植物中SOD的分離提取及性質(zhì)研究

1、植物中SOD的分離提取及性質(zhì)研究前言：超氧化物歧化酶(superoxidedismutase簡稱SOD,是一種生物活性蛋白質(zhì)，是人體不可缺少、重要的氧自由清除劑，也是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一的以自由基為底物的酶。SOD廣泛存在于生物界，是防御氧毒害的關(guān)鍵酶。SOD主要有CuZn-、Mn-、Fe-SOD三種類型同工酶，它們共同的生物學(xué)作用是專一地清除生物氧化中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基(對細(xì)胞組分及細(xì)胞器，尤其是生物膜有嚴(yán)重的損傷作用)，具有抗衰老、抗輻射、抗癌等生理作用。在醫(yī)藥中，SOD可用于治療輻射病、自身免疫性疾病、炎癥等；在食品中，可用于保健食品添加劑；在化妝品中，可防止皮膚衰老、抗炎、防曬等作用

2、。植物中大蒜的SOD含量豐富，所以，本實(shí)驗(yàn)研究大蒜中SOD的性質(zhì)，并確定SOD同工酶類型。材料及方法：一、試劑(1) PH7.80.05mol/l磷酸鹽緩沖溶液(2) PH8.250mmol/lTris-HCL(3)0.026mol/L蛋氨酸(Met)磷酸鈉緩沖液：準(zhǔn)確稱取L-蛋氨酸(GHiiNOS,MW=149.210.3879g于100mL小燒杯中，用少量0.1mol/LpH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1mol/LpH7.8的磷酸鈉緩沖液定容至刻度，充分混勻(現(xiàn)用現(xiàn)配)。4c冰箱中保存可用12d。(4)7.5X104mol/LNBT溶液：準(zhǔn)確稱取NBT(COH

3、OC2N10Q,MW=817.70.1533g于100mL/J、燒杯中，用少量蒸儲水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸儲水定容至刻度，充分混勻(現(xiàn)配現(xiàn)用)。4c冰箱中保存可用23d。(5)含1.0區(qū)mol/LEDTA的2X105mol/L核黃素溶液：A液：準(zhǔn)確稱取EDTA(MW=2920.00292g于50mL/J、燒杯中，用少量蒸儲水溶解。B液：準(zhǔn)確稱取核黃素(MW=376.360.0753g于50mL/J、燒杯中，用少量蒸儲水溶解。C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸儲水定容至刻度，此溶液為含0.1mmol/LEDTA的2mmol/L核黃素溶液。4c冰箱中保存可用810d。該

4、溶液應(yīng)避光保存，即用黑紙將裝有該液的棕色瓶包好，置于4c冰箱中保存。當(dāng)測定SOD®活時(shí)，將C液稀釋100倍，即為含1.0區(qū)mol/LEDTA的2x105mol/L核黃素溶液。(6)0.05mol/LpH7.8磷酸鈉緩沖液取0.1 mol/L pH7.8 的磷酸鈉緩沖液50mL移入100mL容量瓶中用蒸儲水定容至刻度，充分混勻。4C冰箱中保存?zhèn)溆谩?7)50mmo鄰苯三氛：稱取鄰苯三氛0.063g,用10mmol/lHCL溶液溶解，定容至10ml,避光保存附錄IPH0.2mol/LNa2HpO40.2mol/LNaH2PO45.88.092.06.012.387.76.218.581.

5、56.426.573.56.637.562.56.849.051.07.061.039.07.272.028.07.481.019.07.687.013.07.891.58.58.094.75.3附錄IITris-HCl緩沖溶液（0.05mol/LTris溶液和XmL0.1mol/LHCl混勻后，加水稀釋到100mL）HPX/mLHPX/mLHPX/mL.1745.7.8734.5.5814.7.2744.7.9732.0.6812.4.3743.4.0829.2.7810.3.4742.0.1826.2.888.5.5740.3.2819.9.987.0.6738.5.3817.2.095.

6、7.7736.6.48.實(shí)驗(yàn)儀器移液管、離心機(jī)5000r/min,量筒、燒杯、研缽、玻璃棒、微量移液器、試管、分光光度計(jì)、1cm比色皿、恒溫水浴梢、電泳梢、電泳儀、培養(yǎng)皿、日光燈、容量瓶、燒杯、冰箱等三.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（1）大蒜粗酶液的提取I.提?。悍Q20g左右的大蒜至于研缽（事先冷藏）中，充分研磨使細(xì)胞破碎，再加入5ml0.05mol/lPH7.8的磷酸鹽緩沖溶液（事先冷藏），繼續(xù)淹沒攪拌15min,使SOD充分溶解到緩沖液中，然后5000r/min,離心10min,棄去沉淀，得提取液。H.取出雜蛋白：提取物加入2倍體積的氯仿-無水乙醇混合溶劑，攪拌15min,5000r/min離心10min,取

7、出雜蛋白，得粗酶液。m.沉淀SOD:將上述粗酶液加入等體積的冷丙酮，攪拌15min,使SOD凝聚，5000r/min離心10min,得SOD沉淀溶于2mlPH7.8的磷酸鹽緩沖溶液中。IV熱擊處理：把蘇抽原液注入編號的式管然后將試管置入恒溫水梢，溫度設(shè)置為60C,熱擊20min。高速離心去雜取上層清液。稀釋5倍，待用。（2） SOD生質(zhì)的研究I.酶活力的測定（NBT法）每個(gè)處理取8個(gè)洗凈干燥好的微燒杯編號，按表1加入各試劑及酶液，反應(yīng)系統(tǒng)總體積為3mL其中48號杯中磷酸鈉緩沖液量和酶液量可根據(jù)試驗(yàn)材料中酶液濃度及酶活力進(jìn)行調(diào)整（如酶液濃度大、活性強(qiáng)時(shí)，酶用量適當(dāng)減少）。各試劑全部加入后，充分混

8、勻，取1號微燒杯置于暗處，作為空白對照，比色時(shí)調(diào)零用。其余7個(gè)微燒杯均放在溫度為25C,光強(qiáng)為4500Lux的光照箱內(nèi)（安裝有3根20W勺日光燈管）照光15min,然后立即遮光終止反應(yīng)。在560nm波長下以1號杯液調(diào)零，測定各杯液光密度并記錄結(jié)果。以2、3號杯液光密度的平均值作為抑制NBT光還原率100%,根據(jù)其他各杯液的光密度分別計(jì)算出不同酶液量的各反應(yīng)系統(tǒng)中抑制NBT光還原的相對百分率。以酶液用量為橫坐標(biāo)，以抑制NBT光還原相對百分率為縱坐標(biāo)，作出二者相關(guān)曲線。找出50%抑制率的酶液量（wL）作為一個(gè)酶活力單位（U）。表1反應(yīng)系統(tǒng)中各試劑及酶液的加入量（mD試劑蛋氨核黃素溶液pH7.8酶磷

9、酸鈉緩沖液酸（Met）磷酸鈉緩液沖液NBT溶液杯號10.91.50.300.320.91.50.300.330.91.50.300.340.851.50.30.050.350.801.50.30.100.360.751.50.30.150.370.701.50.30.200.380.651.50.30.250.3n.影響sod樣液活性的因素不同PH對酶活力的影響：首先取6支試管按下表加入試劑管試/mi、123456SOD酶液0.10.10.10.10.10.1磷酸緩沖液(PH5.86.47.07.67.88.0蒸儲水222222在最適溫度下，水浴10min,取出鄰苯三酚0.20.20.20.2

10、0.20.2吸光值加入鄰苯三酚后迅速混勻，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)4min,加一滴濃HCl停止反應(yīng)，在420nm下測定吸光度。不同溫度對酶活力的影響：首先取5支試管按下表加入試劑管試劑m、1號2號3號4號5號溫度處理0255075100PH7.6磷酸緩沖液33333SO珊液0.10.10.10.10.1蒸儲水22222在各自的溫度卜靜置10min,然后取出鄰苯三酚0.20.20.20.20.2吸光值加入鄰苯三酚后迅速混勻，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)4min,加一滴濃HCl停止反應(yīng)，在420nm下測定吸光度抑制劑的影響：按下表4支試管加入試劑試管試劑m""-12341.5%H2O215口20口25uL30uS

11、O珊液0.10.10.10.1于30c水浴恒溫30min,取出迅速冷卻至25C鄰苯三酚0.20.20.20.2吸光值加入鄰苯三酚后迅速混勻，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)4min,加一滴濃HCl停止反應(yīng)，在420nm下測定吸光度（3） PAGE定位染色法鑒定同工酶的類型I.配膠.分離膠：試劑名稱用里/ml30%ACR/Bis8pH8.850mmol/LTris-HCl510%SDS0.210%過硫酸錢0.1蒸儲水6.7TEMED0.01.濃縮膠貯液100mL溶液中含量pH凝膠的配置E核更系4mg6.7濃縮膠T=3.75%B1MHCl48mlB:D:E:F=1:3:1:3Tris5.9gTEMED0.46mlDAcr

12、10gBis2.5gF蔗糖40g.電極緩沖溶液溶劑名稱100mL溶液中含量PH配置電極緩沖液Tris6g8.3用時(shí)稀釋10倍甘氨酸28.8g蒸儲水1Ln.操作 .制膠按配方在模具中灌注分離膠后，小心的在分離膠的表面加一層水（或水飽和的異丙醇或正丁醇），封住膠面，以促使聚合并使凝膠表面垂直。凝膠在30-40C放置約40分鐘-1小時(shí)后，可以看到一個(gè)界面，表示凝膠聚合。吸水（或水飽和的異丙醇或正丁醇），用濃縮膠緩沖液貯液淋洗凝膠，然后灌注濃縮膠。并插入與模具大小相同，與凝膠厚度相當(dāng)?shù)氖嶙?。為防止氣泡陷入，梳子?yīng)傾斜插入。然后讓模具再靜止放置在30-40C,聚合約40分鐘-1小時(shí)（注意在分離膠和濃縮膠

13、聚合時(shí)，應(yīng)用日光燈照射以促使凝膠凝聚） .加樣按下表加入試劑，充分振蕩，使醇液與變性劑均勻混合。（Mn-SOD的活性受氯仿-乙醇的影響，Cu-Zn-SOD和Fe-SOD這兩種同工酶均對H2O2酶感，Cu-SOD對KCN酶感，Mn-SOD不受CN的影響）編號試劑123粗酶液/ul20202040%蔗糖溶液/ul（含0.1%澳酚藍(lán)）202020氯仿-乙醇/ul-7-30%H2O2/ul-7蒸儲水7-待各管溶液配置好后，分別取10ul加入凝膠的3個(gè)齒上.電泳SOD同工酶的分離采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳。連接電源，調(diào)節(jié)電流至15mA,帶樣品由濃縮膠進(jìn)入分離膠時(shí)，再將電流調(diào)至20-30mA,當(dāng)染料前言距離凝膠邊緣1-2cm時(shí)，關(guān)閉電源，電泳結(jié)束。 .染色SOD活性染色取凝膠板，采用SOD負(fù)染色方法，按以下次序浸泡于培養(yǎng)皿中染色：i. 在2.45Xl0-3mol/l氮藍(lán)四噪（NBT）黑暗下浸泡20分鐘；ii. 在3.6x10-2mol/lPH7.8磷酸鈉緩沖溶液（含2.8x10-2mol/lTEMED2.8x10-5mol/l核黃素）中，在黑暗條件下浸泡15min.iii