感覺(jué)神經(jīng)肽P物質(zhì)在損傷修復(fù)中的作用及分子機(jī)制(一)_第1頁(yè)
感覺(jué)神經(jīng)肽P物質(zhì)在損傷修復(fù)中的作用及分子機(jī)制(一)_第2頁(yè)
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1、感覺(jué)神經(jīng)肽P物質(zhì)在損傷修復(fù)中的作用及分子機(jī)制一【摘要】為探討感覺(jué)神經(jīng)肽P物質(zhì)SP在損傷修復(fù)中的作用,圍繞感覺(jué)神經(jīng)與修復(fù)進(jìn)程中創(chuàng)面/傷口 SP代謝的關(guān)系、SP在修復(fù)細(xì)胞表達(dá) 生長(zhǎng)因子及受體、表皮干細(xì)胞遷移、分化等方面的作用開(kāi)展了研究。 研究證實(shí)感覺(jué)神經(jīng)釋放的SP可上調(diào)成纖維細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)肽,誘導(dǎo)成纖 維細(xì)胞表達(dá)生長(zhǎng)因子及受體,調(diào)控表皮干細(xì)胞遷移、分化的作用,進(jìn) 入肉芽組織內(nèi)的表皮干細(xì)胞可跨胚層向血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分 化,提示感覺(jué)神經(jīng)肽SP參與介導(dǎo)感覺(jué)神經(jīng)調(diào)控?fù)p傷修復(fù)?!娟P(guān)鍵詞】感覺(jué)神經(jīng)肽損傷修復(fù) P物質(zhì)Effectofse nsory neuropeptideSP onwoun dheali

2、 ngan ditsmolecularmecha nis mAbstract:Toi nv estigatetheeffectofse nsory neuropeptidesubsta ncePSPo nwoun dheal ingan drelatedmolecularmecha nism.Theresearchwascarriedouto ntherelatio n shipbetwee nsen sory nervesa ndmetabolismofse nsory neuropeptideSP inth ewoun ds,theroleofSPi ntheexpressio no fg

3、rowthfactorsa ndthosereceptorsby repaircells,a ndparticipatio nin migrati onan ddiffere ntiatio no fepidermalstem cells.Theresultswereasfollows:SPreleasedfromse nsory nerves in ski nwounds up regulatedneuropeptideexpressionofthefibroblastcellsjnducedfibrobla stcellstoexpresssomegrowthfactorsa ndthos

4、ereceptors,playeda nimporta ntr ole in migrati onan ddiffere ntiatio no fepidermalstemcells,whichca ntran sdifferentiateintofibroblastorendothelialcellsifthestemcellsmigratedintogradurationtissue.TheresultssuggestthatSPasamediatorofsensorynerversparticipates intheregulationofwoundhealing.Keywords:se

5、nsoryneuropeptide;woundrepair;substanceP感覺(jué)神經(jīng)肽為感覺(jué)神經(jīng)元胞體合成的一類神經(jīng)肽,包括P物質(zhì)(SP)降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)神經(jīng)肽Y(NY) K物質(zhì)等,其中SP與損傷修復(fù) 關(guān)系最為密切。組織損傷可刺激感覺(jué)神經(jīng)末梢儲(chǔ)存的 SP進(jìn)入損傷組織, 與巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞的特異受體結(jié)合,通過(guò) 刺激免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,參與組織修復(fù)早期的炎癥階段的調(diào)控; SP與成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞相應(yīng)受體結(jié)合,可促 進(jìn)DNA合成和細(xì)胞增殖1。由于感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放的SP受內(nèi)肽酶降解,半衰期僅數(shù)分鐘,因而以 往認(rèn)為SP對(duì)組織修復(fù)的影響有限。近

6、年來(lái)研究已證實(shí),與組織修復(fù)有 關(guān)的成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞也可表達(dá)SP,損傷組織中SP含量變化與感 覺(jué)神經(jīng)纖維的數(shù)量以及愈合類型關(guān)系密切:在肉芽組織增生階段,感 覺(jué)神經(jīng)纖維的數(shù)量和SP含量均高于肉芽組織成熟期;增生性瘢痕組織 中SP含量高于正常皮膚或生理愈合的瘢痕組織2。因此,人們推測(cè) 感覺(jué)神經(jīng)釋放的SP和組織細(xì)胞表達(dá)的SP存在某種聯(lián)系,SP是周圍神 經(jīng)調(diào)控組織修復(fù)重要因子。為了驗(yàn)證上述假設(shè),作者所在的課題組對(duì) 此開(kāi)展了較深入的研究,本文報(bào)告其主要研究成果。1SP為介導(dǎo)感覺(jué)神經(jīng)調(diào)控傷口愈合的重要細(xì)胞因子以大劑量辣椒素化學(xué)毀損成年大鼠感覺(jué)神經(jīng)后行皮膚全層切割傷辣 椒素組,免疫組化示肉芽組織細(xì)胞間隙、

7、成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管周圍 SP CGRP免疫陽(yáng)性染色明顯弱于感覺(jué)神經(jīng)正常組,傷后3天、9天,辣椒素組SP CGRP免疫陽(yáng)性染色的吸光度分別為感覺(jué)神經(jīng)正常組 53.23%、64.80%和42.70%、40%3。辣椒素組大鼠傷口愈合延遲明 顯,傷后12天傷口面積仍為感覺(jué)神經(jīng)正常組的 2倍,肉芽組織肌成纖 維細(xì)胞標(biāo)識(shí)物彳 肌動(dòng)蛋白Q SMA數(shù)量減少4。鏈脲佐菌素STZ 誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠的皮膚感覺(jué)神經(jīng) A3類有髓神經(jīng)髓鞘水腫、變性, 無(wú)髓神經(jīng)空泡樣變性,微管、微絲排列紊亂,酶聯(lián)免疫ELISA檢測(cè)示皮膚SP含量?jī)H為正常皮膚的24.64%- 38.35% 5。胎兔損傷皮膚修復(fù)呈無(wú)瘢痕愈合,免疫組化示愈

8、合皮膚SP CGRP陽(yáng)性 染色數(shù)量低于成年兔。將已浸泡10-4mol/LSP的聚乙烯醇海綿放置于胎 兔皮膚切口內(nèi),然后將胎兔送回子宮內(nèi),傷后7天剖腹取出致傷胎兔, 見(jiàn)胎兔皮膚切口處有明顯瘢痕形成;如胎兔皮膚切口內(nèi)放置已浸泡生 理鹽水SP溶劑的海綿,愈合皮膚無(wú)瘢痕,鏡下無(wú)明顯纖維組織增 生以及膠原沉積6。研究結(jié)果提示,胎兒皮膚無(wú)瘢痕愈合與 SP低水 平表達(dá)有關(guān)。2成纖維細(xì)胞、表皮干細(xì)胞SP表達(dá)受外源性SP調(diào)控采用定量PCR Westernblot、ELISA等方法證實(shí)表皮干細(xì)胞可表達(dá) SR 為了解感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽對(duì)修復(fù)細(xì)胞表達(dá) SP的作用,以SP10-510-7mol/L刺激體外培養(yǎng)的皮

9、膚和增生性瘢痕的成纖維細(xì)胞、皮膚表皮干細(xì)胞,分別檢測(cè)刺激前后細(xì)胞內(nèi) SP基因、蛋白表達(dá)和培養(yǎng) 液中SP濃度。結(jié)果說(shuō)明外源性SP刺激后,皮膚和增生性瘢痕成纖維 細(xì)胞SPmRNA水平和培養(yǎng)液中SP濃度均顯著升高,刺激后24小時(shí)仍 高于刺激前水平,皮膚成纖維細(xì)胞 SP基因和蛋白表達(dá)的峰值時(shí)相較增 生性瘢痕提前3小時(shí)7SP刺激表皮干細(xì)胞后3小時(shí),內(nèi)源性SP基 因和蛋白表達(dá)顯著上調(diào),分別在刺激后14小時(shí)和18小時(shí)到達(dá)峰值;阻斷SP特異受體(陋1和NK 2)抑制SP表達(dá)上調(diào)8。上述結(jié)果 說(shuō)明成纖維細(xì)胞、表皮干細(xì)胞表達(dá) SP受外源性SP的影響,提示在皮 膚損傷時(shí)存在感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放 P物質(zhì)可引起修復(fù)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)

10、程神經(jīng) 內(nèi)分泌反響,這可能是損傷組織 P物質(zhì)含量高的重要原因。3SP可調(diào)控肉芽組織成纖維細(xì)胞表達(dá)生長(zhǎng)因子及受體3.1SP調(diào)控生長(zhǎng)因子及受體表達(dá)的量效與時(shí)效特征以往研究已證實(shí),SP可刺激免疫細(xì)胞釋放生長(zhǎng)因子,但對(duì)修復(fù)細(xì)胞的作用尚無(wú)報(bào)告。本研 究發(fā)現(xiàn)大鼠皮下注射辣椒素 50mg/kg毀損感覺(jué)神經(jīng)1周后行皮膚全層 切割傷,傷口肉芽組織SP免疫陽(yáng)性染色減弱與表皮生長(zhǎng)因子(EGF及受 體(EGFR、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF 2)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 1(FGFR 1)的基因表達(dá)抑制同步。不同濃度(10-910-5mol/L)SP作 用于培養(yǎng)大鼠肉芽組織成纖維細(xì)胞,RT PCR、Westernbl

11、ot檢測(cè)示SP 可上調(diào)培養(yǎng)肉芽組織成纖維細(xì)胞表達(dá)EGF FGF 2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子卩l(xiāng)(TGFp 1)及其受體的基因和蛋白表達(dá)。調(diào)控生長(zhǎng)因子與受體表達(dá) 的SP濃度閾值不同,通常上調(diào)生長(zhǎng)因子表達(dá)的SP濃度低于對(duì)相應(yīng)受體上調(diào)的濃度,如上調(diào)成纖維細(xì)胞內(nèi)源性 EGFmRNA EGFRmRNA表達(dá)的SP濃度分別為10-810-6mol/L和10-610-5mol/L,上調(diào)FGF 2和 FGFR lrnRNA表達(dá)的sp濃度分別為 10-9io-5moi/L和io-6 10-5mol/L 9。采用上調(diào)上述生長(zhǎng)因子及受體表達(dá)至峰值的 SP濃度作用于成纖維細(xì)胞, 觀察作用后表達(dá)的時(shí)效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證實(shí),SP作用后上述

12、生長(zhǎng)因子及受體mRNA表達(dá)大多持續(xù)至作用后6小時(shí),蛋白質(zhì)水平表達(dá)持續(xù)至16 24 小時(shí)9, 10。上述研究結(jié)果提示,SP不僅有直接促進(jìn)損傷修復(fù)的作用1,同時(shí)上 調(diào)肉芽組織成纖維細(xì)胞表達(dá)生長(zhǎng)因子與受體, 放大 S的促修復(fù)作用; 調(diào)控不同的生長(zhǎng)因子與受體表達(dá)的 SP濃度閾值不同。3.2成纖維細(xì)胞核因子NF KB激活是SP上調(diào)生長(zhǎng)因子表達(dá)的重要通路 NF幽是存在細(xì)胞漿的快反響轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控眾多的細(xì)胞因子和生長(zhǎng) 因子的表達(dá),以凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)EMSA檢測(cè)SP刺激后的成纖維細(xì)胞 NF KB的DNA結(jié)合活性。研究發(fā)現(xiàn)10-7mol/L濃度SP作用30分鐘, NF KB活性可到達(dá)峰值;SP特異的受體NK1受

13、體阻斷劑GR73632 可阻斷SP的刺激效應(yīng)。SP對(duì)NF KB的活化可分別被抗氧化劑 PDTC 和鈣離子拮抗劑BAPTA AM抑制,提示sp的活化作用可能是通過(guò)氧 自由基和鈣離子介導(dǎo)。采用NF kB硫代寡核苷酸圈套能明顯抑制成纖 維細(xì)胞FGF 2表達(dá),但對(duì)EGF表達(dá)無(wú)明顯作用11, 12。4SP在表皮干細(xì)胞遷移、分化中的作用及機(jī)制4.1SP是調(diào)控表皮干細(xì)胞增殖、遷移、分化的重要因子采用STZ糖尿病大鼠模型,觀察皮膚神經(jīng)肽含量病理性減少對(duì)表皮干細(xì)胞增殖的影響, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射STZ后 1周至4周,糖尿病大鼠皮膚SP含量與表皮 基底層表皮干細(xì)胞標(biāo)識(shí)物B1整合素、K19陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)均呈進(jìn)行 性下

14、降,兩者明顯相關(guān);STZ糖尿病大鼠創(chuàng)面局部應(yīng)用 SP創(chuàng)緣及新 生上皮B1整合素、K19陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增加13。提示SP 是維持表皮干細(xì)胞增殖的重要因子。以往認(rèn)為表皮干細(xì)胞的遷移、分化主要與細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變、細(xì) 胞之間的接觸、EGF FGF等細(xì)胞因子的作用有關(guān),對(duì)感覺(jué)神經(jīng)肽的作 用了解甚少。本研究利用干細(xì)胞核標(biāo)記滯留的慢周期性,以5溴2 尿嘧啶脫氧核苷BrdU注射Wistar新生鼠,8周后行皮膚全層切割傷, 觀察傷口內(nèi)BrdU和表皮干細(xì)胞標(biāo)志物K19、B1整合素雙重免疫陽(yáng)性 的細(xì)胞分布與傷口應(yīng)用 SP的關(guān)系14。研究發(fā)現(xiàn)皮膚全層切割傷后 創(chuàng)緣與創(chuàng)面中每日注射 SP10-7mol/L

15、250卩11次,傷后3天和5天分 別在創(chuàng)緣和肉芽組織可見(jiàn) BrdU及K19、B1整合素免疫陽(yáng)性細(xì)胞,說(shuō)明 表皮干細(xì)胞已遷移進(jìn)入上述組織;未注射 SP的大鼠創(chuàng)緣陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明 顯少于注射SP的大鼠,肉芽組織也未見(jiàn)免疫陽(yáng)性細(xì)胞。如以大劑量辣 椒素預(yù)先毀損感覺(jué)神經(jīng)后行皮膚切割傷,傷后3天創(chuàng)緣BrdU陽(yáng)性數(shù)僅 為未注射SP的大鼠的14.43% 14。進(jìn)一步研究說(shuō)明,遷移入肉芽組 織的表皮干細(xì)胞除可分化為成纖維細(xì)胞外,也可跨胚層分化為血管內(nèi) 皮細(xì)胞。此外,有文獻(xiàn)報(bào)告,在損傷角膜局部,應(yīng)用SP可誘導(dǎo)血液中 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向損傷部位遷移,促進(jìn)修復(fù) 15。為了解SP對(duì)表皮干細(xì)胞分化方向的影響,將10-7mol/L濃度SP參加表 皮干細(xì)胞培養(yǎng)液中,參加后 96 小時(shí),流式細(xì)胞儀檢測(cè)示, 89.7%的干 細(xì)胞分化為整合素a6和CD71高表達(dá)的短暫擴(kuò)充細(xì)胞,對(duì)照組無(wú)變化16。將SP分別參加BrdU標(biāo)記的大鼠表皮干細(xì)胞(來(lái)源于表皮基底 層)培養(yǎng)液中,注射干細(xì)胞混懸液于毛囊發(fā)育不良的裸鼠皮下,并在 回植部位注射SP。注射干細(xì)胞混懸液28天后,參加SP的大鼠皮下毛 囊數(shù)目明顯較未參加SP的裸鼠增多,部份皮下毛囊的毛球、內(nèi)外毛根 鞘部位的細(xì)胞胞核中可見(jiàn) BrdU陽(yáng)性染色

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