肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)技能決賽實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)書——珍稀藥用植物金線蓮質(zhì)量測(cè)定的初步研究

1、肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)技能決賽實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)書參賽作品題目珍稀藥用植物金線蓮質(zhì)量測(cè)定的初步研究參 賽 者 資 料姓名性別班級(jí)長短號(hào)XXX男XXX女XXX女XXX女 珍稀藥用植物金線蓮質(zhì)量測(cè)定的初步研究摘要：以金線蓮為試驗(yàn)材料, 通過測(cè)重法測(cè)定生物量與含水量、蒽酮比色法測(cè)定可溶性總糖的含量，對(duì)評(píng)價(jià)其質(zhì)量做初步探討，同時(shí)為金線蓮進(jìn)一步研究與開發(fā)提供一定參考意義。關(guān)鍵詞：金線蓮 生物量 含水量 可溶性糖 測(cè)定金線蓮Anoectochilus roxburghii(wall.) Lindl為蘭科開唇蘭屬（Anoectochilus）多年生草本植物，又名花葉開唇蘭、金線蘭，是我國傳統(tǒng)珍貴藥材，素有“藥王

2、”、“金草”、“神藥”和“烏人參”等美稱1。據(jù)研究報(bào)道，金線蓮中氨基酸組成、成分含量及抗衰老活性微量元素的含量均高于國產(chǎn)和野生西洋參2，且富含有多糖、強(qiáng)心苷類、有機(jī)酸、甾體化合物、黃酮類化合物、生物堿等3-5等多種成分，廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、高血壓、糖尿病、腎病和尿血等癥狀的治療，以及病后體虛恢復(fù)等方面，被稱為“藥中之王”3,4。此外，金線蓮還是的一種室內(nèi)觀葉珍品。目前，金線蓮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未被制定，較統(tǒng)一的意見為市售金線蓮鮮品、干品多糖均不低于15%（以干基計(jì)），黃酮均不低于0.8%（以干基計(jì)），干品另外要求水分小于12%11?？梢?，金線蓮質(zhì)量（生物量、含水量及糖的含量等）的測(cè)定對(duì)金線蓮進(jìn)一

3、步研究有著重要意義。 圖1 金線連1 實(shí)驗(yàn)儀器儀器名稱儀器規(guī)格儀器數(shù)量電熱鼓風(fēng)干箱CSIOI3型，重慶1 電子天平（千分之一）YP3001N型，上海1 電子分析天平（萬分之一）AE240型，常州1 低速臺(tái)式離心機(jī)TDL-6013型，上海1離心管10 mL1 容量瓶25 mL3稱量紙10封口保鮮袋5數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4型，常州1 可見分光光度計(jì)722S型，上海1 移液器5000 L，1000 L，200 L3 燒杯500 mL，250 mL，100 mL5三角燒瓶100 mL3 量筒100 mL，10 mL1 比色皿1 cm8試管15×15010 玻璃棒1 試管架1 吸水紙1 擦鏡紙

4、12 實(shí)驗(yàn)材料及試劑（試劑濃度等在第一欄注明）名稱（濃度）數(shù)量材料新鮮金線蓮植株（自備）50.0 g試劑80%乙醇（V/V，分析純）100 mL80%濃硫酸（V/V，分析純）100 mL蒽酮試劑（2.0 mg/mL，分析純）100 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（200 g/mL，分析純）100 mL蒸餾水500 mL3 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)金線蓮的質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，通過實(shí)驗(yàn)掌握植物生物量與含水量的測(cè)定方法6，理解并掌握蒽酮法測(cè)定可溶性總糖含量的原理與方法7-8，為進(jìn)一步研究做好鋪墊。4 實(shí)驗(yàn)原理4.1 生物量與含水量的測(cè)定狹義的生物量是用生物的重量表示，可以是鮮重或干重?？紤]到金線蓮作為中藥材即可鮮草出售

5、，又可干草出售，故此，既測(cè)其鮮重，又測(cè)干重。利用水遇熱蒸發(fā)的原理，加熱使植株內(nèi)的水分蒸發(fā)，測(cè)出干重，即又可測(cè)含水量6。4.2 可溶性糖的測(cè)定可溶性糖在濃硫酸作用下，脫水生成糠醛或羥甲基糠醛，糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色衍生物，在620 nm處有最大吸收峰。在一定范圍內(nèi)（150 g/mL），顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于可溶性糖的定量7-8。圖2 反應(yīng)原理圖3 糠醛衍生物溶液的吸收光譜5 實(shí)驗(yàn)方法及步驟5.1試劑的配制蒽酮試劑：稱取0.200 g蒽酮溶于100 mL的硫酸溶液（在30 mL蒸餾水中緩慢加入76 mL比重為1.84的濃硫酸），即得2.0 mg/mL的蒽酮試劑，貯于棕

6、色瓶內(nèi)，冰箱保存，最好當(dāng)日配制使用；標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：稱取已在80烘箱中烘至恒重的葡萄糖100 mg，溶于蒸餾水，并稀釋至500 mL，即為200 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。5.2材料的處理取新鮮金線蓮地上部分，彈去塵土（若表面有污物，需洗凈，再用吸水紙吸去表面水分），分為三組，并分別標(biāo)記為A1、A2、A3，放在稱量紙上迅速稱鮮重（FW）；將上述材料放入信封中，做好標(biāo)記，放入烘箱，在105下殺青30 min，然后將溫度調(diào)到65烘至恒重，時(shí)間在10 h左右；取出烘干的材料，稱量干重（DW），以上結(jié)果記錄于表1；將干樣品研碎、過60目篩，妥善保存，供后續(xù)測(cè)定。5.3 金線蓮生物量與含水量的測(cè)定根據(jù)表1，計(jì)算

7、含水量WC=（FW-DW）/FW×100%。5.4 金線蓮可溶性總糖含量的測(cè)定5.4.1 提取與分離稱取干樣粉末50100 mg（平行3份）于10mL離心管中，分別標(biāo)記為B1、B2、B3；加入5 mL 80%乙醇溶液，搖勻，80水浴40 min，期間不時(shí)攪拌；用少量80%乙醇溶液沖洗玻璃棒，并將溶液冷卻至室溫；4000 g離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中；再向殘?jiān)? mL 80%乙醇溶液，搖勻，重復(fù)在80水浴中提取兩次；合并上清液于25 mL容量瓶中，并用80%乙醇溶液定容至刻度，即為待測(cè)液，冰箱保存。5.4.2 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取干凈試管6支，按表2進(jìn)行操作，并將數(shù)據(jù)記

8、錄在其中。以吸光度A620 nm為縱坐標(biāo)，葡萄糖溶液的糖含量C（g）為橫坐標(biāo)，使用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，計(jì)算相關(guān)系數(shù)R（R=A620 nm/C）。5.4.3 樣品測(cè)定吸取待測(cè)液0.5 mL于干凈試管，加入80%乙醇溶液0.5 mL；浸于冰水浴中冷卻，再加入4 mL蒽酮試劑；沸水浴中加熱10 min，取出后用自來水冷卻至室溫，在620 nm處比色，記錄吸光度于表3，根據(jù)公式（1）計(jì)算結(jié)果。若測(cè)得結(jié)果不在范圍內(nèi)可適當(dāng)稀釋，約1050倍。 （1）式中：糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）；C：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的糖含量（g）；V1：樣品提取液的總體積（mL）；n：待測(cè)液的稀釋倍數(shù)；m：樣品的質(zhì)量（mg）；V2

9、：測(cè)定時(shí)取樣的體積（mL）；103：換算系數(shù)，1 mg=103 g。6 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)果6.1 金線蓮生物量及含水量的測(cè)定結(jié)果表1 金線蓮生物量及含水量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)編號(hào)鮮重（FW/g）干重（DW/g）含水量（WC/%）A114.301.1891.7591.97A29.500.7991.68A314.601.1092.476.2 金線蓮樣品糖含量的測(cè)定結(jié)果6.2.1 蒽酮比色法定糖標(biāo)準(zhǔn)曲線表2 蒽酮比色法定糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試管編號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液/mL00.10.20.30.40.50.680%乙醇溶液/mL1.00.90.80.70.60.50.4置冰水浴中5 min，沿管壁緩慢加入蒽

10、酮試劑蒽酮試劑/mL4.04.04.04.04.04.04.0充分混勻，沸水浴中準(zhǔn)確加熱10 min，取出后用自來水冷卻至室溫，在620nm處比色葡萄糖溶液的糖含量/g020406080100120A620 nm00.0720.1160.1470.1730.2440.262注：葡萄糖溶液的糖含量是指試管中溶液葡萄糖的質(zhì)量，用C表示，單位為g。圖4 蒽酮比色法定糖標(biāo)準(zhǔn)曲線金線蓮樣品糖含量的測(cè)定結(jié)果表3 金線蓮樣品糖含量的測(cè)定樣品編號(hào)m（mg）V1（mL）nV2（mL）A620 nmC（g）（%）B174.025100.5B288.025100.5B387.825100.57 分析討論首先用測(cè)重法

11、測(cè)定金線蓮樣品的生物量（干鮮重比為8.03%）與含水量（91.97%），干樣品粉末使用80% 乙醇提取其中的可溶性糖成分?？扇苄蕴鞘窃S多中草藥的有效成分之一, 具有抗癌、抗炎、抗病毒、提高免疫能力等作用。而可溶性糖多無法直接測(cè)定，本文利用多糖在硫酸的作用下，水解成單糖分子，并迅速脫水生成糖醛衍生物, 然后與蒽酮生成深綠色化合物,以比色法測(cè)定其含量，結(jié)果表明，此方法簡便，金線蓮可溶性糖含量為 %。此方法適合中草藥中多糖含量的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中，也存在一些問題，如：（1）預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)的葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，曾選用0.5mL蒸餾水代替0.5mL 80%乙醇溶液，加入蒽酮試劑出現(xiàn)乳白色渾濁，經(jīng)過查找文獻(xiàn)資料

12、與實(shí)驗(yàn)，最終確定使用80%乙醇溶液；（2）在實(shí)驗(yàn)過程中, 發(fā)現(xiàn)影響顯色的重要因素是水浴放置時(shí)間, 一般置沸水浴中10 min后立即用冷水冷卻至室溫, 能得到較好的測(cè)定結(jié)果；（3）由于時(shí)間等條件限制，未能消除其他物質(zhì)以及實(shí)驗(yàn)誤差對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，在實(shí)際質(zhì)量測(cè)定工作中，要消除其他物質(zhì)的影響，還需增加穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、回收率的測(cè)定等。綜上所述，該批金線蓮樣品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合要求。8 注意事項(xiàng)8.1 控制變量試驗(yàn)中注意控制變量，使得每次比較都具有科學(xué)性與合理性。8.2 顯色反應(yīng)蒽酮試劑與糖反應(yīng)的呈色程度隨時(shí)間發(fā)生變化，故樣品需盡快比色；且該顯色反應(yīng)非常靈敏，所用器皿需潔凈。8.3 實(shí)驗(yàn)安全使用濃硫酸時(shí)，緩慢加入，注意安全，如不慎濺到皮膚，立即用自來水清洗。參 考 文 獻(xiàn)1 全國中藥草匯編編寫組. 1992，全國中藥草匯編M. 北京:人民衛(wèi)生出版社：165.2 唐健, 鄧元榮, 桌儀榮. 金線蓮的藥理活性研究進(jìn)展J. 海峽藥學(xué), 2008, (12):52-55.3 龔寧，鄧琳瓊，唐秀蘭等. 花葉開唇蘭清除活性氧作用研究J. 中藥藥理和臨床，2006，22(2):39-41.4 鐘岑生. 金線蓮的藥用價(jià)值與開發(fā)J.