竹葉黃酮的分離提取

1、竹葉黃酮的分離提取、檢測與成分分析姓名：周胤瀟班級:微生物121學(xué)號：201201220414摘要：竹葉黃酮(Bamboo- leaf-flavonoid, BLF)是我們于上世紀(jì)90年代末創(chuàng)制的一種新型植物黃酮制劑,具有優(yōu)良的抗自由基、抗氧化、抗疲勞、耐缺氧、抗病毒、抗菌、抗炎、降脂、擴(kuò)冠和免疫增強(qiáng)活性等（1-2）。竹葉總黃酮以其巨大的資源優(yōu)勢和良好的藥理活性將成為一種非常有前途的天然藥物,具有廣闊的開發(fā)前景.本實驗主要對竹葉中黃酮類物質(zhì)的含量用紫外分光法進(jìn)行測定以及高效液相色譜法對竹葉提取物的成分分析。關(guān)鍵詞：竹葉 黃酮類物質(zhì) 紫外分光法 高效液相色譜法前言 竹子為禾本科Poaceae竹亞

2、科Bambusoideae多年生常綠植物，在我國分布很廣，資源十分豐富。竹子在建筑、水利、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，然而，竹子加工利用后，竹葉卻總是被棄置，造成了極大浪費。近年來的研究發(fā)現(xiàn)竹葉中含有多種活性物質(zhì)，其主要活性物質(zhì)是黃酮類物質(zhì),含量平均在2%,竹葉提取物中的有效成分主要是以葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷為代表的碳苷黃酮和以對香豆酸、綠原酸、咖啡酸和阿魏酸為代表的植物酚酸為主，竹葉黃酮中的功能因子主要是黃酮糖苷和香豆素內(nèi)酯,黃酮類物質(zhì)是一類天然植物成分，具有顯著的生理及藥理活性，黃酮類成分有明顯的抗?jié)儭⒔獐d、抗菌、抗炎、降血脂、鎮(zhèn)痛和雌性激素等生物活性和生理活性作用。實驗?zāi)康模?/p>

3、 （1）掌握樣品的前處理的方法 （2）掌握竹葉黃酮的提取、分離與純化 （3）用 硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定竹葉子中總黃酮 （4）采用超高效液相色譜（UPLC）定量分析竹葉中葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡 荊苷、對香豆酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸 8 個特征性成分的量。1 實驗材料和儀器1.1實驗材料： 竹葉（摘自浙江農(nóng)林大學(xué)校園內(nèi)）標(biāo)準(zhǔn)樣品：甲醇（分析純）、乙醇（分析純）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、石油醚（分析純）、氫氧化鈉、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（購自中國藥品生物制品檢定所，純度均大于98%）、去離子水。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取經(jīng)105干燥至恒重的蘆丁對照品5.600mg，加入甲醇溶液定容至50mL，配成112ug

4、/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。5%亞硝酸鈉溶液：稱取約5.263g亞硝酸鈉溶解在100mL去離子水，置于4冰箱中備用。10%硝酸鋁溶液：稱取約11.111g硝酸鋁溶于100mL去離子水中，置于4冰箱中備用1.0mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4.000g氫氧化鈉溶于100mL去離子水中，置于4冰箱備用。1.2實驗儀器：40目篩高速冷凍離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、紫外分光光度計、微波爐、粉碎機(jī)、回流裝置密封袋 ACQUITY Ultra Performance LC超高效液相色譜系統(tǒng)，包含二元溶劑管理器，樣品管理器，柱溫箱和二陣管陣列檢測器； Micromass Q-Tof micro TM 串聯(lián)質(zhì)譜（美國Wate

5、rs公司）2 實驗原理及方法2.1 實驗原理：浸提、洗脫原理：根據(jù)相似相溶原理，對所用溶劑按黃酮類化合物的極性來選擇，竹葉中所含的有效活性物質(zhì)主要為黃酮甙類，具有較大的極性和親水性，故可以選擇熱水、甲醇、乙醇、丙酮等溶劑進(jìn)行浸提。但由于水的極性過大，且易于將蛋白質(zhì)、糖類的易溶于水的成分浸提出來，且水提法提取物存放易發(fā)霉，從而影響黃酮類化合物的提取和分離。故本實驗選用甲醇水溶液作為浸提及洗脫溶劑。2.2工藝流程（5，6，7）新鮮竹葉洗凈烘干 破碎 過篩（40目） 回流浸提 抽濾懸蒸定容測定吸光度 分析計算2.3實驗步驟2.3.1 竹葉處理采集竹葉，立刻用微波爐進(jìn)行殺青干燥（微波爐，700W，間隙

6、加熱23次，每次60S），將烘干的竹樣用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，將濾過的竹樣粉末放入密封袋中密封，放置于-40冰箱中儲存?zhèn)溆谩?.3.2 竹葉黃酮的提取與純化2.3.2.1 竹葉黃酮的提取1.精確稱取竹樣粉末各200.00g。2.加入150mL60%乙醇-水溶液，浸泡30min。3.水浴鍋水溫75熱回流提取1h。4.冷卻至室溫，過濾，收集濾液。5.在濾渣中加入50mL60%乙醇進(jìn)行二次回流30min。6.冷卻至室溫收集濾液，棄濾渣，密封，標(biāo)號，置于4冰箱，備用。2.萃取、純化在竹樣粗提取液中加入100mL石油醚進(jìn)行萃取脫脂脫葉綠素，棄上清液取下沉液，再次加入100mL石油醚進(jìn)行萃取，重復(fù)2次，

7、將提取液密封保存至4冰箱備用。2.3 .2.3 濃縮干燥將萃取過的竹葉提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮干燥，將干燥后的殘渣（黃酮初提物）用60%甲醇定容至100mL容量瓶中，保存于4冰箱備用。2.42.3.4 離心將竹葉黃酮濃縮液用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速為4000rpm，溫度10條件下離心10min，取上清液，保存至4冰箱備用。2.3.3 黃酮總含量測定-硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精確稱取經(jīng)105干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.600mg，加入甲醇溶液并定容至50mL，配成112ug/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1、2、3、4mL移入10mL具塞試管中，用60%甲醇定容至5mL，各

8、加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，振搖后放置5min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL振搖后放置6min，再加1.0mol/L氫氧化鈉溶液2mL，用60%甲醇定容至10mL，靜置10min，以零管為空白，搖勻后在510nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁的微克數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以及求取線性回歸方程。樣品黃酮含量測定：1. 取竹樣黃酮提取液400uL，加入600uL去離子水稀釋10倍。2. 將稀釋的黃酮提取液用60%甲醇定容至5mL。3. 加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，振搖后放置5min。4. 再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL搖勻后放置6min。5. 加入1.0mol/L氫氧化鈉溶

9、液2mL，用60%甲醇定容至10mL，靜置10min。6. 以零管為空白，搖勻后在510nm波長處測定吸光度。7. 根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線按公式計算黃酮總含量。3實驗結(jié)果3.1紫外分光測定吸光度以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.蘆丁溶液質(zhì)量濃度X (ug/mL)與吸光度值A(chǔ)的關(guān)系曲線的回歸方程式: A0.0103 X + 0.0154。取2 mL提取液于25 mL比色管中,在510 nm處測定吸光度.參比為空白試劑,并代入回歸方程計算其質(zhì)量濃度.測得的A0.260，求得X23.7476 ugmL最終每克竹葉中黃酮含量：23.7476×10×（100÷0.4）÷200

10、0.2968 ug3.2 竹葉提取物的特征性成分分析高效液相色譜分析：3.2.1 色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.0 mm×100 mm, 1.7 m），流動相 A為0.5%的甲酸水溶液;流動相 B為色譜甲醇，流速為0.2 mL·min-1，分析時間：15 min，柱溫：30 ºC，進(jìn)樣體積: 2.0 L。3.2.2洗脫條件：015min由 5% B變?yōu)?00%B, 1015 min由100%B變?yōu)?%B。質(zhì)譜條件LC-MS 系統(tǒng)使用 ESI 離子源，在正離子模式與負(fù)離子模式下分別采集數(shù)據(jù)。 數(shù)據(jù)采集范圍 m/z1001 000。離子源參

11、數(shù) ESI：毛細(xì)管電壓：3000 V，樣品錐電壓 30 V，脫溶劑室溫度 250 ，離子源溫度 120 ，霧化氣(N2)體積流量 50 L·h1，脫溶劑氣(N2)體積流量 400 L·h1。 Lock Mass參照溶液為： 亮氨酸腦啡呔， M+H+ ：556.277 1，MH ：554.261 5。3.2.3樣品測定 : 各待測液經(jīng)微孔濾膜（0.45 m）濾過后，進(jìn)樣測定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各成分的量。結(jié)果如圖3-1,3-2負(fù)離子模式下發(fā)現(xiàn)，樣品S2中可能含有對香豆酸（分子量為164.2）圖3-1負(fù)離子模式下發(fā)現(xiàn)，樣品S2中可能含有葒草苷，異葒草苷（分子量均為448.4）圖3-

12、24 竹葉黃酮的其他提取方法4.1 水溶劑提取法水提法此法適用于黃酮苷類物質(zhì)提取。具有成本低,對環(huán)境及人類無毒害,設(shè)備簡單,適合工業(yè)化大生產(chǎn),但提取率低,提取中雜質(zhì)較多(如無機(jī)鹽,蛋白質(zhì),糖類等),后續(xù)分離麻煩,現(xiàn)在很少單一使用此法。4.2 微波提取法微波法原理是利用磁控管所產(chǎn)生的每秒億次超高頻率的快速震動,使材料內(nèi)分子互碰撞、擠壓,使得位于細(xì)胞內(nèi)的有效成分從細(xì)胞壁周圍自由流出,傳遞轉(zhuǎn)移至萃取介質(zhì)周圍,在較低的溫度下背萃取介質(zhì)獲取并溶解其中。此法具有提取率高,準(zhǔn)確,快速,操作成本低,減少原料預(yù)處理費并于環(huán)境無害的優(yōu)點。微波射線穿透性好,在接近環(huán)境溫度下抽提竹葉中所需有效成分,對于熱敏性成分的萃

13、取非常有效。然而,微波萃取在理論和實踐中還存在一些問題,如有機(jī)溶劑的殘留以及微波穿透物質(zhì)內(nèi)部時的衰減問題等,而且目前這種提取方法仍沿襲高溫煎煮法,長時間高溫煎煮會影響許多有效成分,降低藥效。4.3 破碎提取法（10,11）通過選用各種性質(zhì)的藥材,與幾種傳統(tǒng)提取方法所得提取物產(chǎn)率和薄層層析對比試驗,結(jié)果表明,破碎提取法提取快速、完全,且不需要加熱,從而避免了對竹葉中有效成分結(jié)構(gòu)的破壞,有效成分的損失小,提取周期短,可以節(jié)省大量時間、溶劑和能源,但是提取物的收率并不是最高,且也局限于實驗研究,要應(yīng)用于大生產(chǎn),還需進(jìn)一步研究。4.4 超臨界流體萃取法超臨界流體萃取技術(shù)是利用臨界或超臨界狀態(tài)的流體及被

14、萃取的物質(zhì)在不同的蒸汽壓力下所具有的不同化學(xué)親和力和溶解能力進(jìn)行分離純化的操作。被用作超臨界流體的溶劑有CO2、H2O、C2H4、C3H8、CH3OH、NO2等,其中CO2以臨界條件易達(dá)到(Tc=31. 06e, Pc=7. 39MPa)且無毒、無味、不燃、價廉、易精制等特性應(yīng)用最為普遍。超臨界提取類黃酮和傳統(tǒng)的溶劑提取相比具有一系列優(yōu)點:操作周期短、提取效率高、無溶劑殘留以及有效成分和熱不穩(wěn)定的成分不易被分解,從提取到分離可一步完成,可選擇性提取和分離純化,溶劑溶質(zhì)分離方便。但是該法生產(chǎn)成本高,提取物中烷基酚含量較高,超臨界CO2是非極性溶劑,對非極性和分子量很低的極性物質(zhì)表現(xiàn)出很好的溶解性

15、,但對極性較強(qiáng)的物質(zhì)溶解能力不足。在竹葉黃酮的提取應(yīng)用上效果不顯著。5 參考文獻(xiàn)張英.竹葉黃酮的生理與藥理活性 J.世界竹藤通訊,2004, 2 (2): 1-11陸柏益,張英,吳曉琴.竹葉黃酮的抗氧化及其心腦血管藥理活性研究進(jìn)展 J.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2005, 23 (3):120-124國家醫(yī)藥管理局中草藥中心情報站.藥物有效成份手冊M,北京:人民衛(wèi)生出版社,1986.楊洋 陳朝勇 韋小英 李秋庭. 竹葉黃酮的提取和純化工藝研究，（廣西大學(xué)生物技術(shù)與糖業(yè)工程學(xué)院，南寧. 食品科技王振宇;楊春瑜;金鐘躍超聲波提取蘆薈凝膠定工藝東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，第30卷，（4）;19-21劉振南。用正交法探討山楂葉中黃酮類化合物的乙醇提取工藝，廣西民族學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版）,1999，第5卷（3）;27-28李秀信,劉青利,張院民等.香椿葉總黃酮提取方法研究.西北林學(xué)院院報.2002第!0卷（1）;68-69劉羽中,楊洋.生物類黃酮提取研究進(jìn)展J.中外食品,2004, 10: 48-49曾里,劉世貴.微波技術(shù)應(yīng)用于銀杏黃酮浸提的研究四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2