基因組學(xué)2015課件專題

1、1siRNAs and miRNAs: Themes in Common6非編碼RNA 主要種類microRNAs (miRNAs)small interfering RNAs (siRNAs)Piwi-interacting RNAs (piRNAs)Long noncoding RNA(lncRNA)small nuclear RNAs (snRNAs)small nucleolar RNAs (snoRNAs)tRNA、rRNA5Science 296 1260 (2002)非編碼RNA的定義非編碼RNA( ncRNA)是指各種不編碼蛋白質(zhì)的RNA。其中包括多種功能已知的 RNA，如tR

2、NA， rRNA;還包括未知功能的RNA。這些RNA的共同特點(diǎn)是從組上轉(zhuǎn)錄而來，但是不翻譯成蛋白， 在RNA 水平上就能行使各自的生物學(xué)功能.4非編碼RNA的定義、種類中心法則RNA的發(fā)展歷程3John L. Rinn and Howard Y. Chang., Annu. Rev. Biochem., 2012主要內(nèi)容1, 非編碼RNA的定義、種類2, siRNA的功能3, miRNA的功能4, lncRNA(長鏈非編碼RNA)的功能5,其它非編碼RNA（diRNA、piRNA）的功能2表達(dá)調(diào)控的新視角-非編碼RNA22. siRNAs發(fā)現(xiàn)歷程1990年，Rich Jorgensen 在矮牽

3、?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)沉默（共抑制）1995年，Sun Guo 注入反義RNA及正義鏈RNA抑制線蟲par-1的表達(dá)； 三年后， Fire和Mello發(fā)展了通過RNAi 進(jìn)行線蟲敲除的策略(PTGS)。此后，又在果蠅、錐蟲、渦蟲、無脊椎動物、脊椎動物、植物、真菌、斑馬魚及哺乳動物幾乎所有的 物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了siRNA介導(dǎo)的RNAi現(xiàn)象。2001年Elbashir等 Nature上首次通過21個(gè)核苷酸的siRNA地在哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性基因沉默。近年來，顯微注射，槍，工程誘導(dǎo)RNAi也成為反向遺傳學(xué)研究中的重要工具。121. siRNA概念siRNA ：是一種小RNA（21-25nt），由RNAas

4、e 中對雙鏈RNA具有特異性的酶-Dicer 而成。每一條鏈各有一個(gè)5磷酸基末端與一個(gè)3羥基末端，這種小RNA特異性的識別靶并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平的沉默效應(yīng)，最終高效特異的阻斷的表達(dá)，甚至能達(dá)到敲除的效果。11siRNA的功能1. siRNA概念2. siRNA發(fā)現(xiàn)歷史3. siRNA造成的RNAi機(jī)制4. siRNA的分類及作用機(jī)理10AGO蛋白的結(jié)構(gòu)域及空間結(jié)構(gòu)9Argonaute由siRNA介導(dǎo)的RNAi途徑中， Argonaute蛋白可以用內(nèi)切核酸酶活性來沉默mRNA靶，這種過程被稱作切割。 Argonaute蛋白在進(jìn)化過程中演變出了各種亞科蛋白。這些亞科蛋白可以識別各種不同類型小

5、RNA，從而在各種小RNA沉默途徑中發(fā)揮作用。RISC1. TRBP能夠招 募Dicer復(fù)合體miRNA形成RISC Ago22. PIWI結(jié)構(gòu)域具有RNaseH樣的折疊情況， RISC中的酶切割活性中心3. siRNA是RISC完成特異性切割作用的向?qū)?Dicer 蛋白的結(jié)構(gòu)域及空間結(jié)構(gòu)Dicer酶是RNaseIII型中的蛋白酶，可特異識別并切割以各種方式進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的dsRNA. Dicer在RNAi及相關(guān)途徑中起重要作用，一方面可以切割外源dsRNA成為 siRNA來介導(dǎo)RNAi對外來核酸的抗性，另一方面可以內(nèi)源序列成miRNA來調(diào)節(jié)體內(nèi)表達(dá)，保證生物體的正常生長發(fā)育。Dicer主要由R

6、NA解旋酶結(jié)構(gòu)域、PAZ結(jié)構(gòu)域、RNase結(jié)構(gòu)域和dsRNA結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)域。3RISC（RNA-induced silencing complex ）RISC由siRNA、 解旋酶、ATP、核酸 內(nèi)切酶、核酸外切酶 等多種成分組成。活 化的RISC在單鏈 siRNA引導(dǎo)下識別互 補(bǔ)的mRNA，并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNA引導(dǎo) 鏈中心所對應(yīng)的靶基 因位置切割靶mRNA， 最后可能再被核酸外 切酶進(jìn)一步降解，從 而干擾表達(dá)。18效應(yīng)階段siRNA 在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing comp

7、lex，RISC)，并通過堿基配對結(jié)合到靶的序列上。 RISC RISC binding targeted RNA17起始階段第一步（起始階段）是較長ds RNA在ATP參與下被特異核酸酶Dicer切割成2123nt的和反義鏈組成的小干擾RNA（small interferingRNA，siRNA）。siRNA的兩條單鏈末端為5磷酸和3羥基，且3端均有3個(gè)突出的核苷酸。16RNAi機(jī)制中siRNA發(fā)揮的沉默作用起始階段效應(yīng)階段擴(kuò)增擴(kuò)散階段15 一方面結(jié)合mRNA的產(chǎn)物以siRNA作為引物 一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA. 以mRNA為模板 在依賴RNA的RNA聚合酶siRNA的

8、雙鏈解開變成單鏈 并和某些蛋白作用下出mRNA的互補(bǔ)鏈。新的長形成復(fù)合物。此復(fù)合物同與siRNA互補(bǔ)的 鏈dsRNA同樣可被切割生成大量的次級mRNA結(jié)合 使mRNA被RNA酶裂解。siRNA。次級siRNA又可進(jìn)入-切割的循14環(huán)過程 進(jìn)一步放大RNAi作用。3. siRNA造成的RNAi機(jī)制RNA interference（ RNAi） 在進(jìn)化過程中高度保守、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)并導(dǎo)致 同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。34ta-siRNA的產(chǎn)生及作用過程Liang W Long M and Yijun Q Plant Physiology July 30 20124.trans

9、-acting siRNAs (ta-siRNAs) Allen等(2005)對擬南芥miR173靶的序列分析發(fā)現(xiàn)，靶編碼一系列siRNA，并且都含有siR255及序列相似的siRNA，而siR255又類似miRNA一樣反式作用于其下游靶PPR(pentatricopeptide repeat)類蛋白的，因此這類由miRNA并能產(chǎn)生siRNA的分別被命名為trans-acting siRNAl（TAS1）。反式作用干擾小RNA是新近在植物中發(fā)現(xiàn)的依賴于miRNA、長度為21個(gè)堿基的小RNA，對植物的生長發(fā)育過程具有重要的表達(dá)調(diào)控功能。tasiRNA的生物需要有miRNA介導(dǎo)的非編碼轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的切

10、割。hc-siRNA作用機(jī)制1. 產(chǎn)生 hc-siRNA在轉(zhuǎn)座子等重復(fù)DNA序列區(qū)域產(chǎn)生。2. 出核 hc-siRNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，并且大部分以游離的雙鏈形式存在3. 變構(gòu) AGO4在HSP90蛋白的幫助下結(jié)合雙鏈siRNA， 然后通過其核酸內(nèi)切酶活性切割并降解其中一條鏈， 形成成 結(jié)合單鏈siRNA的AGO4效應(yīng)復(fù)合體。siRNA的結(jié)合很可能導(dǎo)致AGO4構(gòu)象發(fā)生變化， 出其核 信號，細(xì)胞因此可以選擇性的識別并轉(zhuǎn)運(yùn)成AGO4/siRNA復(fù)合體至細(xì)胞核內(nèi)。4. 入核 與AGO4蛋白結(jié)合形成效應(yīng)復(fù)合體。AGO4/siRNA復(fù)合體可進(jìn)一步招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DRM2等組分，特異性地識別同源DN

11、A序列并介導(dǎo)甲基化修飾。意義hc-siRNA的產(chǎn)生和最終 功能行使都在細(xì)胞核中 進(jìn)行，了以前人們 認(rèn)為的RdDM通路完全 在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行的成見。Ruiqiang Ye ，Molecular Cell, 20124. siRNA的分類及作用機(jī)理hc-siRNAs-Heterochromatic siRNAsphasiRNAs-Phased siRNAstasiRNAs-trans-acting siRNAs21siRNAs介導(dǎo)的RNAi作用特點(diǎn)：1. 高效性2. 濃度依賴性3. 高特異性4. RNAi對細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的影響性：RNA干擾在有效地沉默靶 的同時(shí)，對細(xì)胞本身的調(diào)控系統(tǒng)沒有影響5.高穩(wěn)定

12、性6. 遺傳性7. 放大效應(yīng)8. 作用廣泛性20擴(kuò)增擴(kuò)散階段(放大效應(yīng)) 模板 靶mRNA切割片段 引物 siRNA 產(chǎn)物 長鏈dsRNA 依次循環(huán)新的長鏈dsRNA同樣可被Dicer切割、降解生成大量的次級siRNA。次級siRNA又可進(jìn)入-切割的循環(huán)過程，進(jìn)一步放大RNAi作用。siRNA在RNAi途徑中發(fā)揮重要的作用，但隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)的siRNA類型越來越多，發(fā)揮作用的方式也多樣性。19RNAi途徑中siRNA作用 movie5canonical miRNAs1. 水稻中，有6個(gè)DCL蛋白（OsDCL1、OsDCL2a/b、OsDCL3a/b 和OsDCL4），2. OsDCL1對于

13、水稻miRNA的產(chǎn)生有重要作用.幾乎所有 miRNA都是由DCL1剪切而來。3. 檢測來源于反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的siRNA數(shù)量變化發(fā)現(xiàn)，在dcl1 突變體中，siRNA數(shù)量沒有明顯變化，但在dcl4突變體中，來源于此結(jié)構(gòu)的21 nt siRNA幾乎完全消失，表明OsDCL4對于這種siRNA的產(chǎn)生有重要作用。Bin Liu Plant Physiology 2005A2. miRNA的cmiRNAs-Canonical miRNAslmiRNAs-long miRNAsnat-miRNAs-Natural cis-miRNAs29近年來被鑒定的miRNAs越來越多至今超過17000 miRNAs已被

14、發(fā)現(xiàn)28microRNA的發(fā)現(xiàn)Victor AmbrosGary Ruvkun 第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的miRNA (lin-4)由哈佛大學(xué)的Victor Ambros發(fā)現(xiàn)的（1993） 第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的miRNA（let-7）由哈佛大學(xué)的博士后Frank Slack (Ruvkun）發(fā)現(xiàn)的（2000)271. microRNA概念及發(fā)現(xiàn)MicroRNAs（miRNAs）是在物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA， 其大小長約2025個(gè)核苷酸。通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。26miRNA的功能1. miRNA概念及

15、發(fā)現(xiàn)2. miRNA的3. miRNA介導(dǎo)靶沉默作用機(jī)制4. miRNA產(chǎn)生特點(diǎn)5. miRNA功能研究思路256 第一種是切斷靶的mRNA。miRNA與靶標(biāo) 完全互補(bǔ)結(jié)合，作用方式和功能與siRNA非常類似，最后切割靶mRNA植物中，大部分microRNA都以這種方式， 靶mRNA斷裂后，無poly（A）的的3端加上多個(gè)U并很快降解，含poly（A）的能穩(wěn)定存在一 段時(shí)間(如擬南芥miR-171）。36microRNA對靶的抑制miRNARISC對靶 mRNA的抑制主要取決于它與靶 轉(zhuǎn)錄體序列互補(bǔ)的程度，有3種方式。結(jié)合抑切割抑制制:切割or 抑制35343. miRNA介導(dǎo)靶沉默機(jī)制33n

16、atural antisense miRNAs (nat-miRNAs)nat-siRNAs1 靶標(biāo)是位于水稻細(xì)胞DNA反向鏈上它們直接面對的2 這類微RNA沒有存在于常見的研究用植物擬南芥中，只在葉植物中發(fā)現(xiàn)了這種新型的小RNA。Cheng Lu,PNAS,2008long miRNAs (lmiRNAs)1. lmiRNAs由另一個(gè)Dicer成員，DCL3切割產(chǎn)生，并與AGO4亞蛋白形成RISCs。2. lmiRNAs與AGO4的特異性互作不僅取決于lmiRNAs的5 末端核苷酸，而且依賴于上游lmiRNAs的產(chǎn)生機(jī)制。3. lmiRNAs不是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控Liang Wu，Molecu

17、lar Cell,201075.2 導(dǎo)入外源片段競爭miRNA，使其不能結(jié)合內(nèi)源性靶Artificial target mimics of miR156WT35S:MIMI156b42Franco-Zorrilla JM, Nat Genet 20075.1 改變植物體中miRNA的表達(dá)量WT35S:miR156bThe 35S:miR156b plant, which is about 7 months old, has many more, but smaller, leaves41Schwab R, Dev Cell. 20055. 植物miRNA的功能研究思路miRNA的正常表達(dá)是植物

18、正常生長發(fā)育所必需的，如何研究miRNA對靶標(biāo)的調(diào)控作用？研究思路5.1 改變植物體中miRNA的表達(dá)量。5.2 導(dǎo)入外源片段競爭miRNA，使其不能結(jié)合內(nèi)源性靶。5.3 通過轉(zhuǎn)改變植物中靶mRNA 的序列使其具有抗miRNA降解的能力。404 miRNAs產(chǎn)生特點(diǎn)1 miRNA前體通過RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄生成，具有mRNA的結(jié)構(gòu)特征。2 具有多順反子結(jié)構(gòu)即一條pri-miRNA包含多個(gè)成熟miRNA的信息。3 miRNA可來源于外顯子,也可來源于內(nèi)含子和非編碼序列。4 miRNA在組座位上分布，處于同一族的miRNA常共表達(dá)。5 對于同一miRNA，其功能常具有互補(bǔ)作用。6 不同miRNA可

19、同時(shí)調(diào)節(jié)同一靶mRNA。39 第三種是結(jié)合抑制具有以上兩種作let-7用模式：當(dāng)與靶標(biāo)基因完全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)， 直接靶向切割mRNA； 當(dāng)與靶標(biāo)全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，起調(diào)節(jié)表達(dá)的作用。Target knockdown38 第二種是抑制靶的翻譯作用時(shí)與靶標(biāo)不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而阻遏翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性，這種miRNA是目前發(fā)現(xiàn)最多的種類(線蟲lin- 4).在動物體內(nèi)，大部分miRNA不能與靶的轉(zhuǎn)錄體完全配對，故被認(rèn)為主要通過翻譯抑制的方式來調(diào)控靶。在植物中極少數(shù)的microRNA通過此方式來抑制靶。378作用機(jī)理Archetype I as signals, lncRNA expression ca

20、n faithfully reflect the combi-natorial actions of transcription factors (colored ovals) or signaling pathways to indicate gene regulation in space and time.Archetype II as decoys, lncRNAs can titrate transcription factors and other proteins away from chromatin or titrate the protein factors into nu

21、clear subdomains. A further example of decoys is lncRNA decoy for miRNA target sites.Archetype III as guides, lncRNAs can recruit chromatin-modifying enzymes to target genes, either in cis (near the site of lncRNA production) or in trans to distant target genes.Archetype IV as scaffolds, lncRNAs can

22、 bring together multiple proteins to form ribonucleoprotein complexes. The lncRNA-RNP may act on chromatin as illustrated to affect histone modifications. In otherinstances, the lncRNA scaffold is structural and stabilizes nuclear structures or signaling complexes.2.lncRNA作用機(jī)制47Long Noncoding RNAs定義

23、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)長度200個(gè)核苷酸缺少特異完整的開放閱讀框序列保守性差（物種特異性）表達(dá)量低和組織特異性無蛋白質(zhì)編碼功能461.lncRNA的發(fā)現(xiàn)及概念Long Noncoding RNAs ，起初被認(rèn)為是 組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能。然而，近年來的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默， 組印記以及染色質(zhì)修飾，轉(zhuǎn)錄激活，轉(zhuǎn)錄干擾，核內(nèi) 等多種重要的調(diào)控過程，這些調(diào)控4作5 用也開始引起人們廣泛的關(guān)注。lncRNA(長鏈非編碼RNA)的功能-組的暗物質(zhì)1. lncRNA的發(fā)現(xiàn)及概念。2. lncR

24、NA作用機(jī)制。3. lncRNA作用特點(diǎn)。445.3 通過轉(zhuǎn)改變植物中靶mRNA的序列使其具有抗miRNA降解的能力改變靶重要堿基（同義突變），miRNA不能識別靶。439 lncRNA在多個(gè)水平上參與調(diào)控lncRNA可通過多種途徑、在多個(gè)水平調(diào)節(jié)的表達(dá)。（1） 轉(zhuǎn)錄前水平-甲基化修飾、組蛋白修飾等（2） 轉(zhuǎn)錄水平-干擾轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合等（3） 轉(zhuǎn)錄后水平- 作為小RNA的前體，以小RNA發(fā)揮切割靶的作用。（4） 蛋白水平-改變蛋白質(zhì)活性或亞細(xì)胞等。54 種類、數(shù)量、功能都不明確在20世紀(jì)80年代，人們首次鑒定出lncRNAs。當(dāng)前人們已經(jīng)在多種哺乳動物組織中研究了大約100種lncRNA

25、s 。雖然近年來關(guān)于lncRNA的研究進(jìn)展迅猛，但是絕大部分的lncRNA的功能仍然是未知的。53相比蛋白編碼,更嚴(yán)格的功能限制大多數(shù)的lncRNAs在組織分化發(fā)育過程中， 都具有明顯的時(shí)空表達(dá)特異性， 人 小鼠的1300個(gè)lncRNAs進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在腦組織中的不同部位，lncRNAs具有不同的表達(dá)模式。52進(jìn)化速度快，序列的不保守性與編碼 相比， lncRNA序列保守性差，進(jìn)化快，但啟動子區(qū)域相當(dāng)保守。 同樣可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，局部染色質(zhì)組蛋白同樣具有特征性的修飾方式與結(jié)構(gòu)特征。分析發(fā)現(xiàn)，哺乳動物體內(nèi)lncRNA達(dá)1 000多種， 可通過蛋白質(zhì)編碼序列轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷幋a序列后轉(zhuǎn)錄而得到，或由去除了

26、外顯子的 序列轉(zhuǎn)錄而來， 其表達(dá)具有組織和時(shí)空特異性。與編碼蛋白質(zhì)的相比，lncRNA序列的保守性較差。513 lncRNA作用特點(diǎn) lncRNAs通常為長度200個(gè)核苷酸的RNA。具有mRNA樣結(jié)構(gòu)，經(jīng)過剪接，具有polyA尾巴與啟動子，多數(shù)由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，發(fā)育過程中有動態(tài)的表達(dá)與不同的剪接方式，比編碼可塑性更大。50植物中已的lncRNA作用途徑49102. repeated-associated siRNA (rasiRNA)piwi-interacting RNAs重復(fù)序列相關(guān)小干擾RNA前體由重復(fù)元件編碼的，大部分都是轉(zhuǎn)座子或反轉(zhuǎn)座子序列，編碼的小RNA 沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)，

27、 rasiRNA 在異染色質(zhì)重塑，穩(wěn)定方面起作用。（RasiRNAs are called piRNA since 2007）piRNA因其可與名為PIWI蛋白的Argonaute蛋白相結(jié)合而得名。piRNA是單鏈非編碼小RNA,其長度一般為2433nt，通過特異性地與Piwi蛋白結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。目前的研究表明, piRNA主要存在于哺乳動物的生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中 通過與Piwi亞 蛋白結(jié)合形成piRNA復(fù)合物(piRC)來調(diào)控沉默途徑。這些研究結(jié)果表明小 RNA在物DNA雙鏈斷裂修復(fù)過程中具有保守的重要功能，并為人們對DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)理的認(rèn)識提供了 性的新概念。59diRNA的產(chǎn)生依賴于PI3激酶ATR，RNA聚合酶IV和DCL（Dicer-like），其產(chǎn)生后被AGO2蛋白招募而起作用581. diRNA (DSB-induced small RNA)diRNAs大小