手足口病的病原學及實驗室檢測

1、手足口病的病原學及實驗室檢測手足口病的病原學及實驗室檢測陳立陳立中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國家脊灰實驗室國家脊灰實驗室2010-04-212010-04-21手足口病的病原 引起手足口病的病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，包括： *柯薩奇病毒A組（Coxasckievirus A, CVA）的 2、4、5、7、9、10、16 型等 *B組（Coxasckievirus B, CVB)的1、2、3、4、5 型等； *腸道病毒71型（Human Enterovirus 71, EV71）； *埃可病毒（Echovirus, ECHO）等。 其中以EV7

2、1及CVA16型較為常見。 腸道病毒適合在濕、熱的環(huán)境下生存與傳播，75%酒精和酒精和5%來蘇不能將其滅活，對乙醚、去氯膽酸鹽等不敏感來蘇不能將其滅活，對乙醚、去氯膽酸鹽等不敏感；對紫外線和干燥敏感，各種氧化劑(高錳酸鉀、漂白粉等)、甲醛、碘酒以及5630分鐘可以滅活病毒。病毒在4可存活1年，-20可長期保存，在外環(huán)境中可長期存活。流行病學 傳染源 患者和隱性感染者患者和隱性感染者。發(fā)病前數(shù)天，感染者咽部與糞便就可檢出病毒，通常以發(fā)病后一周內(nèi)傳染性最強。 傳播途徑：可經(jīng)胃腸道（糞糞-口途徑口途徑）傳播，也可經(jīng)呼吸道（飛沫、咳嗽、打噴嚏等）傳播，亦可因接觸患者口鼻分泌物、皮膚或粘膜皰疹液及被污染

3、的手及物品等造成傳播 流行：以5歲及以下兒童為主，尤以3歲及以下兒童發(fā)病率最高。一般5-7月為發(fā)病高峰 實驗室診斷臨床診斷病例符合下列條件之一者，即可診斷為實驗室確診病例 自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子、腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴結(jié)等組織標本中分離到人腸道病毒分離到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據(jù)表明可以導(dǎo)致手足口病的人腸道病毒）。 自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子等標本中檢檢測到測到CVA16 或或EV71特異性核酸，特異性核酸，或從腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴結(jié)等組織標本等標本中檢測到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據(jù)表明可以導(dǎo)

4、致手足口病的人腸道病毒）的特異性核酸。 實驗室診斷 血清標本人腸道病毒型特異性中和抗體滴度1 256，或急性期與恢復(fù)期血清腸道病毒特異性中和抗體有4倍或4倍以上的升高 病原學監(jiān)測要求 各省區(qū)市衛(wèi)生行政部門要組織醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)開展病原學監(jiān)測，了解病原動態(tài)分布變化。所有重癥和死亡病例均需所有重癥和死亡病例均需采樣。此外，以縣（區(qū)）為單位，每月最少需采集采樣。此外，以縣（區(qū)）為單位，每月最少需采集5例首例首次就診的普通病例標本；當月縣（區(qū)）病例總數(shù)少于次就診的普通病例標本；當月縣（區(qū)）病例總數(shù)少于5例例時，全部采樣。時，全部采樣。 以?。▍^(qū)、市）為單位,在手足口病流行年份中每年至少采集20對EV71

5、和10對CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清,以闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動態(tài)變化，評價血清學抗體試劑盒的敏感性和特異性。 以?。▍^(qū)、市）為單位，每月至少從手足口病病例中分以?。▍^(qū)、市）為單位，每月至少從手足口病病例中分離離10株毒株并做血清型別鑒定，鑒定完成后并將毒株及株毒株并做血清型別鑒定，鑒定完成后并將毒株及鑒定結(jié)果于鑒定結(jié)果于5個工作日內(nèi)報送至中國疾病預(yù)防控制中心。個工作日內(nèi)報送至中國疾病預(yù)防控制中心。具備測序條件的省份，可開展具備測序條件的省份，可開展VP1基因序列測定和分析基因序列測定和分析，進行基因定型，序列測定完成后將序列結(jié)果于5個工作日內(nèi)報送至

6、中國疾病預(yù)防控制中心；不具備測序條件者，將毒株送至中國疾病預(yù)防控制中心進行序列測定，中國疾病預(yù)防控制中心要于28個工作日內(nèi)反饋基因定型結(jié)果。 31個省級實驗室個省級實驗室1國家實驗室國家實驗室331 個地級實驗室個地級實驗室l 腸道病毒分離物基因分型腸道病毒分離物基因分型,血清流行病學檢測血清流行病學檢測,診診斷方法建立斷方法建立l 質(zhì)量控制質(zhì)量控制 l 對省級實驗室提供技術(shù)支持對省級實驗室提供技術(shù)支持 l腸道病毒分離和鑒定腸道病毒分離和鑒定 (PCR, ICA, PCR-RFLP, real time PCR）l 對地級實驗室的質(zhì)量控制對地級實驗室的質(zhì)量控制l對地級實驗室提供技術(shù)支持對地級實

7、驗室提供技術(shù)支持l RT-PCR, Real time PCR 采集標本采集標本 標本采集和檢測 （1）所有重癥和死亡病例均要采集標本所有重癥和死亡病例均要采集標本，可以采集咽拭子、糞便或肛拭子、皰疹液、腦脊液、血清等，死亡病例還可采集腦、肺、腸淋巴結(jié)等組織標本。聚集性病例至少要采集2例病例標本開展病原學檢測。（2）醫(yī)療機構(gòu)負責樣本采集醫(yī)療機構(gòu)負責樣本采集，疾病預(yù)防控制機構(gòu)應(yīng)指導(dǎo)醫(yī)療機構(gòu)進行相關(guān)生物學標本的采集。（3）疾病預(yù)防控制機構(gòu)根據(jù)本地的技術(shù)能力，對采集的標本開展核酸檢測、病毒分離；不具備技術(shù)條件時，及時送上級機構(gòu)進行檢測。標本的選擇標本的選擇 糞便標本、肛拭子（3日內(nèi),5-8g） 咽拭

8、子標本(3日內(nèi),維持液) 血清標本（發(fā)病0-3天，14-30天） 皰疹液（多個皰疹作為一個標本） 腦脊液標本(出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)） 采集標本的種類、保存和運輸 （一）糞便標本。 采集病人發(fā)病3日內(nèi)日內(nèi)的糞便標本，用于病原檢測。糞便標本采集量量5-8g/份份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽，4暫暫存存12小時內(nèi)小時內(nèi)送達實驗室，-20以下低溫冷以下低溫冷凍保藏，凍保藏，需長期保存的標本存于-70冰箱。 采集標本的種類、保存和運輸 （二）咽拭子標本。 采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，適度用適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及

9、舌力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；部；迅速將棉簽放入裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。4暫存并在12小時內(nèi)送達實驗室，-20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于-70冰箱。 采集標本的種類、保存和運輸 （三）血清標本。 各省（區(qū)、市）在手足口病流行年份中均應(yīng)采集EV71 和CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清。采集急性期（發(fā)病0-7d）和恢復(fù)期（發(fā)病14-30d）雙份配對血清用于闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的

10、動態(tài)變化，評價血清學抗體試劑盒的敏感性和特異性。靜脈采集3-5ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。將血清置于-20以下冰箱中冷凍保存。 （四）皰疹液 在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液中分離到病毒即可確診該病毒為病因，可同時采集多采集多個皰疹作為一份標本個皰疹作為一份標本。先用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，采樣管外表貼上帶有唯一識

11、別號碼的標簽。所采集標本4暫存立即（12h內(nèi)）送達實驗室，20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于70冰箱。 （五）肛拭子標本 采集病人發(fā)病3日內(nèi)的肛拭子標本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數(shù)下，拔出后,迅速將棉簽放入裝有35ml保存液（含5%牛血清細胞維持液）的15ml外螺旋的采樣管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，以防干燥。 （六）尸檢標本 采集腦、肺和腸淋巴結(jié)等重要組織標本，每一采集部位分別使用單獨的消毒器械。每種組織應(yīng)多部位取材，每部位應(yīng)取2-3份約5-10g的組織，淋巴結(jié)2個，分別置于15ml

12、-50ml無菌的有外螺旋蓋的凍存管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。 （七）腦脊液標本。 出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，可采集腦脊液標本，進行病毒分離或核酸檢測。采集時間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為 1.0-2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于70冰箱。但EV71感染神經(jīng)系統(tǒng)時，很難在腦脊液中檢測到EV71病原。 標本運輸和貯存注意事項 臨床標本在運輸和貯存過程中要避免反復(fù)凍融。 標本采集后要全程冷藏或冷凍保存和運輸，12小時內(nèi)送達實驗室。 依照人間傳染的病原微生物名錄，腸道病毒或潛在含有腸道病毒

13、的標本按B類包裝，置于冷藏保存盒內(nèi)運輸，盡量縮短運輸時間。 可采用陸路或航空等多種運輸方式，但在運輸過程中應(yīng)采取保護措施，避免強烈震動、重力擠壓等現(xiàn)象。 在送到省、地、市級CDC實驗室時，包裝盒內(nèi)應(yīng)帶冰且包裝完整。在上送標本的同時，需附帶相關(guān)的手足口病病例臨床標本采樣登記表。 實驗室檢測 病毒分離 測定人雙份血清標本的中和抗體滴度 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） Real-time RT-PCR （rRT-PCR） 病毒分離 病毒分離細胞系： RD細胞，來源于人橫紋肌肉瘤細胞。 HEp-2細胞，來源于人喉癌上皮細 糞便標本和肛拭子的處理 ：按“手足口病標本采集及檢測技術(shù)方案” 皰疹液標本

14、通常直接用于RNA提取或病毒分離。 腦脊液標本通常直接用于病毒分離 咽拭子標本的處理：按“手足口病標本采集及檢測技術(shù)方案”咽拭子處理（病毒分離用） 咽拭子要在標本運輸（保存）液中充分攪動（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用于病毒分離時，需要凍融一次（防止多次凍融），使細胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4條件下，10000 rpm離心20min，用上清接種到細胞上或直接提取RNA。如果發(fā)現(xiàn)有細菌污染，須用濾器過濾除菌。 病毒分離結(jié)果解釋 RD細胞支持HFMD的主要病原體CVA16和EV71等多種腸道病毒的復(fù)制，CVA16和和EV71均能在均能在RD細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)中引起特殊的

15、腸道病毒致細胞病變效應(yīng)（中引起特殊的腸道病毒致細胞病變效應(yīng)（CPE），），表現(xiàn)為細胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加，最后細胞自管壁脫落。 但相同滴度的CVA16和EV71在RD細胞中生長的速度不同，EV71的生長速度要快于的生長速度要快于CVA16，表現(xiàn)為EV71感染RD細胞后出現(xiàn)CPE的時間比CVA16早，EV71接種細胞后出現(xiàn)CPE很快，但CVA16一般要經(jīng)過2次以上傳代才出現(xiàn)明顯的CPE。 若在使用RD細胞分離的同時再增加HEp-2細胞，可提高腸道病毒的分離率（分離出其他可能致HFMD的病原體，如一些柯薩奇B組病毒）。但CVA16和EV71在HEp-2細胞中均不繁殖。 測定人雙份血清標本的中

16、和抗體滴度 比較患者急性期血清與恢復(fù)期血清中和抗體滴度，可作為腸道病毒感染的血清學診斷方法，最常用的是中和實驗 通常用急性期血清與恢復(fù)期血清滴度進行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。 腸道病毒隱性感染也很常見，所以在評估檢測結(jié)果時就要小心一些中和試驗結(jié)果判定 如果恢復(fù)期血清較急性期血清EV71或CVA16中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高即可確診； 如果恢復(fù)期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高可證實該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關(guān)實驗證實； 如果單份血清中和抗體滴度大于1:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1:128判定為可疑陽性。 逆轉(zhuǎn)錄-聚

17、合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的標本處理 糞便標本：采用氯仿進行處理后提取核酸。 肛拭子/咽拭子標本：咽拭子要在標本保存液中充分攪動，然后在4條件下，10000 rpm離心20min 。 皰疹液和腦脊液：直接用于RNA提取逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） RT-PCR實驗結(jié)果解釋表 待檢標本RT-PCR結(jié)果 鑒定結(jié)果 HEV(-), EV71(-), CVA16(-) 非腸道病毒（NEV） HEV(+), EV71(-), CVA16(-) 非EV71、CVA16的其它腸道病毒 HEV(+), EV71(+), CVA16(-) EV71 HEV(+), EV71(-), CVA16(+)CV

18、A16RT-PCR注意事項按下列好的實驗室操作規(guī)程操作，可以減少交叉污染的發(fā)生 PCR之前的準備工作和之后的處理分別在不同的房間內(nèi)操作； PCR之前的準備工作和之后的處理分別使用兩套移液器以及其他設(shè)備； 將試劑分裝保存，盡量減少重復(fù)使用的頻率； 準備和分裝試劑應(yīng)該在無PCR擴增產(chǎn)物的區(qū)域內(nèi)進行； 準備寡聚核苷酸引物應(yīng)該在無PCR擴增產(chǎn)物的環(huán)境中進行； 只使用能阻止氣溶膠產(chǎn)生的吸尖； 戴手套（無滑石粉），并經(jīng)常更換；RT-PCR注意事項 打開各種管子要小心，避免氣溶膠的產(chǎn)生。 減少每次處理樣品的數(shù)量； 將除了核酸之外的其他試劑先加到反應(yīng)管中，最后再加入核酸； 加入一個核酸后要蓋上蓋子，然后再加入

19、其它核酸； 使用陽性對照；選取一個穩(wěn)定的每次都能擴增出結(jié)果的樣品作陽性對照； 使用一個已知性質(zhì)的樣品作陰性對照； 每次實驗都要用試劑混合物作為空白對照。它包含除了標本RNA以外的PCR反應(yīng)所需的所有其它成分。Real-time RT-PCR （rRT-PCR）與普通PCR模式相比,實時熒光PCR具備幾個方面的優(yōu)勢優(yōu)勢: 封閉反應(yīng)，污染機會少。 無需PCR后處理（雜交，電泳，拍照）。操作簡單，高度自動化。 特異性強，靈敏度高。 用途廣泛，既能定量又能定性。 采用對數(shù)期分析，摒棄終點數(shù)據(jù)，定量準確。儀器在線式實時檢測，結(jié)果直觀，避免人為判斷。 可實現(xiàn)一管雙檢或多檢。 操作安全，縮短時間，提高效率。熒光定量PCR是通過對PCR 擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。rRT-PCR注意事項 模板量可根據(jù)樣