ConA誘導小鼠脾淋巴細胞上清對下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響

1、    ConA誘導小鼠脾淋巴細胞上清對下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響        摘要目的：探討免疫對神經(jīng)內分泌系統(tǒng)的上行調節(jié)通路。方法：采用ConA誘導淋巴細胞培養(yǎng)上清液給小鼠腹腔注射，測定不同時間(0.5，1，2，4，6 h)的小鼠血漿中CRH，ACTH，皮質酮(CORT)產(chǎn)生的動力學，同時在體外用ConA誘導上清液分別與下丘腦，垂體，腎上腺組織共同培養(yǎng)后觀察CRH，ACTH，CORT分泌情況。結果：在體內ConA誘導上清可在2 h內明顯促進CRH，ACTH和CORT的

2、產(chǎn)生（P0.05）。體外培養(yǎng)6 h可明顯增加CRH分泌，16 h時ACTH和CORT明顯增加（P0.05）。結論：ConA誘導上清可在下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPAA)三個不同的層次上進行調節(jié)。主題詞伴刀豆球蛋白A；下丘腦；垂體；腎上腺 Effects of supernatants induced by ConA on hypothalamo-pituitary-adrenal axisZHANG Cui,LIU Zhong-HuiDepartment of Microbiology,Guangdong College of Pharmacy,Guangzhou(510224)Departm

3、ent of Immunology,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun(130021)Abstract AIM：In order to investigate the regulation of neuro-endocrine system up-pathway by immunity.METHODS：the supernatants of cultured spleen's lymphocytes induced by ConA were injected into mice peritoneally，kin

4、etics of plasma corticotropin releasing hormone(CRH),adrenocorticotropic hormone(ACTH) and corticosterone(CORT) in mice were tested at different time (0.5,1,2,4,6 h),or tissue of hypothalamus pituitarium or adrenal was stimulated with supernatants induced by ConA,and the secretion of CRH, ACTH and C

5、ORT were observed.RESULTS：Supernatants induced by ConA significantly increased the production of CRH, ACTH and CORT in vivo at 2 h(P0.05). In vitro,experiment CRH highly increased at 6 h, ACTH and CORT significantly increased at 16 h(P0.05).CONCLUSION：Supernatant of splenocyts induced by ConA regula

6、ted at all three levels of the hypothalamus-pituitary-adrenal axis.MeSHConcanavalin A; Hypothalamus;Pituitary gland; Adrenal gland免疫系統(tǒng)與神經(jīng)內分泌系統(tǒng)的相互調節(jié)機制較復雜，介導兩大系統(tǒng)相互作用的共同介質為神經(jīng)肽類，細胞因子和相應的受體1，2。為了測定免疫產(chǎn)物對下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamo-pituitary-adrenal axis,HPAA)的作用，采用ConA誘導上清進行體內和體外實驗，分別在下丘腦、垂體、腎上腺3個層次上檢測促腎上腺皮質釋

7、放激素(corticotropin releasing hormone,CRH),促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)和皮質酮(corticosterone,CORT)分泌量的變化。材料與方法一、動物：Swiss小鼠，雌性，體重(20±2) g，4周齡，由本院動物室提供。二、試劑：刀豆蛋白(ConA)，Sigma公司產(chǎn)品。培養(yǎng)液(IMDM)，美國GIBCO產(chǎn)品。小牛血清，長春生物制品所產(chǎn)品，標準CRH，ACTH，美國Sigma公司產(chǎn)品。Na125I，中國原子能研究所。3H皮質酮，上海核技術開發(fā)公司。標準皮質酮，荷蘭Orgnon公司產(chǎn)品。

8、三、方法：1.ConA誘導上清制備及血漿收集：取已用人紅細胞免疫5 d的小鼠脾臟制備淋巴細胞懸液，用ConA刺激(5 g/mL)40 h收集上清，并給小鼠腹腔注射，每只0.5 mL(實驗組)：對照組為無ConA上清，加上ConA 5 g/mL,同時設生理鹽水(NS)對照，劑量與途徑同實驗組：每組5只，取注射后0.5，1，2，4，6 h的小鼠血漿0.1 mL備用。2.ConA誘導上清體外作用：取1：40稀釋ConA誘導上清分別與小鼠下丘腦，垂體，腎上腺組織共同培養(yǎng)，同時用培養(yǎng)液(IMDM)做陰性對照，不同組織分別設rIL-6,CRH,ACTH做陽性對照。觀察培養(yǎng)后2，4，6，8，16，20 h培

9、養(yǎng)上清中CRH，ACTH，CORT分泌含量。3.CRH，ACTH，CORT檢測CRH含量放射免疫測定法，參考3；ACTH含量放射免疫測定法，參考4；CORT含量檢測，利用大鼠血漿競爭性蛋白結合分析法測定小鼠血漿皮質酮5。結果一、體內ConA誘導上清對CRH，ACTH和CORT產(chǎn)生的影響：結果表明，小鼠腹腔注射上清后，實驗組血漿CRH，ACTH，CORT在1 h明顯高于對照組，2 h達峰值，4 h低于2 h,峰值處與對照組相比差異有顯著性(P0.05)(1)。     Fig 1Effect of intraperitoneal injection by

10、ConA induced supernatants on CRH,ACTH and CORT level1體內ConA誘導上清對CRH，ACTH和CORT產(chǎn)生影響二、體外ConA誘導上清對CRH，ACTH和CORT分泌的影響：1.ConA誘導上清對下丘腦CRH分泌的影響結果表明，ConA誘導上清在體外可直接刺激下丘腦組織分泌CRH，6 h時CRH的分泌量明顯大于對照組，與陰性對照相比差異有顯著(P0.05)(表1)。表1ConA誘導上清對下丘腦分泌CRH的影響ControlIL-6(2000 U/L)Supernatants(1:40)CRH(6 h)75±25402±57

11、*425±308 (16 h)80±25506±50*430±40*     *P0.05， vs control 2.ConA誘導上清對垂體ACTH分泌的影響ConA誘導上清刺激垂體組織ACTH分泌量在16 h時明顯高于對照組，與陰性對照組相比差異有顯著（P0.05）(表2)。表2ConA誘導上清對垂體分泌ACTH的影響ControlCRH(5 g/L)IL-6(2000U/L)Supernatants(1:40)ACTH(6 h)87±20284±20*85±1192±7

12、(16 h)90±24320±30*304±30*278±50*     *P0.05， vs control 3.ConA誘導上清對腎上腺CORT分泌的影響腎上腺組織CORT分泌量及時程與ACTH平行。與陰性對照相比差異均有顯著（P0.05）(表3)。表3ConA誘導上清對腎上腺分泌CORT的影響ControlACTH(5 g/L)IL-6 (2000U/L)Supernatants(1:40) CORT(6 h)0.5±0.031.6±0.3*0.6±0.10.7±0.1

13、(16 h)0.6±0.042.0±0.25*2.9±0.182.4±0.3*     *P0.05， vs control 討論神經(jīng)內分泌系統(tǒng)在感受精神和軀體的刺激下，可導致HPAA的激活，而免疫系統(tǒng)可感受腫瘤，病毒，毒素等抗原刺激，在免疫應答過程中同樣存在HPAA的激活6，由于該兩大系統(tǒng)是機體的兩大感覺和調節(jié)系統(tǒng)，共同維持機體的生理和病理平衡狀態(tài)，而二者相互作用的介導物質如何，我們在以往實驗基礎上作了初步探討。細胞因子在HPAA激活中起到重要的作用，而ConA誘導上清中含有混合細胞因子，在體內可使CRH，ACT

14、H，CORT于2 h分泌達高峰，本實驗結果證實了細胞因子對HPAA的影響，與文獻報道相符7。另外，體外實驗亦表明，ConA誘導上清可在不同層次上直接刺激下丘腦，垂體和腎上腺組織分泌神經(jīng)肽類和皮質酮，當ConA誘導上清刺激下丘腦組織6 h時CRH分泌量，與rIL-6刺激相比結果相近；而上清液刺激垂體，腎上腺組織16 h時，ACTH，CORT分泌量明顯增加，與所設的CRH，ACTH及rIL-6陽性對照組結果相似，本實驗結果提示細胞因子對不同組織的影響有時程差異。在以前的實驗中我們亦測定過上清液中的細胞因子主要有IL-1，IL-2，IL-66。據(jù)文獻報道IL-1作為免疫細胞產(chǎn)生的可溶性免疫反應產(chǎn)物，可作用下丘腦，具有CRH樣作用，給大鼠腹腔注射IL-1后，下丘腦CRH mRNA增高，IL-1不僅可以作用下丘腦水平，也可以作用垂體，促進ACTH等激素的分泌8。除此之外，IL-6作用HPAA的機理與IL-1相似，而IL-2，TNF可直接作用垂體水平使ACTH分泌，當然上清中免疫產(chǎn)物不僅是細胞因子，也可能包含免疫源性神經(jīng)肽類激素及其他物質，免疫系統(tǒng)除作用HPAA外，體內還存在淋巴腎上腺軸。本實驗中上清液在體內