染色的基本原理

1、染色的基本原理是利用染料在組織切片上給與顏色，使其與組織或細(xì)胞內(nèi)的某種成分發(fā)生作用，經(jīng)過透明后通過光譜吸收和折射，使其各種微細(xì)結(jié)構(gòu)能顯現(xiàn)不同顏色，這樣在顯微鏡下就可顯示出組織細(xì)胞的各種成分。染色劑與組織細(xì)胞相結(jié)合而使組織細(xì)胞著色的過程與物理和化學(xué)作用兩者都有關(guān)系。一、染色的物理現(xiàn)象1. 溶解性：這種染色最典型的例子就是脂肪染色，蘇丹類染色劑為脂溶性染料，它可以被脂質(zhì)溶解，使脂質(zhì)著色，就是利用染色劑在脂質(zhì)中的溶解度大于在酒精等溶劑中的溶解度這一特性。因此，當(dāng)蘇丹類的酒精溶液與組織細(xì)胞中的脂質(zhì)接觸時，染色劑就從溶液中“轉(zhuǎn)移”到脂質(zhì)中去，而使脂質(zhì)著色。2. 吸附作用：較大物體有從周圍介質(zhì)吸附小顆粒到

2、自身的特性。有些染色則是染色劑分子通過滲透和毛細(xì)管作用而被吸收或沉淀到組織，細(xì)胞的小孔中去而著色的。例如活性炭吸附各種分子，甚至膠質(zhì)和微生物等較大的顆粒一樣。二、染色的化學(xué)反應(yīng)酸性染料和堿性染料的染色作用常是對立的，而不是一致的。任何染料均可電離，離解出陽離子或陰離子。酸性染料中的酸性部分有染色作用的是陰離子；堿性染料中的堿性部分有染色作用的是陽離子，細(xì)胞內(nèi)同時含有酸性和堿性物質(zhì)，酸性物質(zhì)與堿性染料中的陽離子相結(jié)合，如細(xì)胞核（含有核酸）黏液和軟骨基質(zhì)呈酸性部分被鹽基性染料蘇木素所染、反之堿性物質(zhì)與酸性染料的陰離子相結(jié)合，如細(xì)胞漿及其內(nèi)部的某些顆粒物質(zhì)被酸性染料伊紅所染。染料的顏色基不是在陽離子

3、，就是在陰離子上，這些離子將因組織反應(yīng)不同而發(fā)生化學(xué)結(jié)合，如顯示含鐵血黃素的普魯士蘭反應(yīng)是最典型的例子。但是，大量染色的化學(xué)反應(yīng)并不像鐵反應(yīng)那樣明確，實際情況遠(yuǎn)為復(fù)雜。這是因為蛋白質(zhì)分子是個分子量自幾萬至幾百萬的大分子，每個分子中含有很多陽離子和陰離子基因，在等電點時能形成游離的兩性離子，如：P為蛋白質(zhì)，是具有兩性的膠體物質(zhì)。它呈酸性或堿性與環(huán)境的PH值有關(guān)，如溶液的PH值小于該蛋白質(zhì)的等電點則此溶液對該種蛋白質(zhì)即為酸性，蛋白質(zhì)就帶正電，將被酸性染色劑所著色。反之，溶液的PH值大于蛋白質(zhì)的等電點，則此溶液對該蛋白質(zhì)來說即為堿性,蛋白質(zhì)帶負(fù)電，將被帶有陽離子的染色劑所浸染?。在日常工作中，長久固

4、定于甲醛的組織切片，往往染色不良，尤其是核的著色欠佳。這是因為固定液甲醛氧化生成甲酸，組織亦隨之變?yōu)樗嵝裕圆灰妆惶K木素所著色，補救的辦法是，先用流水沖洗組織塊，然后用堿性溶液如稀氨酒精等處理使之中和，恢復(fù)正常PH值后再進(jìn)行染色。大多數(shù)染色的原理至今仍未搞清楚。有些可能是物理的，有些可能是化學(xué)的，有些則可能兩種機制都起作用，正因為人們對染色的原理還沒有完全掌握，所以目前還不能很好地運用原理來控制它。在相當(dāng)程度上要憑借工作經(jīng)驗。因此“染色”成為技術(shù)性很強的一項工作。在進(jìn)行每一種染色方法時，必須注意不斷地有意識地去積累經(jīng)驗，從成功與失敗中去真正掌握該染色技術(shù)。三、進(jìn)行性染色和退行性染色組織成分著

5、色由淺至深，當(dāng)達(dá)到所需要的強度時，終止染色。這種方法稱為進(jìn)行性染色。一般所采用的染液濃度較低，染色過程中應(yīng)該不時在鏡下觀察以進(jìn)行控制，這樣才能得到染色強度適中的效果。此種方法無需“分化”，例如，卡紅染色。退行性染色，則是先把組織濃度過度，超過所需的程度，然后再用某些溶液脫去多余的染色劑，以達(dá)到適當(dāng)?shù)纳疃?，并使不?yīng)著色的組織細(xì)胞脫色，這個步驟稱為“分化”。在分化中進(jìn)行鏡下觀察，當(dāng)然也是必不可少的。H.E染色中用蘇木素染核就是退行性染色。四、直接染色，間接染色和媒染劑有些染色無需第三種物質(zhì)參加，染色劑和組織即可直接結(jié)合著色，是為直接染色。直接染色最后達(dá)到的深度與染液的濃度和組織細(xì)胞對染色劑的親和力

6、相關(guān)。還有一些染色，單獨燃料本身的水溶液或酒精溶液，幾乎不能與組織細(xì)胞結(jié)合或結(jié)合的能力很弱，必須有第三種成分媒染劑參與，才能使染色劑與組織細(xì)胞有效地結(jié)合起來，這種染色方法稱為間接染色。媒染劑通常是雙價或三價金屬如鋁，鐵的硫酸鹽或氧化物。媒染劑有的加在染液中，媒染作用在染色的同時進(jìn)行（如Ehrlich氏蘇木素染色）；有的則用于染色前，媒染劑單獨配成溶液，固定液本身就起著媒染的作用（如Wallory氏磷鎢酸蘇木素染色用Zenker或Helly氏固定）；有時則用于染色后。媒染劑在染色中起著架橋作用，既能與染料結(jié)合又能與組織相結(jié)合，達(dá)到了促進(jìn)染色的效果。例如蘇木素就需要明礬作媒染劑，才能使組織著色。媒

7、染劑往往在一些間接染色反應(yīng)中幾乎是必不可少的。五、促染劑用以加強染料和組織細(xì)胞結(jié)合能力的物質(zhì)稱為促染劑。如染胞漿時伊紅液中滴加的冰醋酸，有加強其染色作用，增加了有色酸對蛋白質(zhì)堿基的結(jié)合力。促染劑與媒染劑不同，有時為了加快染色過程，可在染液中加入接觸劑促進(jìn)染料與組織細(xì)胞著色，但其本身并不參與染色反應(yīng)。促染劑有如化學(xué)反應(yīng)中的催化劑，少量存在就有明顯的促染作用。它們的作用機制也許是降低表面張力或是改變了染液的PH值.六、分化劑在退行性染色中，附在組織細(xì)胞上多余的染色劑需用某些特定的溶液把目的物以外的部分脫去，從而使目的物與周圍組織形成鮮明的對比，同時使目的物本身的色澤也深淺適當(dāng)。這種選擇性地除去多余

8、染色劑的過程稱為“分化”，所使用的溶液即是“分化劑”。分化劑大致可歸納為三大類：（一）酸性分化劑：如冰醋酸和鹽酸。它們能與媒染劑（金屬）相結(jié)合形成可溶性鹽類，從而打開了媒染劑和組織細(xì)胞的結(jié)合，使組織細(xì)胞脫色，另外，它能分解和防止形成染料的沉淀色素。如Ehrlich氏蘇木素液當(dāng)酸性時，溶液為褐紅色，正是由于色素根來與鋁化合成蘭色的“沉淀色素”，之故，一旦將切片投入堿性溶液，則組織立刻呈現(xiàn)藍(lán)色，說明沉淀色素已經(jīng)形成，但若以1%鹽酸酒精分化，則又恢復(fù)了紅色，此即表示沉淀色素又被溶解。（二）氧化分化劑：其作用實際上是種簡單的漂白，如苦味酸，銘酸，重銘酸鉀，高鐵氟化鉀和過鈕酸鉀等，這些都是一些氧化劑，可

9、將組織上所有的染色劑無選擇地氧化而呈無色，猶如漂白作用。但由于這種氧化作用的速度較慢，首先脫去的必是染色較淺的，染色較深的組織細(xì)胞還可保留部分染色劑，這樣就達(dá)到了分化的效果。（三）媒染分化劑：媒染劑能促使組織細(xì)胞和染色劑相結(jié)合。如果將已染色的切片再放到媒染劑的溶液中，則可使已經(jīng)和組織相結(jié)合的染色劑脫去，這是媒染劑的另一種功能。從這個角度看，又可稱之為“媒染分化劑”。它對組織既能使染料附著，又能脫去染料，二者初看似乎矛盾，其實不然，這是因為染色劑和媒染劑的比例關(guān)系不同，當(dāng)溶液中媒染劑的量超過了染色劑的量時，占有壓倒優(yōu)勢的媒染劑就把已經(jīng)和組織細(xì)胞相結(jié)合的染色劑奪取過來，使組織細(xì)胞脫色，即為分化現(xiàn)象。當(dāng)然，含染料較少的組織必然先被脫色，而著色較濃的組織隨著分化時間的控制，即可保留必要的顏色，從而達(dá)到分化的目的。既然分化劑有脫色的作用，因此分化劑本身也是脫色劑。一張褪色的切片，需要再染時，第一步就是用脫色劑加以處理。在常規(guī)染色中，分化劑必須嚴(yán)格掌握，再根據(jù)經(jīng)驗進(jìn)行鏡下觀察，控制染色效果。七、變色反應(yīng)和正色反應(yīng)大多數(shù)染料可將組織染成同一顏色的不同深度；例如：酸性品紅總是將組織染成不同色調(diào)的紅色。淡綠染成不同色調(diào)的綠色。這些染色反應(yīng)最后目的所呈現(xiàn)的顏色和染色劑的顏色相同，稱為正色反應(yīng)。然而有