生物工藝學(xué)重點內(nèi)容201302

1、生物工藝學(xué)（生物技術(shù)）的概念與特點是應(yīng)用自然科學(xué)及工程學(xué)原理依靠生物催化劑的作用將物料進(jìn)行加工以提供產(chǎn)品或社會服務(wù)的技術(shù)。（現(xiàn)代）發(fā)酵工程的概念與基本步驟主要指利用微生物、包括利用DNA重組技術(shù)改造的微生物在全自動發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中生產(chǎn)某種商品的技術(shù)。包括以下基本步驟：（1）菌種選育；（通過細(xì)胞誘變或基因工程技術(shù)改造等）（2）細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)即發(fā)酵過程；（3）生產(chǎn)活性的誘導(dǎo)；（在發(fā)酵特定階段，用化學(xué)或物理法）（4）菌體及產(chǎn)物的收獲（利用濃縮、吸附、過濾、離心、萃取、干燥、重結(jié)晶等手段）發(fā)酵工程概念、內(nèi)容和過程要求n 概 念：指采用現(xiàn)代工程技術(shù)手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產(chǎn)有用的產(chǎn)品

2、，或直接把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程的一種新技術(shù)。n 內(nèi) 容：菌種的選育、培養(yǎng)基的配制、滅菌、擴(kuò)大培養(yǎng)和接種、發(fā)酵過程和產(chǎn)品的分離提純等。 n 要求：a.要隨時取樣檢測培養(yǎng)液中的細(xì)菌數(shù)目、產(chǎn)物濃度等，以了解發(fā)酵進(jìn)程；b.及時添加必需的培養(yǎng)基組分，以滿足菌種的營養(yǎng)需要；c.要嚴(yán)格控制溫度、pH、溶氧、通氣量與轉(zhuǎn)速等發(fā)酵條件。微生物發(fā)酵工業(yè)特征n 反應(yīng)條件溫和 通常由于微生物的生理特性，要求溫度為30-40 pH值中性偏酸性酵母、霉菌、放線菌等 pH值中性偏堿性細(xì)菌的發(fā)酵n 無菌發(fā)酵 整個反應(yīng)過程要求無菌：培養(yǎng)基無菌、空氣無菌、 補料和取樣要求無菌操作、某些工程菌，其尾氣也要求進(jìn)行無菌處理。n 非連

3、續(xù)性生產(chǎn) 微生物的生理特性決定了發(fā)酵過程的非連續(xù)性 大部分的工業(yè)發(fā)酵是以間歇操作為基礎(chǔ)進(jìn)行的，目前可以實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)的是：啤酒的連續(xù)化生產(chǎn)獲得發(fā)酵產(chǎn)品的條件n 適宜的微生物n 保證或控制微生物進(jìn)行代謝的各種條件n 進(jìn)行微生物發(fā)酵的設(shè)備n 精制成產(chǎn)品的方法和設(shè)備發(fā)酵工程的發(fā)展歷史；青霉素發(fā)酵的主要的技術(shù)進(jìn)展與意義n 發(fā)展歷史發(fā)酵-古老的藝術(shù)初期-微生物發(fā)現(xiàn)近代-深層發(fā)酵技術(shù)現(xiàn)代-DNA重組及細(xì)胞融合技術(shù)n 技術(shù)進(jìn)展通氣攪拌解決了液體深層培養(yǎng)時的供氧問題。 抗雜菌污染的純種培養(yǎng)技術(shù)：無菌空氣、培養(yǎng) 基滅菌、無污染接種、大型發(fā)酵罐的密封與抗污染設(shè)計制造。 n 意義：抗生素工業(yè)的發(fā)展 建立了一套完整的

4、好氧發(fā)酵技術(shù)，大型攪拌發(fā)酵罐培養(yǎng)方法 推動了整個發(fā)酵工業(yè)的深入發(fā)展 為現(xiàn)代發(fā)酵工程奠定了基礎(chǔ)代謝控制發(fā)酵理論的要點n 定義：用人工誘變的方法，有意識地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產(chǎn)物n 要點：大多數(shù)的工業(yè)產(chǎn)品并不是微生物代謝的末端產(chǎn)物，而是微生物代謝的中間性物質(zhì)，要合成、積累這些物質(zhì)，必須解除他們的代謝調(diào)控機(jī)制。通過遺傳學(xué)或其它生物化學(xué)的方法，人為地在脫氧核糖核酸（DNA）的分子水平上，(無定向誘變)改變和控制微生物的代謝，使有用的代謝產(chǎn)物大量生成、積累的發(fā)酵技術(shù)?；蚬こ叹l(fā)酵的技術(shù)特點和意義n 技術(shù)特點:可定向改造生物基因，按人們的意志生產(chǎn)產(chǎn)品。n 意義:將引起發(fā)酵工程的技術(shù)革命。

5、工業(yè)發(fā)酵的步驟(1) 用作培養(yǎng)菌種及擴(kuò)大生產(chǎn)的發(fā)酵罐的培養(yǎng)基的配制(2) 培養(yǎng)基、發(fā)酵罐以及輔助設(shè)備的消毒滅菌(3) 將已培養(yǎng)好的有活性的純菌株以一定量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中(4) 將接種到發(fā)酵罐中的菌株控制在最適條件下生長并形成代謝產(chǎn)物(5) 將產(chǎn)物抽提并進(jìn)行精制，以得到合格的產(chǎn)品(6) 回收或處理發(fā)酵過程中產(chǎn)生的廢物和廢水微生物發(fā)酵的本質(zhì)可以理解為物質(zhì)形式的轉(zhuǎn)化過程，就是利用微生物生長所需的營養(yǎng)物轉(zhuǎn)化成特定的產(chǎn)物培養(yǎng)基的配制原則（一）培養(yǎng)基組分應(yīng)適合微生物的營養(yǎng)特點（目的明確）（二）營養(yǎng)物的濃度與比例應(yīng)恰當(dāng)（營養(yǎng)協(xié)調(diào)）（三）物理化學(xué)條件適宜（條件適宜）（四）根據(jù)培養(yǎng)目的選擇原料及其來源（經(jīng)濟(jì)節(jié)約）

6、不同微生物對水分活度的要求細(xì)菌：一般0.900.98；嗜鹽菌0.75酵母菌：一般0.870.91；高滲酵母0.610.65；魯氏酵母0.60霉菌：一般0.800.87；耐旱菌0.650.75；雙孢旱霉0.60如何理解“根據(jù)培養(yǎng)基的應(yīng)用目的選擇原料及其來源”該培養(yǎng)基的應(yīng)用目的，即： 是培養(yǎng)菌體還是積累代謝產(chǎn)物？ 是實驗室種子培養(yǎng)還是大規(guī)模發(fā)酵？ 代謝產(chǎn)物是初級代謝產(chǎn)物還是次級代謝產(chǎn)物？用于培養(yǎng)菌體種子的培養(yǎng)基營養(yǎng)應(yīng)豐富，氮源含量宜高（碳氮比低）；用于大量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基其氮源一般應(yīng)比種子培養(yǎng)基稍低，（但若發(fā)酵產(chǎn)物是含氮化合物時，有時還應(yīng)提高培養(yǎng)基的氮源含量）；若代謝產(chǎn)物是次級代謝產(chǎn)物時要考慮

7、是否加入特殊元素或特定代謝產(chǎn)物的前體物；當(dāng)所設(shè)計的是大規(guī)模發(fā)酵用的培養(yǎng)基時，應(yīng)重視培養(yǎng)基中各成份的來源和價格，應(yīng)選擇來源廣泛、價格低廉 的原料，提倡以粗代精，以廢代好。實消（批式滅菌）的工藝操作要點n 定期檢查設(shè)備、管道有無滲漏，主要是：冷卻管道，夾套。n 滅菌之前，先把發(fā)酵罐的分空氣過濾器滅菌并且用空氣吹干。n 開始滅菌時，放出夾套和蛇管中的冷水，開啟排氣管閥，通過空氣管向罐內(nèi)的培養(yǎng)基通入蒸汽進(jìn)行加熱，同時，也可在夾套內(nèi)通蒸汽進(jìn)行間接加熱。升溫時，打開所有排氣閥門，排掉空氣n 當(dāng)培養(yǎng)基溫度升到70左右時，從取樣管和放料管向罐內(nèi)通入蒸汽，培養(yǎng)基溫度達(dá)120，罐壓達(dá)1×105Pa(表壓

8、)時，安裝在發(fā)酵罐封頭上的接種、補料、消沫劑、酸、堿管道應(yīng)排汽，并調(diào)節(jié)好各進(jìn)汽和排汽閥門，使罐壓和溫度保持在這一水平進(jìn)行保溫3045min。n 在保溫階段，凡進(jìn)口在培養(yǎng)基液面下的各管道以及沖視鏡管都應(yīng)通入蒸汽，在液面上的其余各管道則應(yīng)排放蒸汽，目的是對管道進(jìn)行滅菌。這樣才能保證滅菌徹底，不留死角。n 保溫結(jié)束后，依次關(guān)閉各排氣、進(jìn)汽閥門，待罐內(nèi)壓力略高于大氣壓力時，向罐內(nèi)通入無菌空氣，在引入無菌空氣前，罐內(nèi)壓力必須低于過濾器壓力；否則，培養(yǎng)基將倒流入過濾器內(nèi)。在夾套和蛇管中通入冷水，使培養(yǎng)基溫度降到所需溫度。n 引入無菌空氣？保證罐內(nèi)壓力后方可冷卻，目的是防止培養(yǎng)基的冷卻使罐內(nèi)形成負(fù)壓，易染菌

9、，甚至設(shè)備損壞。微生物所需要的五大營養(yǎng)要素包括碳源、氮源、無機(jī)元素、生長因子及水發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇、設(shè)計和注意事項n (1)必須提供合成微生物細(xì)胞、代謝活動和發(fā)酵產(chǎn)物的基本營養(yǎng)成分。（如何理解？）n 對菌體生長與產(chǎn)物相偶聯(lián)的發(fā)酵類型，充分滿足細(xì)胞生長繁殖的培養(yǎng)基就能獲得最大的產(chǎn)物。n 生產(chǎn)氨基酸等含氮化合物時，除充足的碳源物質(zhì)外，還應(yīng)該添加足夠的銨鹽或尿素等氮素化合物。n 主成分與其他成分的配比。n 合適的pH：微生物的生長繁殖或產(chǎn)物合成需要特定的pH環(huán)境。n 合適的濃度：從發(fā)酵動力學(xué)有關(guān)生長、產(chǎn)物合成和基質(zhì)利用物料平衡的關(guān)系中推算所需原料或主要原料的需要量。n 檸檬酸發(fā)酵中鐵、錳和鋅離子都能明

10、顯影響產(chǎn)量，n 鈣離子對細(xì)菌淀粉酶的生產(chǎn)有促進(jìn)作用，n 鈷離子對葡萄糖異構(gòu)酶的發(fā)酵是必需的。n (2)有利于減少培養(yǎng)基原料的單耗，即提高單位營養(yǎng)物質(zhì)所合成產(chǎn)物數(shù)量或最大產(chǎn)率。n (3)有利于提高培養(yǎng)基和產(chǎn)物的濃度，以提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力。n (4)有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期。大量地接入培養(yǎng)成熟的菌種的優(yōu)點n 1.可以縮短生長過程的延緩期，因而縮短了發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率，n 2. 節(jié)約了發(fā)酵培養(yǎng)的動力消耗，n 3.并有利于減少染菌機(jī)會。淀粉質(zhì)原料的處理過程預(yù)處理，水熱處理，蒸煮，糖化處理代謝所需的底物只能是Glucose等單糖或雙糖的微生物n 酵母：G、F、蔗糖、半乳糖

11、、以及部分麥芽糖等n 大部分的細(xì)菌：GA產(chǎn)生菌、Lys產(chǎn)生菌、蘇云金芽孢桿菌等淀粉水解程度的檢測方法n 1，測定還原糖，n 2，酒精法，碘液法。糖蜜原料的處理過程 包括稀釋、酸化、滅菌、澄清和添加營養(yǎng)鹽等過程基本概念：培養(yǎng)基(medium)、碳氮比（C/N）、生長因子、前體物質(zhì)、糖化力單位、DE值、Bx(糖度)n 培養(yǎng)基：應(yīng)科研或生產(chǎn)的需要，由人工配制的、適合于不同微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)（混合養(yǎng)料）。n C/N比值=碳源中的碳原子的mol數(shù)/氮源中所含的氮原子的mol數(shù)n 生長因子：凡是微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)n 前體物質(zhì)：指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能被

12、微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，其自身結(jié)構(gòu)并無多大變化，但產(chǎn)量卻因前體的加入有較大提高。n 糖化力單位：1g曲在2%的可溶性淀粉溶液中，60、1h糖化可溶淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖的毫克數(shù)，n DE值：是表示淀粉或轉(zhuǎn)化淀粉按葡萄糖計算時的總還原值，以對總干物質(zhì)的百分率表示。n Bx（糖度）：是表示糖液中固形物濃度的單位，工業(yè)上指100克糖溶液中，所含固體物質(zhì)的溶解克數(shù)。微生物工業(yè)對菌種的要求n 能在廉價原料制備的培養(yǎng)基上迅速生長和生成所需的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高。n 培養(yǎng)條件易于控制n 生長迅速，發(fā)酵周期短n 滿足代謝控制的要求n 抗噬菌體能力強n 菌種不易變異退化n 安全性（不是病源菌，不產(chǎn)毒素）種

13、子罐的接種方法n 微孔接種法、火焰保護(hù)法、差壓法種子罐級數(shù)（制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)）的決定因素n 菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；n 所采用發(fā)酵罐的容積n 工藝條件根據(jù)“菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度”，不同微生物的種子罐級數(shù)如何？n 細(xì)菌：二級發(fā)酵。n 霉菌：三級發(fā)酵 n 放線菌：四級發(fā)酵n 酵母：一級種子微生物菌種的來源n 根據(jù)資料直接向有關(guān)科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；n 從大自然中分離篩選新的微生物菌種工業(yè)菌種育種的方法n 自然選育、誘變選育、雜交育種、原生質(zhì)體融合技術(shù)育種、基因工程育種誘變育種步驟？說明其中“中間培養(yǎng)”的重要性 出發(fā)菌株的選擇 處

14、理菌懸液的制備 誘變處理 中間培養(yǎng) 分離和篩選n 由于表現(xiàn)延遲 (生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟？檢出營養(yǎng)缺陷型的原理與方法 誘變 淘汰野生型 檢出缺陷型 確定生長譜n 原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。 n 具體方法：影印法、點種法、夾層法 檸檬酸產(chǎn)生菌的育種n 檸檬酸發(fā)酵和其他代謝控制發(fā)酵一樣，都是在環(huán)境水平上的代謝控制發(fā)酵，亦即，選育有代謝技能的突變株，在有控制的培養(yǎng)基上，在有選擇的條件下，才能大量合成產(chǎn)物。 n 1.透明圈大的菌株 平板：10%甘薯 + 2 %的瓊

15、脂 + 0.5% CaCO3 誘變后，涂布，透明圈大的則好，為何？淀粉的水解能力。n 2.現(xiàn)色圈大小 平板：麥汁培養(yǎng)基 + pH值指示劑 誘變后，33培養(yǎng)3天，透明圈大的則好。為何？產(chǎn)酸量大。n 3.不分解檸檬酸的菌株n 不利用檸檬酸為碳源進(jìn)行生長的菌株，說明其TCA循環(huán)中檸檬酸后述的酶的活性較低，或者喪失，這有利于檸檬酸的積累。n 方法：以檸檬酸為唯一的碳源的培養(yǎng)基上，選擇生長不好的突變株。n 4.選育不長孢子、少長孢子、遲長孢子的菌株n 在培養(yǎng)基中如果菌株能夠大量合成積累檸檬酸，自然會使TCA循環(huán)中的中間產(chǎn)物濃度降低，這樣不利于孢子的形成。（中間產(chǎn)物少，C架少，不利于合成代謝）初級代謝產(chǎn)物

16、與次級代謝產(chǎn)物的概念、主要特征與區(qū)別n （1）初級代謝產(chǎn)物n 定義：微生物通過代謝活動所產(chǎn)生的、自身生長和繁殖所必需的物質(zhì)。n 特征：不同的微生物初級代謝產(chǎn)物基本相同；初級代謝產(chǎn)物合成過程是連續(xù)不斷的。n （2）次級代謝產(chǎn)物n 定義：微生物生長到一定階段才產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、對該微生物無明顯生理功能，或并非是微生物生長和繁殖所必需的物質(zhì)。n 特征：不同的微生物次級代謝產(chǎn)物不同；抗生素是一類具有特異性抑菌和殺菌作用的有機(jī)化合物。n （3）初級代謝產(chǎn)物與次級代謝產(chǎn)物的主要區(qū)別：n 對于微生物生長的作用不同n 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同n 產(chǎn)物形成的時間不同微生物是如何實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的代謝調(diào)節(jié)的n 微生物細(xì)胞內(nèi)的

17、代謝調(diào)節(jié)主要通過酶合成量、酶活性及細(xì)胞膜透性的控制實現(xiàn)。微生物代謝中酶合成量調(diào)節(jié)與酶活性調(diào)節(jié)的異同點為什么要選用高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型作為賴氨酸生產(chǎn)菌株？寫出黃色短桿菌中Lys代謝途徑，說明利用黃色短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)Lys的菌種特性和控制要點n （1）天冬氨酸激酶（AK），在黃色短桿菌中是一個變構(gòu)酶，并有兩個活性中心，分別受Lys、Thr的協(xié)同反饋抑制， 協(xié)同反饋抑制，就是該酶有多個活性中心，抑制物可以分別和某一個特定的活性中心結(jié)合，但是并不影響該酶的活性，只有當(dāng)該酶的所有的活性中心都被抑制物結(jié)合后，其活性才受到抑制。n （2）黃色短桿菌中，存在兩個分支點的優(yōu)先合成機(jī)制，即優(yōu)先合成Hos（高絲氨酸），

18、然后再優(yōu)先合成Met，當(dāng)Met過量時，阻遏：催化Hos:琥珀酰高絲氨酸所需要的酶的合成（即，琥珀酰高絲氨酸合成酶），使代謝流向合成Thr的方向進(jìn)行，當(dāng)Thr過量時，反饋抑制：Asp-半醛:Hos所需要的酶的的活性（即高絲氨酸脫氫酶），使代謝流向Lys的合成上。n （1）解除了Hos的優(yōu)先合成機(jī)制，阻斷了代謝向Met、Thr的方向進(jìn)行，節(jié)省了原料，可以使Asp-半醛這個中間代謝產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)入Lys的生物合成上。n （2）在培養(yǎng)基中限量的供給Met 、Thr（或者Hos），對于AK酶活性的調(diào)節(jié)有著重要意義。因為AK酶是一個協(xié)同反饋抑制的變構(gòu)酶，限制了其中某一個抑制物（Thr），則Lys的濃度再高，也

19、不會影響到AK酶的活性，那么，代謝一直向著賴氨酸合成的方向進(jìn)行，使得產(chǎn)物的合成暢通無阻。 E.coli培養(yǎng)在Gluose + 乳糖的Medium 中出現(xiàn)二次生長即發(fā)酵逆轉(zhuǎn)的原因n E.coli在利用Glucose時，分解利用乳糖的酶:-半乳糖苷酶的合成受阻，只有當(dāng)Glucose被利用完以后，上述這種對-半乳糖苷酶合成的阻遏作用隨之消失，于是出現(xiàn)了菌體利用乳糖進(jìn)行生長的第二個對數(shù)生長期。n 給生產(chǎn)帶來的危害：在正常的發(fā)酵過程中，微生物群體從完成了生長型到產(chǎn)物積累型的轉(zhuǎn)變后，大量的產(chǎn)物開始生成，底物源源不斷地轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物，但是當(dāng)培養(yǎng)基中存在易引起分解代謝阻遏的物質(zhì)時，菌體可能出現(xiàn)二次生長，微生物群體

20、又回到了生長狀態(tài)，即發(fā)生了發(fā)酵逆轉(zhuǎn)，這顯然是不利于提高產(chǎn)量的。組成型酶變異株的篩選方法（1）恒化器法；（2）循環(huán)培養(yǎng)法；（3）誘導(dǎo)抑制物法；生產(chǎn)中克服分解代謝阻遏的措施（1）抗性突變株的選育： 從遺傳學(xué)看，如果調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使阻遏蛋白失活；操作基因發(fā)生突變，不能與阻遏蛋白結(jié)合，那么這種分解代謝阻遏就不存在，有利于代謝產(chǎn)物的過量生產(chǎn)。（2）生產(chǎn)中避免使用有阻遏作用的C源、N源 目前已知的不易引起分解代謝阻遏的C源：乳糖、有機(jī)酸； 目前已知的不易引起分解代謝阻遏的N源：黃豆粉， 黃豆粉之所以不易引起分解代謝阻遏，是因為黃豆粉是一個顆粒狀的原料，其中的蛋白質(zhì)存在于顆粒中，起到緩釋的作用。（3）流

21、加C源、N源緩慢的流加C源、N源，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的C源、N源一直保持在一個均勻的、較低的水平，則有利于消除分解代謝阻遏的出現(xiàn)，可以明顯的提高產(chǎn)量。防止突變株的回復(fù)突變的方法（1）選擇具有雙重標(biāo)記的突變株。例如，在Lys的發(fā)酵中選育具有 Hos- 和Met- 的雙重標(biāo)記菌株，可以提高其穩(wěn)定性。（2）對于抗性突變株。可以在培養(yǎng)基中加入適量的結(jié)構(gòu)類似物，以防止已經(jīng)發(fā)生回復(fù)突變株的抗性突變株 的增殖。改變細(xì)胞膜透通性的方法（1）改變膜的組成與結(jié)構(gòu)，使之成為不完整的細(xì)胞膜。 （2）破壞細(xì)胞壁的合成，使之不能合成完整的細(xì)胞壁，由此，細(xì)胞膜由于缺乏細(xì)胞壁的機(jī)械保護(hù)作用可以改變其滲透性。（3）透通性酶活性的調(diào)

22、節(jié)與控制：細(xì)胞膜對于要輸送的物質(zhì)具有高度的選擇性，這種高度選擇性與透通性酶的活性、結(jié)構(gòu)有著直接的關(guān)系，而透性酶與其他酶相同，也有著自己的調(diào)節(jié)與控制機(jī)制。研究這種機(jī)制，有利于提高微生物的代謝產(chǎn)物的過量生產(chǎn)。前體（前驅(qū)物質(zhì)）在提高次級代謝產(chǎn)物中的作用，舉例說明在合成途徑已基本清楚的條件下，向發(fā)酵培養(yǎng)基中補加前體，可以有效的提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。舉例：在青霉素G的發(fā)酵法生產(chǎn)中，補加前體物質(zhì)，苯乙酸or其衍生物，可以明顯的增加青霉素的產(chǎn)量。因為，在青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，苯乙酰-CoA是青霉素G生物合成的限速性因子，受到許多代謝控制，添加苯乙酸or其衍生物后，可以提高苯乙酰-CoA的濃度，解除了苯乙

23、酰-CoA對于青霉素G合成的限速，從而提高青霉素的產(chǎn)量。放罐時間對下游工序的影響（1）放罐時間過早，會殘留過多的養(yǎng)分，如糖、脂肪、可溶性蛋白等，對提取不利，這些物質(zhì)能增加乳化作用或干擾樹脂的交換；（2）放罐時間太晚，菌絲自溶，不僅會延長過濾時間還會使一些不穩(wěn)定的抗生素單位下跌，擾亂提取工段的作業(yè)計劃。判斷放罐的指標(biāo)有哪些？產(chǎn)物濃度、過濾速度、氨基氮、菌絲形態(tài)、pH值、培養(yǎng)液的外觀、粘度等。檸檬酸的發(fā)酵中側(cè)系呼吸鏈的作用在檸檬酸的發(fā)酵微生物體內(nèi)確實存在側(cè)系呼吸鏈，該側(cè)系呼吸鏈中的酶系強烈需氧，如在檸檬酸的發(fā)酵中，發(fā)酵液的溶氧濃度在很低水平維持一段時間，或中斷供氧一段時間（20分鐘），則這一側(cè)系呼

24、吸鏈不可逆的失活，其結(jié)果是菌體不再產(chǎn)酸，而是產(chǎn)生了大量的菌體。標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈的存在使得菌體在代謝過程中產(chǎn)生了大量的ATP，用于菌體自身的生長上，這種現(xiàn)象，在生產(chǎn)上通常稱之為：只長菌不產(chǎn)酸 ，大量的葡萄糖被消耗了，卻沒有生產(chǎn)出檸檬酸，是一種失敗，（大型檸檬酸生產(chǎn)企業(yè)需要自己備用的發(fā)電系統(tǒng)）?；蚬こ叹陌l(fā)酵過程 目的基因獲得載體連接引入宿主工程菌發(fā)酵表達(dá)提取工程菌的不穩(wěn)定性（1）質(zhì)粒不穩(wěn)定：質(zhì)粒的丟失；重組質(zhì)粒發(fā)生DNA片段脫落；（2）產(chǎn)物表達(dá)不穩(wěn)定（產(chǎn)物發(fā)酵水平波動較大）。發(fā)酵溫度對工程菌發(fā)酵的影響 基因工程菌生長的最適溫度往往與發(fā)酵溫度不一致，一般，控制溫度以達(dá)到前期高效繁殖，后期高效

25、表達(dá)的目的。溫度同時還影響目的產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）的表達(dá)形式和穩(wěn)定性。外源蛋白質(zhì)表達(dá)時，在較高溫度下表達(dá)包涵體的菌種，常常在較低溫度下有利于表達(dá)可溶性蛋白質(zhì)。對于溫度誘導(dǎo)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，在生長期維持為37，在產(chǎn)物生產(chǎn)期要提高溫度，一般為42，啟動外源基因轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程，實現(xiàn)產(chǎn)物的最大限度表達(dá)。對于熱敏感的蛋白質(zhì)，生產(chǎn)期可采用先高溫誘導(dǎo)，然后降低溫度，進(jìn)行變溫表達(dá)，避免蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性降解。 （1）對于大多數(shù)的基因工程菌，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。（2）對于大腸桿菌往往在30左右質(zhì)粒穩(wěn)定性最好。（3）對于采用溫敏啟動子控制的質(zhì)粒，大腸桿菌由30升高到42誘導(dǎo)外源基因表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)

26、物時，經(jīng)常伴隨質(zhì)粒的丟失。為此，可以建立基于溫度變化的分步連續(xù)培養(yǎng)。在第一個反應(yīng)器中，30下進(jìn)行生長培養(yǎng)，增加質(zhì)粒穩(wěn)定性，然后流入第二個反應(yīng)器中，在42下進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá)。 可見溫度的控制相當(dāng)重要，必須選擇適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)時期和適宜的誘導(dǎo)溫度?；靖拍睿悍N子擴(kuò)大培養(yǎng)、誘變育種、營養(yǎng)缺陷型、基因重組育種、雜交育種、初級代謝產(chǎn)物、次級代謝產(chǎn)物、葡萄糖效應(yīng)、臨界菌體濃度（1） 種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。（2） 誘變育種：在人為地條件下，利用物理，化學(xué)等因素，以誘發(fā)基因突變?yōu)槟康?/p>

27、的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。（3） 營養(yǎng)缺陷型：指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。（4） 基因重組育種：是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)；或通過細(xì)胞間的相互作用，使一個細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另個細(xì)胞的方法。（5） 雜交育種：一般是指兩個基因型不同的菌株通過吻合（接合），使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。（6） 初級代謝產(chǎn)

28、物：微生物通過代謝活動所產(chǎn)生的、自身生長和繁殖所必需的物質(zhì)。（7） 次級代謝產(chǎn)物：微生物生長到一定階段才產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、對該微生物無明顯生理功能，或并非是微生物生長和繁殖所必需的物質(zhì)。（8） 葡萄糖效應(yīng)：又稱為分解代謝產(chǎn)物阻遏，當(dāng)細(xì)胞在易于被利用的碳源上生長時，有些參與分解代謝的誘導(dǎo)酶的合成往往受到阻遏，這就是葡萄糖效應(yīng)。（9） 臨界菌體濃度：攝氧速率與氧傳遞速率平衡時的菌體濃度。氨基酸的制備方法有哪些？發(fā)酵法：發(fā)酵法又可分為直接發(fā)酵法與添加前體的發(fā)酵法。添加前體法是以氨基酸的中間產(chǎn)物為原料，用微生物法轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的氨基酸。提取法：將蛋白質(zhì)原料用酸水解，然后從水解液中提取氨基酸。目前，胱

29、氨酸、半胱氨酸和酪氨酸仍用提取法生產(chǎn)。酶法：利用微生物細(xì)胞或微生物產(chǎn)生的酶來制造氨基酸。合成法：用化學(xué)合成法制造的氨基酸有DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸，甘氨酸和苯丙氨酸。谷氨酸的大量積累不是由于生物合成途徑的特異，而是菌體代謝調(diào)節(jié)控制和細(xì)胞膜通透性的特異調(diào)節(jié)以及發(fā)酵條件的適合。谷氨酸產(chǎn)生菌的主要特征1. a-酮戊二酸氧化能力微弱: a-酮戊二酸脫氫酶喪失或活性低.2. 谷氨酸脫氫酶活性強.3. 還原性輔酶(NADPH+H+)進(jìn)入呼吸鏈能力缺陷或微弱.4. 異檸檬酸裂解酶活力微弱.5. 不利用谷氨酸.6. 耐高糖耐高谷氨酸 .7. CO2固定能力強.8.解除谷氨酸反饋抑制.9.具有向胞外分泌谷氨酸

30、的能力.谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞膜的通透性實驗是如何進(jìn)行的？n 用能積累谷氨酸菌株做如下實驗:1. 生物素充足時,細(xì)胞內(nèi)含大量谷氨酸,但培養(yǎng)液里幾乎不含谷氨酸2. 用溶菌酶消化細(xì)胞壁得到的原生質(zhì)體仍不分泌谷氨酸3. 當(dāng)把原生質(zhì)體放入低滲溶液里,將其漲破,谷氨酸才排出4. 生物素亞適量時,培養(yǎng)液里含大量谷氨酸,細(xì)胞里含量少n 結(jié)論:谷氨酸的分泌是由細(xì)胞膜控制6條GA 的生物合成途徑或反應(yīng)葡萄糖的酵解，EMP葡糖糖的有氧氧化，HMP丙酮酸的有氧氧化，TCA循環(huán)乙醛酸循環(huán)途徑，DCA循環(huán)CO2固定反應(yīng)-酮戊二酸的還原氨基化谷氨酸產(chǎn)生菌之所以能夠合成、積累并分泌大量的GA，其菌種內(nèi)在的原因有哪些？GA產(chǎn)生菌必

31、須具備以下條件：（1）生物素缺陷型 谷氨酸產(chǎn)生菌大多數(shù)為生物素缺陷型,谷氨酸發(fā)酵時,通過控制生物素亞適量(貧乏量) ,引起菌種代謝失調(diào), 使谷氨酸得到大量積累。（2）具有CO2 固定反應(yīng)的酶系 菌種能利用CO2 產(chǎn)生大量草酰乙酸, 有利于谷氨酸的大量積累。（3）-酮戊二酸脫氫酶酶活性微弱或喪失體內(nèi)-KGA脫氫酶活性很低時，TCA循環(huán)才能夠停止，-KGA才得以積累，為谷氨酸的生成奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。（4）谷氨酸產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPH氧化能力欠缺或喪失，NADPH是-酮戊二酸還原氨基化生成谷氨酸必須物質(zhì)，而且該還原氨基化所需要的NADPH是與檸檬酸氧化脫羧相偶聯(lián)的。（5）產(chǎn)生菌體內(nèi)乙醛酸循環(huán)（DCA）的

32、關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶，DCA 循環(huán)的封閉是實現(xiàn)谷氨酸發(fā)酵的首要條件。糖的代謝才能沿著-酮戊二酸的方向進(jìn)行, 從而有利于谷氨酸的積累。（6）菌體有強烈的L-谷氨酸脫氫酶活性L-谷氨酸脫氫酶，實質(zhì)上GA產(chǎn)生菌體內(nèi)該酶的酶活性都很強，-酮戊二酸易生成谷氨酸。谷氨酸產(chǎn)生菌之所以能夠在10%以上的葡萄糖培養(yǎng)基上，生產(chǎn)大量的GA,除了上述谷氨酸產(chǎn)生菌的內(nèi)在本質(zhì)外，其需要的外在條件有什么？（1） 供氧濃度（通風(fēng)）過量：NADPH的再氧化能力會加強，使-KGA的還原氨基化受到影響，不利于GA 的生成。供氧不足：積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于GA的產(chǎn)生，同時，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化

33、率，降低了產(chǎn)物的產(chǎn)出率。（2） NH4+濃度（1）影響到發(fā)酵液的pH值（2）與產(chǎn)物的形成有關(guān)：NH4+過量，菌體增殖階段會抑制菌體生長，產(chǎn)酸階段Glu會受谷氨酰胺合成酶作用轉(zhuǎn)化為GlnNH4+不足，不利于-KGA的還原氨基化， a-酮戊二酸積累，引起反饋調(diào)節(jié)（3）磷酸鹽：過量：（1）促進(jìn)EMP途徑，打破EMP與TCA之間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等（2）產(chǎn)生并積累Val， （4）發(fā)酵液的碳氮比：在碳源和氮源的比為31時（發(fā)酵期），谷氨酸棒狀桿菌會大量合成谷氨酸，但當(dāng)碳源和氮源的比為41時（長菌期），谷氨酸棒狀桿菌只生長而不合成谷氨酸。（5）生物素：亞適量（6）發(fā)酵溫度：谷氨酸發(fā)酵前期應(yīng)采取菌體生長最適溫度,即3032 。發(fā)酵中、后期菌體生長基本停止, 為積累大量谷氨酸，應(yīng)適當(dāng)提高發(fā)酵溫度，但溫度過高,酶易失活，谷氨酸生成受阻。（7）pH值 pH：前期pH（7.58.0），中后期pH7.07.6。通過采用流加尿素，氨水或液氨等辦法調(diào)節(jié)pH，補充氮源。 （8）泡沫：(1) 泡沫形成泡蓋時, 代謝產(chǎn)生的氣體不能及時排出,妨礙菌體呼吸作用,影響菌體的正常代謝; (2) 泡沫過多, 發(fā)酵液會外溢,造成浪費和污染; (3) 泡沫過多,易沖上罐頂,造成染菌。谷氨酸發(fā)酵過程中，生物素（ VH）作用表現(xiàn)在那幾