生物工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、生物工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（適用生物工程專業(yè)）屈慧鴿 馮志彬 程仕偉編寫魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)一 呼吸缺陷型酵母菌株的誘變選育一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、理解呼吸缺陷性酵母的篩選原理；2、掌握呼吸缺陷性酵母的篩選步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理部分酵母菌在一定的物理（如紫外線）或化學(xué)誘變劑作用下發(fā)生基因突變而喪失呼吸能力，呼吸缺陷性酵母菌株即為喪失呼吸能力的突變株，其對(duì)非發(fā)酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，但CO2放出高于對(duì)照株，酒精脫氫酶活力也較對(duì)照高出1倍左右，對(duì)提高酒精產(chǎn)率有好處。同時(shí)，呼吸缺陷型也是育種工作可利用的一個(gè)有效的遺傳標(biāo)記。三、實(shí)驗(yàn)材料1.菌株：酒精酵母2.培養(yǎng)基CM培養(yǎng)基：葡萄糖 40g MgSO

2、4 2g蛋白胨 10g 瓊脂 18g酵母膏 5g 水 1000mlKH2PO45g不加瓊脂即為液體CM，分裝20ml于250ml三角瓶中。TTC上層培養(yǎng)基葡萄糖5g TTC（紅氮四唑）0.5 g瓊脂 10g 水 1000ml 分裝，121滅菌 15min。TTC下層培養(yǎng)基葡萄糖 10g MgSO4 7H2O0.4g蛋白胨 2g 瓊脂 18g酵母膏 5g 水 1000mlKH2PO41g pH 5.55.7MM甘培養(yǎng)基酵母膏6.7g 甘油 20ml水 980ml pH 5.5瓊脂粉 18g分裝，121滅菌 10min。3、儀器設(shè)備紫外誘變箱、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱四、操作步驟1、培養(yǎng)

3、基配制：配制實(shí)驗(yàn)過程中所需全部培養(yǎng)基并準(zhǔn)備誘變及篩選所需的移液管、試管、平板等物品，121滅菌20min，其中TTC上層板培養(yǎng)基滅菌后備用，無需倒平板；2、菌種活化：取活化后的酵母菌1環(huán)，接入到三角瓶中液體CM培養(yǎng)基，200r/min、30振蕩培養(yǎng)過夜；3、菌懸液制備：將培養(yǎng)好的酵母細(xì)胞4000r/min離心洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml備用，實(shí)驗(yàn)過程無菌操作；4、誘變：取15-20ml菌懸液于滅菌空白平板內(nèi)，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為30r/min，調(diào)整與紫外燈管距離為20cm，開蓋照射45-75s，蓋上蓋誘變結(jié)束；5、稀釋涂布：將誘變后的菌懸液梯度稀釋至10-6，于CM平板涂布，避光培養(yǎng)24-

4、36h，選擇菌落個(gè)數(shù)合適的平板備用；6、點(diǎn)接：將CM培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的菌落點(diǎn)種TTC下層平板上，30培養(yǎng)24-48h；7、鑒定：將TTC上層培養(yǎng)基溶化并冷卻（不燙手）后，小心傾入TTC上層培養(yǎng)基上，使其剛好掩埋菌落。等凝固后，30培養(yǎng)23h。此時(shí)，平板菌落顏色會(huì)區(qū)分成紅色、粉紅色和白色。呼吸缺陷型突變株為白色菌落。8、復(fù)檢：用無菌牙簽將在TTC鑒別培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的白色小菌落分別點(diǎn)種到MM甘培養(yǎng)基和CM培養(yǎng)基上。注意點(diǎn)種時(shí)，先點(diǎn)MM甘培養(yǎng)基，后點(diǎn)種CM培養(yǎng)基，并在平皿上做好標(biāo)記。30培養(yǎng)24h觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1、描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算呼吸缺陷性酵母突變率，并分析實(shí)驗(yàn)過程中影響誘變效果的因素

5、；2、對(duì)比并參照其他小組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，評(píng)價(jià)本小組實(shí)驗(yàn)過程中的利害得失六、數(shù)據(jù)分析突變率：平板計(jì)數(shù)法七、思考題1、分析呼吸缺陷型突變株為白色菌落為白色，其它菌株紅色、粉紅色的機(jī)理。2、呼吸缺陷性酵母篩選工作有何現(xiàn)實(shí)意義？3、如果白色小菌落分別點(diǎn)種到MM甘培養(yǎng)基和CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)后都有生長(zhǎng)，討論有哪些原因？實(shí)驗(yàn)二 紅曲發(fā)酵及紅曲色素的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解紅曲菌液體菌種的制備方法, 為紅曲發(fā)酵實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備液體種子。2、了解固體發(fā)酵的工藝過程 , 在實(shí)驗(yàn)室中小規(guī)模制備紅曲。3、熟悉從紅曲中分離代謝產(chǎn)物的方法，以及掌握紅曲色素色價(jià)的測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 紅曲霉菌屬真菌界(Eumycophyta)、子囊菌門

6、(Ascomycota)、真子囊菌綱(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、紅曲菌科(Monascaceae)、紅曲菌屬(Monascus)。由紅曲霉接種于大米發(fā)酵得到的紅曲是我國(guó)古代的一大發(fā)明，稱為丹曲，至今已有1000多年的歷史，很早就應(yīng)用于食品著色、食品發(fā)酵以及中醫(yī)中藥。紅曲霉作為紅曲的生產(chǎn)菌, 以其可產(chǎn)生大量天然色素而著稱。紅曲的應(yīng)用主要有三方面：食品色素、藥物和發(fā)酵食品。紅曲色素是紅曲霉在生長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生的天然色素，是紅曲霉的次生代謝產(chǎn)物，具有熱穩(wěn)定性好，蛋白著色力強(qiáng)，色調(diào)柔和，可以提高加工制品對(duì)光和氧穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)；而且紅曲色素?zé)o毒性、無致突變作用，安全性

7、很高，因此紅曲可提供安全性高的天然色素。紅曲色素分為黃色素、橙色素和紫紅色素，其中黃色素包括紅曲素(Monascin)和黃紅曲素(Ankaflavin)，橙色素包括紅斑紅曲素(Rubropunctatin)和紅曲玉紅素(Monascorubin)，紫紅色素包括紅斑紅曲胺(Rubropunctamine)和紅曲玉紅胺(Monascoru- bramine)。凡色素的呈色都與其結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系，結(jié)構(gòu)的形式與變化內(nèi)在決定著物質(zhì)的呈色與變色。大米經(jīng)紅曲菌固體發(fā)酵后產(chǎn)生了一系列紅曲菌的代謝產(chǎn)物, 但這些產(chǎn)物的量非常少, 大米仍占固體發(fā)酵產(chǎn)物的絕大部分體積, 為了降低運(yùn)輸成本, 常常要對(duì)紅曲菌的代謝產(chǎn)物

8、進(jìn)行提取和濃縮。紅曲的代謝產(chǎn)物中既有水溶性組分, 也有脂溶性組分, 因此可用 80% 的丙酮(丙酮:水 =80：20)抽提。用 HCl 或 NaOH 處理可以將其中的酸溶性組分、堿溶性組分和中性組分分開。選擇溶劑一般要注意以下四點(diǎn)： 溶劑對(duì)所需成分的溶解度要大，對(duì)雜質(zhì)溶解度要小，或反之。 溶劑不能與天然藥物成分產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，即使反應(yīng)亦屬于可逆性的。 溶劑要經(jīng)濟(jì)易得，并具有一定的安全性。 沸點(diǎn)宜適中，便于回收反復(fù)使用。紅色素能溶于80% 的乙醇中 , 可通過萃取從米粒中提取出來, 紅曲色素在505nm 處有最大的吸收峰, 可用分光光度計(jì)來測(cè)定。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑1菌種：紅曲50032培養(yǎng)基玉米面

9、液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 20；玉米面 20；酵母浸粉 10；硫酸鎂0.5；磷酸氫二鉀 1；硫酸亞鐵 0.1；pH 6.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：大米培養(yǎng)基3、儀器與設(shè)備恒溫?fù)u床, 超凈工作臺(tái), 高壓蒸汽滅菌鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、恒溫培養(yǎng)箱等。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、紅曲液體種子制備：配制制玉米面液體培養(yǎng)基。500mL 三角瓶中裝玉米面液體培養(yǎng)基 150mL, 包扎后 0.lMPa 滅菌 20 分鐘；玉米面液體培養(yǎng)基滅菌冷卻后 , 每瓶中接入 1/4支紅曲斜面菌苔 ( 注意無菌操作 )；接種后置30恒溫?fù)u床中180 rpm 搖瓶培養(yǎng)3天。2、固體培養(yǎng)基制備及接種1）浸米 :25 以上浸米 58h, 大米吸收水分約

10、在 28%30% 。2）蒸米: 將浸好的米用清水淋去米漿水, 瀝干, 即可蒸米。上汽火力要強(qiáng), 待全部圓氣以后，蒸煮35min, 出飯率在 135%, 飯粒呈玉色, 粒粒疏松, 不結(jié)團(tuán)塊。蒸米不能熟透。3）攤涼接種: 將蒸熟的曲料倒在超凈工作臺(tái)上迅速打碎團(tuán)塊, 攤平冷卻到 3032 然后, 每1kg米接種液體種子20ml, 充分翻拌混合均勻,操作要迅速, 以減少雜菌污染。3、紅曲固態(tài)發(fā)酵: 將曲料攤在曲盤內(nèi), 厚度約3-5cm。3233 保溫保濕培養(yǎng)。每天翻曲一次，觀察到曲粒表面略有干皮、少數(shù)曲粒略有微紅斑點(diǎn)等現(xiàn)象時(shí)即可“吃水”, 使曲粒吸收一定水分, 以利菌絲逐漸向內(nèi)生長(zhǎng)。吃水方法: 一邊拌

11、曲，一邊向曲盤中噴灑無菌水, 使曲粒表面潤(rùn)濕并微有發(fā)脹。培養(yǎng)3天后米粒逐漸成紅色。觀察記錄色素產(chǎn)生的過程。培養(yǎng)5-7天后，固態(tài)發(fā)酵結(jié)束的紅曲置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)5060鼓風(fēng)干燥。4、成品質(zhì)量檢查外觀檢查 : 曲粒表層光滑紫紅, 曲粒中心呈玉色, 不得有空心和紅心。曲粒斷面菌絲均勻，具有紅曲特有的曲香, 不得有酸氣等不正常氣味。生物與理化項(xiàng)目檢查: 水分12%以下, 容量(l00mL)44.546.5g, 淀粉含量59-62%, 無細(xì)菌和其他霉菌污染。5、紅曲色素提?。?）取200g固體發(fā)酵之紅曲, 在植物粉碎機(jī)中將其粉碎；2）將紅曲粉放于500mL 三角瓶中, 加入提取液(丙酮 : 水 =80:2

12、0)300mL；3）室溫下浸提 1 天, 每隔 2 小時(shí)搖動(dòng)一次, 過濾；4）沉淀用同樣提取液洗滌 2 次, 每次100ml, 合并濾液；5）在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸去丙酮( 尚有水分 )；6）用 l mol/L HCl調(diào)殘留液(約 l00mL)的pH至3.0, 加至分液漏斗中；7）用 150mL 醋酸乙酯分次抽提；8）以同樣方法按下圖分離堿(溶)性組分、中性組分和酸(溶)性組分, 觀察各組分的顏色；9）將各分離到的組分在旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)儀中蒸去溶劑, 低溫保存。五 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制紅曲色價(jià)生成曲線，分析影響紅曲色素合成的因素2、根據(jù)紅曲色素分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果描述紅曲色素組分及特性六、參數(shù)測(cè)

13、定紅曲色價(jià)測(cè)定：1）稱取紅曲米樣品0.5g, 放入帶有刻度的 lOmL 具塞試管中；2）加入 80%的乙醇 8mL, 搖勻,60水浴保溫萃取0.5h；3）取出冷卻, 用普通定性濾紙過濾入lOmL 量筒中, 用 80% 乙醇洗滌殘?jiān)?2 次, 合并濾液, 并用 80% 乙醇定容至10mL；4）以 80% 乙醇作對(duì)照, 在 505nm 波長(zhǎng)下, 用 lcm 比色皿測(cè)定樣品的吸光度。5）計(jì)算: 紅曲色價(jià)(以lg樣品計(jì))=A505×lO×2注意：發(fā)酵后期, 若紅色素產(chǎn)生量多, 可稀釋后測(cè)定。七、注意事項(xiàng) :1. 無水 Na2S04可回收, 反復(fù)使用, 不要扔掉。2. 有機(jī)溶劑易燃,

14、 注意遠(yuǎn)離火源, 原則上應(yīng)在通風(fēng)柜中進(jìn)行。八、思考題 :1比較固態(tài)發(fā)酵與液體發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn)，并指出固體發(fā)酵的應(yīng)用范圍。2萃取后米粒中仍帶有紅色, 是否會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響?附：紅曲代謝產(chǎn)物分離工藝流程圖實(shí)驗(yàn)三蘇云金芽孢桿菌的培養(yǎng)及粉劑制備一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 學(xué)習(xí)蘇云金芽孢桿菌的種子制備、發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品檢測(cè)的方法；2、 掌握蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的調(diào)控原理。二、 實(shí)驗(yàn)原理蘇云金芽孢桿菌是內(nèi)生芽孢的革蘭氏陽(yáng)性土壤細(xì)菌，是應(yīng)用最廣的一種微生物殺蟲劑，它的主要活性成分是一種或數(shù)種殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)，又稱-內(nèi)毒素，對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅

15、目、同翅目等昆蟲，以及動(dòng)植物線蟲、蜱螨等節(jié)肢動(dòng)物都有特異性的毒殺活性，而對(duì)非目標(biāo)生物安全因此，Bt殺蟲劑具有專一、高效和對(duì)人畜安全等優(yōu)點(diǎn)目前蘇云金桿菌商品制劑已達(dá)100多種，是世界上應(yīng)用最為廣泛、用量最大、效果最好的微生物殺蟲劑，因而倍受人們關(guān)注。殺蟲伴孢晶體蛋白本身無毒，在酸性條件下會(huì)變性失去作用，對(duì)于人和哺乳動(dòng)物，當(dāng)它進(jìn)入機(jī)體后，馬上在胃酸作用下變性，而在腔腸動(dòng)物體內(nèi)，沒有酸性環(huán)境，不會(huì)馬上變性，在堿性條件下馬上分解，釋放毒性蛋白，起到對(duì)集體的毒害作用。利用發(fā)酵法可實(shí)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌的大規(guī)模培養(yǎng)，最后加工成含有芽孢、伴孢晶體及其他毒素的粉劑。三、 實(shí)驗(yàn)材料一） 設(shè)備發(fā)酵罐、搖床、顯微鏡、干

16、燥箱、高速離心機(jī)二） 菌種蘇云金芽孢桿菌三） 培養(yǎng)基(%)斜面培養(yǎng)基酵母粉 0.5，蛋白胨 1，NaCL 0.5，pH7.0種子培養(yǎng)基：葡萄糖 2，酵母浸粉 0.5，蛋白胨 0.5， K2HPO4 0.1，MgSO4 0.05，硫酸銨 0.5，pH7.0發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 3，酵母浸粉 0.5，玉米漿 1，K2HPO4 0.1，MgSO4 0.05，硫酸銨 1，pH7.0四、實(shí)驗(yàn)步驟1、斜面菌種制備：接種針挑取1環(huán)原始菌種，于斜面培養(yǎng)基劃線，在恒溫培養(yǎng)箱30培養(yǎng)24h；2、液體種子培養(yǎng)：挑取1環(huán)培養(yǎng)好的線面菌株，接種到含50ml液體種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在200r/min、30條件下

17、培養(yǎng)12h左右，待菌體OD凈增達(dá)到0.5以上時(shí)轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基；3、發(fā)酵罐培養(yǎng)：配置好發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行原位滅菌，待培養(yǎng)基溫度冷卻至30時(shí)按10%種量接入培養(yǎng)好的種子液，調(diào)節(jié)進(jìn)氣和尾氣閥門維持罐壓在0.5Mpa以內(nèi)，轉(zhuǎn)速200-700r/min，通氣量 0.8-6vvm，溶氧在20%以上，溫度30，pH7.0，過程中流加NaOH或氨水調(diào)節(jié)pH在7.0，培養(yǎng)至菌體濃度在20億/ml，90%菌體細(xì)胞形成內(nèi)生芽孢時(shí)停止發(fā)酵；4、粉劑制備取一定體積發(fā)酵液于4000r/min離心機(jī)離心10min，棄上清取沉淀，于50-60干燥箱烘干即為蘇云金芽孢桿菌粉劑。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1、采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算發(fā)酵液菌體濃度

18、并利用細(xì)菌計(jì)數(shù)器計(jì)算芽孢形成率；采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算粉劑中芽孢數(shù)量,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析影響菌體生長(zhǎng)及芽孢形成的因素2、根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制時(shí)間與還原糖、溶氧、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH及菌體濃度的過程曲線，并解釋曲線變化的原因六、參數(shù)測(cè)定方法1、菌體OD：發(fā)酵液稀釋20倍，采用分光光度計(jì)于600nm測(cè)吸光值2、還原糖：斐林試劑法3、活菌計(jì)數(shù)：平板計(jì)數(shù)法七、思考題1、簡(jiǎn)述蘇云金芽孢桿菌的殺蟲原理；2、利用發(fā)酵罐培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌過程中，溶氧對(duì)菌體生長(zhǎng)有何影響。3、為了解發(fā)蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵過程中二氧化碳濃度的變化，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定尾氣中二氧化碳濃度的方法，并說明實(shí)驗(yàn)原理。附錄發(fā)酵液中還原糖的測(cè)定方法（亞鐵氰化鉀快

19、速法）1 試劑與溶液1.1 費(fèi)林氏甲液稱取分析純硫酸銅(CuSO4·5H2O)15g及四甲基藍(lán) (次甲基藍(lán)) 0.05g,用蒸餾水溶解, 定容至1000mL。1.2 費(fèi)林氏乙液稱取分析純酒石酸鉀鈉50g，分析純氫氧化鈉54g及分析純亞鐵氰化鉀4g，用蒸餾水溶解，定容至1000mL。1.3 0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液精確稱取在105烘 23h至恒重的分析純無水葡萄糖1.000g,放入100mL燒杯中,用蒸餾水溶解,定容至1000mL,為防染菌,可加 5mL濃鹽酸后再定容。2 測(cè)定方法2.1 樣品處理及吸取吸取樣品10mL,用蒸餾水稀釋定容至100mL,搖勻吸取稀釋液 1mL進(jìn)行測(cè)定。稀釋度及吸取量根據(jù)含糖量可予增減。2.2 空白滴定精確吸取費(fèi)林試劑甲、乙液各5mL放入150mL錐形瓶中,加蒸餾水10mL。再用滴定管加入0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液9mL。搖勻，在電爐(或煤氣燈)上加熱,使其在2min內(nèi)沸騰,沸騰30s后,勻速滴入0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，至藍(lán)色消失即為終點(diǎn)。記錄沸騰前后共耗用葡萄糖液毫升數(shù)(A)。2.3 預(yù)備滴定精確吸取費(fèi)林甲、乙液各5mL,放入150mL錐形瓶中,加蒸餾水10mL,再加1mL10