變性高效液相色譜技術(shù)及其在植物檢疫工作中的應(yīng)用前景

1、變性高效液相色譜技術(shù)及其在植物檢疫工作中的應(yīng)用前景2011-2012學(xué)年第一學(xué)期課程名稱：儀器分析變性高效液相色譜技術(shù)及其在植物檢疫工作中的應(yīng)用前景摘要：本文介紹了變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)的基本原理及影響因素，并結(jié)合植物病原鑒定技術(shù)的特點(diǎn)，分析了DHPLC技術(shù)在植物檢疫工作中的應(yīng)用前景，證明了DHPLC技術(shù)將成為一種快速、準(zhǔn)確、高效的新型植物病原檢測技術(shù)。關(guān)鍵詞： DHPLC 植物檢疫 核酸分析技術(shù)DHPLC是變性高效液相色譜(denaturing higperformance liquid chromatography)的英文縮寫，是近幾年才逐漸發(fā)展成熟的核酸分析技術(shù)，目前在生命科

2、學(xué)領(lǐng)域中已得到廣泛的應(yīng)用。是一種基于異源雙鏈分析(heteroduplex analysis)的基因突變、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、DNA片段長度多態(tài)性的高精度、高通量的新型檢測技術(shù)。植物檢疫工作中，由于植物病原特殊的生物學(xué)特點(diǎn)，而具有原理、步驟程序各不相同、種類繁多的鑒定技術(shù)。大多數(shù)病原如病原細(xì)菌、病毒、類病毒在傳統(tǒng)的目測法、培養(yǎng)基篩選、免疫電鏡、血清學(xué)鑒定等步驟后，還需進(jìn)行指示植物鑒別及致病力檢測。其步驟繁雜，時間冗長甚至超出苗木存活容許的時間范疇等缺陷給檢驗(yàn)檢疫工作的順利實(shí)施造成了一定的困難。變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)的出現(xiàn)為解決以上問題提供了極大的可能，這種技術(shù)利用基因的物理化

3、學(xué)性質(zhì)，將先進(jìn)的高精度大型儀器分析技術(shù)與核酸提取、體外擴(kuò)增等經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了生物學(xué)、物理學(xué)、分析化學(xué)等多學(xué)科交匯互融，既發(fā)揮了化學(xué)儀器的高精密度的優(yōu)勢，又體現(xiàn)了物理學(xué)和生物技術(shù)的成果，是當(dāng)今學(xué)科交叉領(lǐng)域又一杰出科研碩果，可為未來植物檢疫技術(shù)發(fā)展提供了新的前進(jìn)方向。一、 DHPLC的基本原理及影響因素1 長度多態(tài)性分析原理DNA分子帶負(fù)電荷，通過一種充當(dāng)橋梁作用的分子一使TEAA(三乙錢醋酸鹽)的陽性按離子與DNA相互作用，與柱子固相填料表面分子結(jié)合，DNA分子本身得以吸附到柱子上。這樣DNA分子結(jié)合的TEAA越多，與固相結(jié)合得越牢固。經(jīng)基鏈與固相結(jié)合的強(qiáng)度會隨著流動相中乙睛濃度

4、的增加而減，DNA片段越長，結(jié)合的TEAA越多，越不易被洗脫。因此DNA片段大小分析是長度依賴性分離，而非序列依賴性分離。變性溫度是影響DNA片段分析的一個重要因素。而在不變性溫度條件下，可分離長度不同的雙鏈DNA分子。2 基因型多態(tài)性分析原理DHPLC的基本原理是異源雙鏈分析(heteroduplex analysis)。異源雙鏈(heteroduplex)指由不完全互補(bǔ)的兩條DNA單鏈形成的雙鏈DNA，同源雙鏈(homoduplex)指由完全互補(bǔ)的兩條DNA單鏈形成的雙鏈DNA簡略來說，異源雙鏈和同源雙鏈對介質(zhì)有不同的親和力，因此，它們從介質(zhì)中被洗脫下來的條件有差別。如果PCR產(chǎn)物源自純合

5、子或者發(fā)生了純合突變的個體，那么只有在與另外一種純合野生型序列的PCR產(chǎn)物混合，再變性復(fù)性，才能夠形成上述雜合和純合雙鏈。雜合雙鏈存在錯配堿基，其變性溫度低于純合雙鏈，當(dāng)溫度升高到一定程度，先于純合雙鏈在錯配堿基周圍解鏈變性，導(dǎo)致雙鏈減少和單鏈增多。由于單鏈比雙鏈所帶的負(fù)電荷少，雜合雙鏈比純合雙鏈更容易形成單鏈，其保留時間短于純合雙鏈，在圖譜上先于未解鏈的純合雙鏈出現(xiàn)。隨著變性溫度升高，純合雙鏈也會部分變性，A=T含有2個氫鍵，C=G含有3個氫鍵，前者變性程度比后者低，因此先出現(xiàn)的峰為含有AT的雙鏈，后出現(xiàn)的為含CG的雙鏈。利用這種雜合和純合雙鏈在保留時間上的差異，可以快速分析單個核苷酸的突變

6、，從而進(jìn)行基因型的判定。3 DHPLC的影響因素 （1）PCR產(chǎn)物的影響 PCR擴(kuò)增為高通量基因型檢測提供了標(biāo)本源。DHPLC對PCR中的引物、試劑雖無特殊要求，而且也不必對PCR產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)處理，但是要盡量保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的忠實(shí)性，避免人為引入錯配堿基。 （2） 洗脫溫度 溫度是影響DHPLC檢測基因型成功與否的至關(guān)重要因素。如將檢測溫度提高2后，就可在RET基因中發(fā)現(xiàn)兩個漏檢的突變基因型。有些基因突變對溫度不敏感，在較寬的溫度范圍內(nèi)(懸殊8左右)都可對其進(jìn)行有效篩檢；但有的突變對溫度要求嚴(yán)格一些，如BRCA1基因的56134C/T與 2640C/T，只有分別在59與57下，才能被檢測到。

7、（3）固定相 目前，有幾種不同的分離介質(zhì)被用于突變分析中。如美國Transgenomic公司應(yīng)用大小為2 m的無孔聚苯乙烯顆粒作為分離柱的材料，惠普公司則使用孔徑為3.5 m的硅膠作為分離柱介質(zhì)。這兩種柱的分辨率似乎相似，但壽命卻大不相同，前者通常可分析6000個左右的樣品，而后者僅可分析10002000個樣品。最近，瓦里安公司(WalnutCreek,CA)開發(fā)出多聚物包被的堿性化硅膠柱。也有嘗試將無孔聚苯乙烯與有孔硅膠結(jié)合，制成單片集成毛細(xì)管柱，可使柱效提高40%。 （4） 流動相流動相中離子配對劑的TEAA濃度對DHPLC分析的溫度有顯著影響。如果TEAA的濃度從lommol/L升高至2

8、00mmol/L，那么對應(yīng)的最佳檢測溫度就要提高4-4.5。流動相的pH值(6-9)對檢測效果幾乎沒有任何影響，但pH值太高，將會使雙鏈DNA完全變性，達(dá)不到檢測目的；pH值太低，又會干擾DNA與TEAA的相互作用，影響檢測 效果。 二、DHPLC在植物檢疫工作中的應(yīng)用前景 1 DHPLC在有害生物鑒定中的應(yīng)用 （1） DHPLC在原核有害生物鑒定中的應(yīng)用 植物檢疫工作中，檢疫性原核有害生物主要包括細(xì)菌、植原體、病毒、類病毒等。關(guān)于原核有害生物相關(guān)的DHPLC檢測技術(shù)報(bào)道主要集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。2004年Bode E等以保守基因ITS(16S23Sintergenic spacer region)

9、和功能基因gyrA為鑒定依據(jù)，在42種待測細(xì)菌中準(zhǔn)確地檢測出Bacillus cereus菌和Bacillus thuringiensis菌。Hurtle W等利用DHPLC對較廣范圍的細(xì)菌種類進(jìn)行基因鑒定，幾個屬的39種細(xì)菌用來檢驗(yàn)DHPLC的準(zhǔn)確性和可靠性。大多數(shù)(36/39)種的細(xì)菌擁有可作為分子指紋圖譜的特異表達(dá)曲線圖，而且在70余種細(xì)菌樣品中，Yersinia pestis(10/70)和Bacillus anthracis(12/74)樣品都被準(zhǔn)確地鑒定出來。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DHPLC的檢測特異性為100 ，敏感度為97.7 ，predictive值為96.9，這些數(shù)據(jù)證明DHPLC

10、可以用于細(xì)菌鑒定。Domann E等進(jìn)行了以16S rRNA基因的V6至V8區(qū)序列為靶序列，通過DHPLC區(qū)分致病菌多樣性的研究。羅陽等對用變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)篩查了SARS冠狀病毒(SARS.CoV)S蛋白的受體的正常無關(guān)個體中氨基肽酶N編碼基因ANPEP的全部外顯子及其兩側(cè)部分內(nèi)含子序列，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV感染和SARS發(fā)病的易感基因或抗病基因 。 (2) DHPLC在真核有害生物鑒定中的應(yīng)用 真核有害生物結(jié)構(gòu)較原核生物更為復(fù)雜，基因組構(gòu)成和基因功能分化更為精細(xì)，更多的致病基因和保守基因可作為生物基因型鑒定的依據(jù)，這些特點(diǎn)促成了DHPLC在真核生物的研究領(lǐng)域擁有更加寬廣的用

11、武之地，并發(fā)揮了更為強(qiáng)大的功能。Kota等通過DHPLC進(jìn)行了大麥(Hordeum vulgare L.)的基因結(jié)構(gòu)及基因分型的研究工作。陳瑤生等用DHPLC對豬肌肉組織差異表達(dá)EST的進(jìn)行鑒定。Wulfert M、蔣瓊橙等認(rèn)為人類線粒體DNA(mtDNA)的1602416365nt，73-340nt及438574nt 3個區(qū)域?yàn)槎鄳B(tài)性高發(fā)區(qū)，這3個區(qū)域的高度多態(tài)性使得個體間具有高度的差異性，因而可以用來作個人識別。他們通過DHPLC和PCR對人類線粒體的異質(zhì)性進(jìn)行技術(shù)檢測。沈靖等采用DHPLC直接測序和PCRRFLP方法發(fā)現(xiàn)與初步證實(shí)了中國人的iNOs基因TsP多態(tài)性。以上例子有力地證明了D

12、HPLC在真核生物生命科學(xué)領(lǐng)域的實(shí)用性和通用性，昭示了這種檢測技術(shù)在真核有害生物鑒定工作中的廣泛應(yīng)用前景。 檢疫性植物病原以其危害性大、破壞力強(qiáng)、癥狀復(fù)雜多變而成為一類重要的檢疫對象。植物病原生物在分類學(xué)中跨度很大，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)有真菌、細(xì)菌、植原體、病毒、類病毒和線蟲等。這些病原生物從致病性這一點(diǎn)講是相同的，但致病機(jī)理及基因結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)、控制等特點(diǎn)卻大相徑庭。總體來說，植物病原不僅種類多，而且近似種多，表現(xiàn)為檢疫性病原之間易混淆、檢疫性與非檢疫性病原之間難區(qū)分、同種病原在不同寄主上表現(xiàn)的癥狀不同、不同種病原在相同寄主上卻可能表現(xiàn)相似的癥狀等具體形式。目前，DHPLC技術(shù)在醫(yī)學(xué)、保健學(xué)、環(huán)保、生態(tài)學(xué)領(lǐng)域

13、已得到廣泛的應(yīng)用，檢測范圍幾乎涵蓋從原核生物到真核生物、從微生物到植物、動物、從低等生物到高等生物的各種生命形式。DHPLC是一套經(jīng)過反復(fù)摸索、改進(jìn)、總結(jié)所得到的較為成熟穩(wěn)定、準(zhǔn)確快速的基因型檢測分類鑒定技術(shù)，是一種能夠滿足植物檢疫-工作需要、解決上述難題的行之有效的新型檢測方法。 2 DHPLC在雜交作物品系鑒定方面的應(yīng)用 從標(biāo)準(zhǔn)的角度而言，我國現(xiàn)行的GB/T3543.3-1995農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度鑒定及其實(shí)施指南中列入的對雜交水稻品種的鑒定方法，應(yīng)是當(dāng)前世界上較全面的方法，而且也完全與國際接軌。同時，世界上近20多年來，對雜交水稻品種鑒定技術(shù)的研究，在理論方面、技術(shù)方面都取

14、得了很大的成就，特別是近年將DNA分子檢測技術(shù)用于品種鑒定的研究取得了可喜的進(jìn)展。DNA指紋圖譜技術(shù)主要包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)、擴(kuò)增酶切片段長度多態(tài)性(AFLP)、簡單重復(fù)序列或微衛(wèi)星重復(fù)序列(SSR)DNA指紋技術(shù)具有多態(tài)性豐富、靈敏度高、區(qū)分鑒別效果好等優(yōu)點(diǎn)，但是，主要存在重演性差、技術(shù)難度大、成本高、費(fèi)時等缺陷，目前用于品種真實(shí)性和純度鑒定的方法還很不成熟。DHPLC的基本原理是異源雙鏈分析，其技術(shù)特點(diǎn)正適用于雜交水稻的鑒定，純和體基因組可作為(野生型)同源雙鏈模板，而雜交體則視為突變型(異源雙鏈)。利用異源雙鏈和同源雙鏈洗脫順序、時間上的差異，

15、可準(zhǔn)確地進(jìn)行雜交水稻的鑒定。Kota等通過DHPLC成功地繪制了大麥(Hordettm vulgare L.)的SNP圖譜，Rupe MA等利用nrp基因通過DHPLC對雜交玉米品系及基因表達(dá)等進(jìn)行了研究。 3 DHPLC在轉(zhuǎn)基因植物鑒定方面的應(yīng)用 轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源基因轉(zhuǎn)入生物體或細(xì)胞內(nèi)使之表達(dá)的技術(shù)。在人們構(gòu)建的外源轉(zhuǎn)基因載體中，人們設(shè)計(jì)裟入了基因表達(dá)所需的啟動子、終止子序列。為了方便轉(zhuǎn)基因植物的篩選，人們還整合了報(bào)告基因和抗性基因。因此針對這個特點(diǎn)，當(dāng)我們對轉(zhuǎn)入的目的基因并不了解的情況下，通過檢測這些基因序列就可對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行鑒定。轉(zhuǎn)基因作物DHPLC檢測方法可以以目前通用的報(bào)告基因(

16、Gus和Gfp基因)、抗性基因(Kan和Lif抗性基因)、啟動子(CaMV35S)和終止子(CaMV35S和Nos等)等具有代表性的特異片段為擴(kuò)增靶序列(或雜交探針)，將從待檢樣品中提取的DNA，利用特異性引物擴(kuò)增，與以上基因的標(biāo)準(zhǔn)品混合，利用變性高效液相色譜儀進(jìn)行溫度變性，復(fù)性形成異源雙鏈或同源雙鏈，并先后從色譜柱洗脫，收集信號形成不同吸收峰后再經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析判斷。目前利用常規(guī)PCR、核酸雜交、熒光PCR、基因芯片檢測轉(zhuǎn)基因生物的技術(shù)日臻成熟，但關(guān)于DHPLC檢測轉(zhuǎn)基兇成分國內(nèi)外都尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，可作為一個全新的研究方向去探索。 4 DHPLC與傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法 經(jīng)典分子生物學(xué)方法

17、的引人，在縮短植物檢疫鑒定工作的檢測周期、提高檢測靈敏度、提升檢測效率的同時，極大地豐富了植物病原檢測鑒定的技術(shù)手段，為實(shí)驗(yàn)室具體的檢測T作提供了更為廣闊的選擇。但其自身的缺陷也逐漸暴露出來，常規(guī)PCR檢測步驟簡單，操作方便，假陽性結(jié)果m現(xiàn)頻率過高的問題卻無法避免。熒光PCR及基因芯片技術(shù)靈敏度高、結(jié)果可靠，但熒光定量PCR儀及基因芯片裝置價值昂貴，大多數(shù)部門無力購置。Southern、Northern等由于雜交技術(shù)耗時長、步驟多，對于檢測人員技術(shù)能力要求較高等缺點(diǎn)不適合在檢驗(yàn)檢疫部門推廣應(yīng)用。許多研究表明與傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法相比，DHPLC作為植物病原的新型檢測鑒定技術(shù)在準(zhǔn)確度和節(jié)約成本、高

18、通量、簡捷快速等各個方面都具有天然的優(yōu)勢。施錦繡等比較DHPLC與直接測序法在單核苷酸多態(tài)性檢測中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)在41個樣本的SERT-E9A/G基因檢測中，DHPLC的檢出率達(dá)到了100。在大規(guī)模樣本的雜合子篩檢中，檢測的錯誤率幾乎為0。結(jié)論是DHPLC技術(shù)是一項(xiàng)可用于未知序列的檢測、尤其是在人群中大規(guī)模篩查已知序列的有效手段。Arnold等在BRCA1基因中，DHPLC檢出了所有直接測序找到的變異體，但DHPLC比直接測序的成本至少降低了10倍左右。與基于熒光PCR、DNA芯片的再測序相比，DHPLC不僅成本低，而且靈敏度與特異性也比較高。Kwok等認(rèn)為，對于頻率高于20 的變異，DHPLC

19、的檢出率為100 ，而直接測序的檢出率為80。Choy等通過比較構(gòu)象敏感凝膠電泳(PCRCSGE)、PCRSSCA和DHPLC檢測結(jié)節(jié)性硬化癥基因 C2突變的能力，發(fā)現(xiàn)對于TSC2單核苷酸變異的檢出率PCRCSGE和PCR-SSCA分別為69和54 ，而DHPLC為100，提示DHPLC優(yōu)于CSGE和SSCA，特別是在檢出單核苷酸變異方面。這些研究表明，DHPLC是檢測基因組DNA更為敏感而且準(zhǔn)確的手段。 DHPLC技術(shù)操作步驟簡單，具有自動化程度高、檢測快速、靈敏度高的特點(diǎn)，并可以對樣品進(jìn)行自動化回收。該技術(shù)允許在完全變性、部分變性或非變性條件下分析核苷酸片段，已被廣泛用于核酸片段分離、突變

20、檢測、基因型分析、PCR引物純度分析和純化、SNP分析等方法，單核苷酸突變檢測準(zhǔn)確率穩(wěn)定在96以上。在最佳條件下，該技術(shù)甚至可以對有些雜和體的兩個等位基因進(jìn)行分離。又由于整個過程無需對DNA產(chǎn)物進(jìn)行后期無害化處理，可以有效地解決溴化乙錠的環(huán)境污染問題。 由于工作和職責(zé)的特殊性質(zhì)，檢驗(yàn)檢疫的工作對象包含了各類產(chǎn)品，涉及到農(nóng)業(yè)工業(yè)等方方面面，實(shí)驗(yàn)儀器的配置、資料種類有較高較寬的要求。高效液相色譜儀作為分析化學(xué)常規(guī)儀器，被廣泛使用于各地方局的常規(guī)檢驗(yàn)工作中，具有良好的普及率。DHPLC利用交叉科學(xué)的優(yōu)勢，跨領(lǐng)域的發(fā)揮高精度化學(xué)分析儀器的潛能，挖掘高效液相色譜儀潛在價值，不儀節(jié)省了二次購買儀器的昂貴費(fèi)

21、用，也無形提高了其自身價值。同時，植物病原新型尖端高效液相色譜檢測技術(shù)(DHPLC)的研制與檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)一貫實(shí)施科技創(chuàng)新、保持與國際接軌戰(zhàn)略相符，將有助于加速植物病原檢疫技術(shù)的革新，確立我國在國際相關(guān)研究領(lǐng)域的領(lǐng)先和權(quán)威地位。 參考文獻(xiàn) ：1 白樺,鄧大君,潘凱楓.變性高效液相色譜在分子生物學(xué)中的應(yīng)用國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊2003，25(4)：303305 2 戈峰，現(xiàn)代生態(tài)學(xué).北京：科學(xué)出版社2005，2127 3 蘇智廣，張思仲.變性高效液相色譜技術(shù)在單核苷酸多態(tài)性研究中的應(yīng)用生命的化學(xué)2003，23(2)：155157 4 Hurtle W,Bode E.Kaplan R S.Use o

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