驗(yàn)表明，試劑加入順序?yàn)轭^孢菌素溶液、HCl溶液、KBrO3-KBr、MB、-CD最佳。室溫下，研究

11、了160 min之間體系F隨反應(yīng)時(shí)間的變化情況。隨著時(shí)間的增加體系F值逐漸增大，25 min后F達(dá)到最大且穩(wěn)定，且至少可穩(wěn)定2小時(shí)以上，故本實(shí)驗(yàn)選擇在30 min后進(jìn)行測(cè)定。2.3 干擾實(shí)驗(yàn)考察了頭孢拉定及頭孢氨芐膠囊中共存組分的干擾情況,結(jié)果表明,對(duì)于質(zhì)量濃度為3 mg/L的頭孢拉定和頭孢氨芐,500 倍的K+、Na +、Zn2 +、硬脂酸鎂,100 倍的淀粉、Ca2 +、Mg2 +、PO43 - 均不產(chǎn)生干擾。2.4 工作曲線及檢出限按優(yōu)化條件測(cè)定不同濃度的頭孢菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液。頭孢氨芐與頭孢拉定分別在0.0012.8 mg/L、0.00082.2 mg/L 范圍內(nèi)與F呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲

12、線方程：頭孢氨芐：F =99.01c（mg/L）+ 14.91，相關(guān)系數(shù)r = 0.9991；頭孢拉定：F =132.17c（mg/L）+ 25.54，相關(guān)系數(shù)r = 0.9998。對(duì)空白溶液進(jìn)行11次測(cè)量，以其標(biāo)準(zhǔn)偏差3倍除以斜率得出頭孢氨芐與頭孢拉定方程的檢出限分別為0.0002 mg/L、0.0006 mg/L。對(duì)濃度為10 mg/L的頭孢菌素標(biāo)準(zhǔn)溶進(jìn)行十一次平行測(cè)定，頭孢氨芐與頭孢拉定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3 %、1.1%。2.5 機(jī)理初探本文對(duì)相關(guān)反應(yīng)物及反應(yīng)產(chǎn)物在UV-1700 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)下進(jìn)行掃描, 其掃描結(jié)果如圖4,因頭孢氨芐在262 nm處有特征吸收,故可通過(guò)262

13、nm處峰值的變化來(lái)考察反應(yīng)的進(jìn)行情況;經(jīng)比較從曲線4a到4b,可以認(rèn)為曲線4b中大部分頭孢氨芐已被Br2氧化;同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)記載8,頭孢氨芐的水溶液在262 nm處有最大吸收,是因?yàn)轭^孢氨芐分子中含有生色團(tuán)O = C N C = C,所以可以認(rèn)為圖4的262 nm處的吸收峰與此生色團(tuán)有關(guān),隨著反應(yīng)的進(jìn)行峰值的降低可知，該官能團(tuán)已發(fā)生反應(yīng)；由此得出該官能團(tuán)參與了化學(xué)反應(yīng)的結(jié)論。因?yàn)轭^孢拉定同樣含有這個(gè)生色團(tuán)O = C N C = C，所以也可以采用溴水氧化亞甲藍(lán)的熒光法測(cè)定頭孢拉定的含量。圖4 紫外吸收光譜圖Fig. 4 Absorption spectraCHCl: 2×10-1 mo

14、l/L；CCPX: 3mg/L；C KBrO3-KBr: 1.5 mg/L；2.6 分析應(yīng)用采用本法對(duì)市售頭孢氨芐膠囊（石藥集團(tuán)歐意有限公司），頭孢拉定膠囊（石藥集團(tuán)歐意有限公司）中頭孢氨芐與頭孢拉定含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。結(jié)果令人滿意。表1 實(shí)際樣品中頭孢菌素含量的測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results for the determination of CPX and CPD in samples (n=5)樣品測(cè)定值/ ( mg/L )標(biāo)準(zhǔn)加入量/ ( mg/L )回收量/ ( mg/L )回收率RSDCPX膠囊0.98371.00001.979699.61.5CPD膠囊0.99791.

15、00002.0011100.31.2參考文獻(xiàn)1 K.BASAVALAH, U.R. ANIL KUMAR, E-Journal of Chemistry, 2007,4 (2):154-156.2 Abdel-Gawad F M , E L-Guindi N M. J . Pharm.Sci ,1998,29(1-4):2633 Issopoulos P B. Analyst ,1988,113 (7):10834 Yang Jing he, Ma Quanli, Wu Xia, et al . Anal Lett, 1999,32( 3):471 5 Hefrawy M, El2Shabra

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18、; China）Abstract：In hydrochloric acidic medium , cephalosporins could react with a known excess of bromate-bromide mixture, meanwhile, the fluorescence intensity of methylene blue (MB) oxidized is decreased by residual bromine. The indirect determination of cephalosporins can be achieved in accordance with the fluorescence intensity of MB, after adding