腫瘤干細(xì)胞的分選技術(shù)

1、腫瘤干細(xì)胞的分選技術(shù)引言腫瘤干細(xì)胞是在最近的十年間成為癌癥研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域的，然而它并非是一個(gè)全新的概念，最早關(guān)于腫瘤干細(xì)胞的假設(shè)可以溯源至百年以前。雖然最近數(shù)十年間也有對(duì)腫瘤中存在“干細(xì)胞”的推斷，但長(zhǎng)時(shí)間地停留在沒(méi)有充分實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持的假說(shuō)階段。直到上世紀(jì)九十年代，Dick和他的同事們分離純化出CD34+CD38-表型的白血病腫瘤細(xì)胞，才首次驗(yàn)證了腫瘤干細(xì)胞的理論。腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)是腫瘤和干細(xì)胞領(lǐng)域多年研究積累、匯集的成果，而其中有一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的貢獻(xiàn)非常關(guān)鍵，也即本章所討論的細(xì)胞分選技術(shù)。眾所周知，腫瘤并非是一群混沌的細(xì)胞，而更像是一個(gè)畸形的器官，構(gòu)成腫瘤的細(xì)胞群體非常地多樣和復(fù)雜，也即腫瘤異

2、質(zhì)性理論所表述的內(nèi)容。然而，要將腫瘤的各個(gè)細(xì)胞群體分離出來(lái)研究其特性，缺少細(xì)胞分選技術(shù)的介入恐怕是非常困難的。事實(shí)上，腫瘤干細(xì)胞的研究更好地詮釋了腫瘤的異質(zhì)性，并且也可能是腫瘤領(lǐng)域?qū)⒓?xì)胞分選技術(shù)運(yùn)用得淋漓盡致的典范。細(xì)胞種類不同，分選技術(shù)的內(nèi)容也是非常豐富，因?yàn)榧?xì)胞分選就是基于細(xì)胞的各種特性。目前分選技術(shù)的運(yùn)用大致可以歸入這樣幾類：一、針對(duì)細(xì)胞的物理特性，比如細(xì)胞的大小，密度，粘附性，折光性，攜帶電荷等，包括密度梯度離心，熒光激活細(xì)胞分選和細(xì)胞電泳等方法；二、針對(duì)細(xì)胞的表面抗原表型，通?？梢圆捎脽晒饧せ罴?xì)胞分選、免疫吸附和免疫磁珠分離法；三、針對(duì)細(xì)胞的功能特性，如染料外排，鈣離子濃度，pH，熒

3、光蛋白表達(dá)，目前最常用的是依靠熒光激活細(xì)胞分選。本章內(nèi)容將簡(jiǎn)介常規(guī)細(xì)胞分選的工作流程，重點(diǎn)介紹目前應(yīng)用較多的分選策略。一/ 腫瘤樣本取材和細(xì)胞分離無(wú)論采用何種分選方式，分選之前的工作內(nèi)容是相似的。流程的第一步是從獲得腫瘤標(biāo)本。絕大部分研究的樣本都采集自外科手術(shù)，因此應(yīng)獲得倫理機(jī)構(gòu)的許可和患者的知情同意文件，并記錄患者的詳細(xì)資料和核實(shí)最終的病理診斷結(jié)果。一般認(rèn)為，從手術(shù)中獲得的樣本到細(xì)胞分選的時(shí)間越短越好，故取材時(shí)必須與手術(shù)醫(yī)生配合良好，取得標(biāo)本后應(yīng)盡早置于低溫(4°C或冰上)。通常在肉眼下，即可觀察到腫瘤各部分組織具有一定異質(zhì)性，取材應(yīng)獲取代表性的瘤塊，并盡量避開(kāi)壞死的區(qū)域。樣本可浸

4、入RMPI1640和M199等培養(yǎng)基或Hanks平衡鹽溶液，可參考所研究腫瘤的特性選取。一般情況下，低Ca2+濃度可減少細(xì)胞損傷和細(xì)胞間粘附，有利于下一步細(xì)胞分離；另外，HEPES緩沖體系多用來(lái)平衡體外環(huán)境的pH，抗生素的加入可以抵抗可能的污染。這樣取得的樣本一般可直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室行下一步分選，亦有研究者采取先異種移植到免疫缺陷的NOD/SCID小鼠然后再行細(xì)胞分選的策略。細(xì)胞分選的必要條件是制備單細(xì)胞懸液并盡可能地保留細(xì)胞的活力和功能狀態(tài)，這一點(diǎn)對(duì)血液腫瘤不是問(wèn)題，而對(duì)實(shí)體腫瘤而言可能是主要障礙。不同腫瘤采用的分離手段都不盡相同，但一般采用機(jī)械分離加酶消化的方法。瘤塊可以置于低溫Hanks液中

5、充分洗滌并用鋒利的器械切割成24 mm的小塊，然后將小瘤塊至于37°C含有消化酶的培養(yǎng)基中并適當(dāng)?shù)恼袷?，同時(shí)保持穩(wěn)定O2、CO2和pH。酶的使用至關(guān)重要，不恰當(dāng)?shù)厥褂每赡軐?dǎo)致細(xì)胞無(wú)法分離或是消化過(guò)度，而后者的結(jié)果可能是細(xì)胞表面蛋白的丟失和細(xì)胞損傷。一般常用酶的消化能力由強(qiáng)到弱的排序依次是胰蛋白酶(Trypsin)，木瓜蛋白酶(Papain)，彈性蛋白酶(Elastase)，透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase)，膠原酶(Collagenase)II、I、IV、III，離散酶(Dispase)和脫氧核糖核酸酶(DNase)I。各種消化酶，各有優(yōu)缺點(diǎn)，一般來(lái)說(shuō)，效果較強(qiáng)的酶可能造成細(xì)胞

6、損傷，效果較弱的酶對(duì)細(xì)胞損傷相對(duì)較小。粗制的酶效果較強(qiáng)，選擇性差，精制的酶效果較弱，特異性好，毒性小。從近年的文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看，組織分離中胰蛋白酶使用較少，而膠原酶使用較多，尤其對(duì)細(xì)胞表面受體損傷較小的IV和III型膠原酶。另外膠原酶可以聯(lián)合其他的酶使用以發(fā)揮最好的效果，如透明質(zhì)酸酶可以增加結(jié)締組織細(xì)胞間基質(zhì)的解離，離散酶可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的解離等。膠原酶的作用時(shí)間可以很長(zhǎng)，可大于48小時(shí)，但近來(lái)文獻(xiàn)多報(bào)道酶的作用時(shí)間在2-4小時(shí)，以腫瘤類型不同而有所差異，在肝癌組織中(IV型膠原酶100IU/ml)甚至有15分鐘見(jiàn)效的報(bào)道。酶作用之后的組織消化液一般需要通過(guò)40-100 m的篩網(wǎng)以除去未消化完全

7、的團(tuán)塊，沉淀細(xì)胞，除去上清，使細(xì)胞重懸于合適的培養(yǎng)基或平衡鹽溶液。操作過(guò)程要注意動(dòng)作輕柔，沉淀細(xì)胞可以通過(guò)重力沉降或低速離心的方法，但需注意高速離心可能造成脆弱的細(xì)胞破裂。收集到的細(xì)胞可以做計(jì)數(shù)和做活性染色，可以得到細(xì)胞的得率和存活率，這通常是必要的，有助于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的質(zhì)量控制。事實(shí)上，分離得到的細(xì)胞的得率和存活率通常是不可兼得，只能追求一個(gè)合適的平衡點(diǎn)。對(duì)于腫瘤干細(xì)胞的研究而言，對(duì)細(xì)胞的活力的要求是相當(dāng)苛刻的，因?yàn)檫@將直接影響成瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。二/ 熒光激活細(xì)胞分選流式細(xì)胞儀的基本原理流式細(xì)胞術(shù) (flow cytometry)是一種檢測(cè)流體狀態(tài)下的細(xì)胞或顆粒特征的技術(shù)，它可以在細(xì)胞流通過(guò)光

8、電檢測(cè)裝置時(shí)實(shí)時(shí)地分析細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)，包括細(xì)胞大小，顆粒度，熒光染色，免疫熒光標(biāo)記等。熒光激活細(xì)胞分選 (Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)則是特殊的流式細(xì)胞術(shù)，需要在專門(mén)的流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞分選的操作，流式細(xì)胞儀種類很多，圖1是其中一種可用于細(xì)胞分選、分析的大型流式細(xì)胞儀。圖1 Beckman Coulter 公司Epics Altra型流式細(xì)胞分選分析系統(tǒng)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)是融合了光學(xué)，物理學(xué)，電子學(xué)和生物學(xué)多個(gè)學(xué)科知識(shí)的產(chǎn)物，其研發(fā)歷經(jīng)二十余年，到目前還在不斷地改進(jìn)以適應(yīng)生物醫(yī)學(xué)研究的需要。流式細(xì)胞分選儀基本可以分為三大系統(tǒng)，即流體學(xué)系統(tǒng)

9、 (fluidics)、光學(xué)系統(tǒng) (optics)和電子系統(tǒng) (electronics)，其產(chǎn)生也是由這三部分的技術(shù)并行地發(fā)展而造就的。讀者可以通過(guò)回顧流式細(xì)胞分選儀的發(fā)展歷程來(lái)了解其系統(tǒng)的構(gòu)造和細(xì)胞分選的原理。流體系統(tǒng)的基本作用是帶動(dòng)單個(gè)細(xì)胞快速地通過(guò)檢測(cè)器并把相應(yīng)的細(xì)胞從中分離出來(lái)，該系統(tǒng)的發(fā)明和目前仍廣為使用的Coulter血球計(jì)數(shù)儀密切相關(guān)。Coulter機(jī)器體現(xiàn)了現(xiàn)代流式細(xì)胞儀的幾個(gè)基本思想：把細(xì)胞的特征(通過(guò)Coulter裂孔測(cè)得的電阻代表細(xì)胞體積)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，快速并逐一檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞，并自動(dòng)化地處理大量的細(xì)胞信號(hào)。有趣的是，當(dāng)時(shí)Coulter機(jī)器上檢測(cè)到血液中存在兩群體積大小不同

10、的紅細(xì)胞，F(xiàn)ulwyler等為了研究紅細(xì)胞是否大小均一的問(wèn)題時(shí)想到了首次采用了分選紅細(xì)胞的辦法，并造就了第一臺(tái)流式細(xì)胞儀的原型(同時(shí)證明了紅細(xì)胞雙峰現(xiàn)象是偽象)。他在Coulter計(jì)數(shù)儀上引入了噴墨打印機(jī)的噴墨技術(shù)，其基本原理仍然沿用至今：高頻振蕩的噴嘴，將流動(dòng)室流出的水柱斷裂成均勻的水滴(drop)，根據(jù)Coulter 機(jī)器所檢測(cè)的細(xì)胞大小的信號(hào)來(lái)使包含特定細(xì)胞的水滴帶電，再利用偏轉(zhuǎn)板形成的高壓電場(chǎng)使其下落方向發(fā)生偏轉(zhuǎn)，并落入相應(yīng)的收集管中。另外，Crosland-Taylor利用層流原理，讓微小的細(xì)胞流束包裹在大量鞘液流中，從而使其“聚焦”于整個(gè)流體的中央，使細(xì)胞快速、單個(gè)地流動(dòng)，解決了多

11、個(gè)細(xì)胞同時(shí)通過(guò)檢測(cè)口帶來(lái)錯(cuò)誤信號(hào)的問(wèn)題。至此，這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)奠定了流體細(xì)胞分選的基石。然而，Coulter機(jī)器并沒(méi)有真正的發(fā)展成為實(shí)用的流式細(xì)胞分選儀，可能的原因也許是它僅僅只能獲得細(xì)胞體積的信號(hào)，應(yīng)用的范圍受到了限制。在生物醫(yī)學(xué)研究中，用顯微鏡來(lái)仔細(xì)觀察細(xì)胞的形態(tài)特征并獲得非常精細(xì)的圖像顯然是最經(jīng)典的方法，但是要用這種方式來(lái)分析記錄大量的細(xì)胞的特征則耗時(shí)費(fèi)力。事實(shí)上，早在Coulter機(jī)器之前，很多學(xué)者就在考慮用一種“流式系統(tǒng)”來(lái)彌補(bǔ)光學(xué)顯微鏡動(dòng)態(tài)能力上的不足，而且隨著熒光染料和單克隆抗體研究的發(fā)展，這種需求終于促成了現(xiàn)代流式細(xì)胞儀的誕生。上世紀(jì)六十年代以后，洛斯阿拉莫斯實(shí)驗(yàn)室的Marvin V

12、an Dilla和斯坦福大學(xué)的Herzenberg 教授各自引入了光學(xué)及電子系統(tǒng)的設(shè)計(jì)發(fā)明了用熒光來(lái)檢測(cè)分選細(xì)胞的方法，熒光激活細(xì)胞分選這個(gè)術(shù)語(yǔ)即是由Herzenberg 教授創(chuàng)造，而他也因在這個(gè)領(lǐng)域的重要貢獻(xiàn)獲得2006年京都獎(jiǎng)。概況的說(shuō)，流式細(xì)胞儀的光學(xué)和電子系統(tǒng)的工作方式就是將激光束持續(xù)入射到液流中，當(dāng)細(xì)胞或顆?？焖偻ㄟ^(guò)激光束時(shí)，會(huì)產(chǎn)生前向散射光(Forward scatter)、側(cè)向散射光 (Side scatter)和多種波長(zhǎng)的熒光，這些光信號(hào)經(jīng)過(guò)透鏡和濾鏡組之后被光電倍增管等電子系統(tǒng)分別接收并轉(zhuǎn)換為電子脈沖。而分選系統(tǒng)再根據(jù)這些信號(hào)和操作時(shí)的設(shè)定參數(shù)(門(mén)的設(shè)置)決定給特定細(xì)胞的液滴

13、帶上不同的電荷使其被分選出來(lái)(圖2)。圖2 流式分析原理圖熒光激活細(xì)胞分選的應(yīng)用是非常廣泛，因?yàn)榧?xì)胞流式術(shù)可以檢測(cè)的細(xì)胞的多種參數(shù)，如細(xì)胞的大小(前向散射光)、細(xì)胞的顆粒度(側(cè)向散射光)、熒光染料的染色深淺、免疫熒光的抗體標(biāo)記和細(xì)胞內(nèi)的熒光蛋白量等。從分選的方式上來(lái)講，可以正性選擇(陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞)，可以負(fù)向選擇(陰性標(biāo)記的細(xì)胞)，亦可以同時(shí)選擇兩個(gè)甚至多個(gè)細(xì)胞群體(視具體機(jī)器功能)。再腫瘤干細(xì)胞的分選中，應(yīng)用較為廣泛的是利用免疫表型的分選和利用Hoechst 33342拒染特性的側(cè)群細(xì)胞分選。免疫表型的熒光染色免疫表型檢測(cè)是從血液學(xué)和免疫學(xué)研究中發(fā)展起來(lái)，原理就是用熒光染料偶聯(lián)的抗體標(biāo)記細(xì)胞

14、膜表面的分化抗原。通常免疫熒光標(biāo)記的方式包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記，一般流程如圖3所示.具體的細(xì)節(jié)由分選的細(xì)胞和操作者的習(xí)慣有所不同，本章中著重介紹實(shí)際操作中的一些體會(huì)與經(jīng)驗(yàn)，與同行交流、供讀者參考。圖3 免疫表型的熒光染色流程首先，一般來(lái)說(shuō)，整個(gè)抗體標(biāo)記反應(yīng)必需在冰浴上進(jìn)行，洗滌、離心等步驟也要保持低溫。這樣有助于增加細(xì)胞的存活率，而且低溫下細(xì)胞膜的內(nèi)吞活動(dòng)大大減少，有利于抗原表位的檢測(cè)。細(xì)胞始終處于合適的平衡鹽緩沖液如Hanks液，磷酸鹽緩沖液等，其中添加適度(2%)的血清可以減少細(xì)胞損傷和損失。承載細(xì)胞懸液的容器宜選擇聚丙烯材質(zhì)的離心管，可以減少頻繁離心洗滌過(guò)程中細(xì)胞的損失。其次，封閉液中要

15、包含第二抗體宿主(動(dòng)物)的免疫球蛋白，主要防止細(xì)胞表面Fc段的受體非特異性的吸附抗體，這對(duì)血液中的單個(gè)核細(xì)胞尤其重要，長(zhǎng)期培養(yǎng)的實(shí)體瘤細(xì)胞系可以視具體情況而定。如果用間接法標(biāo)記，第二抗體應(yīng)盡量選擇F(ab)2段的抗體。再次，一般情況下，直接標(biāo)記法操作簡(jiǎn)單，染色效果更佳，也更有利于保持細(xì)胞活性，但是在多色標(biāo)記的情況下，研究者務(wù)必先考慮好聯(lián)合使用的方案(主要是針對(duì)擬使用的流式細(xì)胞儀的激光器、熒光通道選擇可以搭配使用的不同熒光素標(biāo)記的抗體)再購(gòu)買(mǎi)抗體。間接標(biāo)記法使用靈活，可以搭配不同的一抗，有利于在研究初步檢測(cè)和摸索條件，需要注意兩點(diǎn)：一是一抗、二抗之間的宿主免疫球蛋白的交叉反應(yīng)，而是不同激發(fā)波長(zhǎng)、

16、發(fā)射波長(zhǎng)的二抗標(biāo)記熒光素。另外，在分選過(guò)程中，免疫熒光標(biāo)記必須有足夠的分辨率，也即陽(yáng)性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度高，而陰性細(xì)胞的背景熒光弱。這與抗體的質(zhì)量和使用的濃度相關(guān)，抗體濃度過(guò)高在背景熒光過(guò)強(qiáng)，濃度太低則陽(yáng)性信號(hào)太弱。一般供應(yīng)廠商會(huì)提供參考的抗體工作濃度(抗體稀釋度)，但事實(shí)上在使用時(shí)要自己摸索最適條件。對(duì)直接標(biāo)記的熒光一抗，一種可靠的方法是設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照，倍比稀釋抗體測(cè)定不同濃度下陽(yáng)性細(xì)胞群(signal)和陰性細(xì)胞群(noise)的平均熒光強(qiáng)度的比值(S/N)，以S/N比值大為優(yōu)g/ml的濃度下得到S/N > 3的效果。一般情況下，0.5 g的抗體(免疫球蛋白)即足夠用于100l懸液中

17、的1×106個(gè)細(xì)胞。側(cè)群細(xì)胞檢測(cè)的Hoechst 33342染色側(cè)群細(xì)胞(side population，SP)是一群具有外排染料特性的細(xì)胞群，在多種正常組織、腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系中都可檢測(cè)到，分選到的側(cè)群細(xì)胞中富集了正常干細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞。側(cè)群細(xì)胞在組織或腫瘤中的含量極低，得名的來(lái)由是在Hoechst 3334染色的流式圖上顯示這一小群細(xì)胞出現(xiàn)在主群細(xì)胞的側(cè)方(圖4)。Hoechst 33342是一種活細(xì)胞的熒光染料，結(jié)合于DNA小溝中富含AT的區(qū)域，能透過(guò)正常的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核使DNA染色。側(cè)群細(xì)胞能拒染Hoechst 33342的原因是該群細(xì)胞能通過(guò)細(xì)胞膜上的ABC泵(ATP

18、binding cassette transporter)外排染料，有多種ABC家族成員和側(cè)群細(xì)胞有關(guān)，研究的較清楚的是ABCG2和ABCB1，其中ABCG2被認(rèn)為對(duì)Hoechst染料的外排能力最重要。目前對(duì)側(cè)群細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞關(guān)系還存在一些爭(zhēng)議，已有人認(rèn)為腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞系中SP細(xì)胞并非腫瘤干細(xì)胞，至少有些腫瘤是這樣1，常規(guī)SP細(xì)胞分選流程如下：【試劑和器具準(zhǔn)備】試劑準(zhǔn)備：1含2%胎牛血清(Hyclone)的DMEM(Sigma)培養(yǎng)基；2Hanks平衡鹽溶液(Invitrogen)31M HEPES溶液(Sigma)；4200 µg/ml PI(100×)溶液(Sig

19、ma)；51 mg/ml Hoechst33342(200×)溶液(Molecule Probes, Invitrogen)；65 mM verapamil(100×)溶液(Sigma)儀器、器具：配備351 nm紫外激光光源和488 nm激光光源的流式細(xì)胞分選儀，450DF，610DCLP和675ALP濾片37循環(huán)水浴，50ml聚丙烯離心管(Corning)，無(wú)菌流式管(BD Bioscience)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板和濾網(wǎng)等【染色步驟、上機(jī)分選】1細(xì)胞染色：(1)培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化，用37含2%胎牛血清DMEM重懸后計(jì)數(shù)；調(diào)整細(xì)胞懸液濃度約為1×106/ml，加入5

20、0ml離心管，分別設(shè)分選組和對(duì)照組。(2)兩組均加入熒光染料Hoechst33342，使終濃度為5 µg/ml，對(duì)照組還需加入維拉帕米，使終濃度為50 M；37水浴避光孵育90 min；孵育過(guò)程中要間隔一定時(shí)間搖晃孵育管。(3)孵育結(jié)束后，立即4離心細(xì)胞(或冰上急冷后離心)，用冰預(yù)冷Hanks液重懸細(xì)胞；加入PI使終濃度為2 µg/ml，細(xì)胞懸液過(guò)濾網(wǎng)。2. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：Hoechst33342用紫外激光激發(fā)，450nm濾片接受Hoechst藍(lán)光，675ALP接受Hoechst紅光。選取線性信號(hào)，做Hoechst red(X軸)和Hoechst blue(Y軸)二維散點(diǎn)

21、圖，將Hoechst Red及Hoechst Blue弱信號(hào)且verapamil對(duì)照組缺失的區(qū)域設(shè)定為SP細(xì)胞的門(mén)，計(jì)算百分比。分選出SP細(xì)胞及Non-SP細(xì)胞。儀器具體操作按儀器使用說(shuō)明、在專業(yè)操作人員指導(dǎo)下進(jìn)行。圖4 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的SP分選紅色表示SP細(xì)胞，綠色表示non-SP細(xì)胞，抑制劑Verapamil處理后SP細(xì)胞減少側(cè)群(SP)細(xì)胞的染色方法是由Goodell等2建立的，其實(shí)驗(yàn)室的網(wǎng)絡(luò)站點(diǎn)亦提供詳盡的技術(shù)方案。起初SP分選集中在骨髓中的造血干細(xì)胞，后來(lái)才引入腫瘤細(xì)胞的研究，其中Goodell2，Kondo3和Patrawala4等幾個(gè)小組的研究報(bào)告都可供參考。SP的染色過(guò)

22、程比免疫熒光標(biāo)記操作步驟少，概括地說(shuō)就是將消化或分離好的單細(xì)胞懸液在含有Hoechst 33342的培養(yǎng)基中溫育一定時(shí)間后上機(jī)檢測(cè)，但是整個(gè)染色的過(guò)程受到很多因素的影響，所以并不簡(jiǎn)單。根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道和筆者的經(jīng)驗(yàn)，值得注意以下幾點(diǎn)：1. 嚴(yán)格控制染色的溫育時(shí)間，溫度和Hoechst 33342的最終濃度。大多文獻(xiàn)報(bào)道溫育時(shí)間是90分鐘，溫度是37° C(最好是恒溫循環(huán)水浴)，Hoechst 33342的終濃度是5 g/ml。溫育結(jié)束后應(yīng)迅速低溫下離心，重懸于不含酚酞的Hanks液或磷酸鹽緩沖液并置于冰上。一般認(rèn)為控制溫育條件可以穩(wěn)定Hoechst染料的熒光強(qiáng)度和ABC泵外排的能力，而溫

23、育結(jié)束后迅速置于冰上可減少非特異的染料外泄。由于Hoechst的熒光信號(hào)強(qiáng)度可代表DNA含量，筆者判斷染色和光路效果較好的粗略標(biāo)準(zhǔn)是Hoechst 33342藍(lán)色熒光的直方圖可清晰觀察到主群細(xì)胞的G1期、S期、G2/M期組分。2. ABC泵的外排能力依賴ATP水解時(shí)釋放的能量，溫育時(shí)應(yīng)選擇合適的培養(yǎng)基如DMEM或RMPI1640等，一般添加2-5%的血清。另外，溫育最好在50ml以上的聚丙烯離心管內(nèi)進(jìn)行，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液的體積也最好相同，細(xì)胞密度應(yīng)控制在106個(gè)細(xì)胞/毫升。3流式分析圖中SP的門(mén)設(shè)置依照ABC泵抑制劑處理組中消失細(xì)胞的區(qū)域，ABC泵抑制劑一般可選擇維拉帕米(verapam

24、il)，F(xiàn)umitremorgin C(FTC)和利血平(crystoserpine)，應(yīng)當(dāng)注意維拉帕米和FTC對(duì)SP的抑制效率是不同的，維拉帕米主要針對(duì)ABCB1，而FTC則是ABCG2特異性的抑制劑。抑制劑處理組的主群細(xì)胞流式在圖上的位置也會(huì)略有偏遠(yuǎn)，表示染色強(qiáng)度會(huì)稍有增加。 4SP檢測(cè)對(duì)光路的要求很高，操作者必須每次開(kāi)機(jī)時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)微球檢測(cè)光路，特別是紫外激光的狀態(tài)。由于流式細(xì)胞儀的機(jī)型差異，在不同光源和濾片設(shè)置下SP區(qū)域在流式圖上的位置和形態(tài)可能會(huì)差異較大。Hoechst33342的最佳激發(fā)波長(zhǎng)在350nm左右，發(fā)射光最強(qiáng)在440nm左右。推薦的配置需要裝備水冷的紫外激光光源，功率調(diào)整到6

25、0-100mW間，但也有文獻(xiàn)報(bào)道使用407nm的固態(tài)紫色激光源。5對(duì)直接從組織中分離到的細(xì)胞進(jìn)行SP分選的難度較大，因SP檢測(cè)對(duì)細(xì)胞活力的要求更高，目前文獻(xiàn)中SP分選多在腫瘤細(xì)胞系中進(jìn)行。如要進(jìn)一步進(jìn)行免疫表型標(biāo)記，可在溫育之后冰上進(jìn)行。要注意的是如果紫外激發(fā)光很強(qiáng)，Hoechst藍(lán)光發(fā)射波段可能會(huì)干擾FITC或EGFP的檢測(cè)，因此要調(diào)整好熒光補(bǔ)償或事先設(shè)計(jì)更好的光路方案。流式分選的常見(jiàn)問(wèn)題一般研究者不需要詳細(xì)掌握上機(jī)分選的細(xì)節(jié)，但是了解以下的一些問(wèn)題有助于更好地進(jìn)行前期準(zhǔn)備和分選后的功能研究。1在準(zhǔn)備流式分選以前，需要了解所要標(biāo)記的膜抗原的表達(dá)水平和實(shí)際組織或細(xì)胞系中標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞的大致比例，

26、這對(duì)下一步的分選非常必要。通常可以通過(guò)組織切片和細(xì)胞爬片的免疫組化來(lái)來(lái)確認(rèn)，表達(dá)過(guò)于微弱的膜抗原可能是不適宜作為分選標(biāo)記的。2整個(gè)分選過(guò)程的操作步驟繁多，會(huì)不可避免地丟失細(xì)胞或損傷細(xì)胞，特別需要注意的是最后收集到的細(xì)胞數(shù)一般會(huì)與理論的分選得率有較大差異，原因在于接收細(xì)胞時(shí)細(xì)胞會(huì)附著于管壁丟失或死亡，而且由于分選純度的設(shè)置，機(jī)器會(huì)丟棄一部分包含陽(yáng)性細(xì)胞的液滴。要分選到足夠進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞，除了需要綜合考慮目標(biāo)細(xì)胞的比例和總細(xì)胞的數(shù)量外，還要估計(jì)到細(xì)胞損失，一般收集到的存活細(xì)胞可能只有50%左右。在進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)前，對(duì)收集到的細(xì)胞計(jì)數(shù)是比較穩(wěn)妥的辦法，但要注意如果分選到的細(xì)胞數(shù)極少(<1

27、05數(shù)量級(jí))，手工計(jì)數(shù)的誤差會(huì)極大。3. 在樣品細(xì)胞懸液中加入碘化丙啶(PI)或7-AAD有助于在分選時(shí)排除死細(xì)胞，另外為了減少收集時(shí)細(xì)胞的死亡，需要保證樣本管中的pH和溫度穩(wěn)定，并注意鞘液對(duì)分選細(xì)胞的影響，最好在收集管中加入多量的培養(yǎng)基(>1/3體積)，并培養(yǎng)基中加入20%的胎牛血清。分選一般都在低溫下進(jìn)行，收集完之后要立即使細(xì)胞恢復(fù)到正常培養(yǎng)環(huán)境。4. 目標(biāo)細(xì)胞群比例低于1%時(shí)，分選難度會(huì)比較大，主要是降低分選的純度和延長(zhǎng)分選的時(shí)間。目前主流的流式細(xì)胞分選儀的峰值速度都在每秒104的數(shù)量級(jí)，但計(jì)算上陽(yáng)性細(xì)胞的比例后仍然是很低的，況且全速運(yùn)行會(huì)降低分選細(xì)胞純度。腫瘤干細(xì)胞的比例通常都比

28、較低，有時(shí)可能需要采用磁式分選預(yù)先富集的策略。5. 要確定分選到的細(xì)胞的純度，可以簡(jiǎn)單的將分選收集到的細(xì)胞重新上機(jī)分析，一般可以獲得大于95%的純度。在目標(biāo)細(xì)胞群比例極低的情況下，保證純度是比較困難，這種情況需要對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)先的富集。三/ 免疫磁性細(xì)胞分選免疫磁性分選法的原理是將某種抗原的特異性抗體偶聯(lián)到特制的磁性微體上，在細(xì)胞與磁體混合時(shí)，磁體通過(guò)抗體的作用結(jié)合到表達(dá)相應(yīng)抗原的細(xì)胞的膜表面，當(dāng)磁體標(biāo)記的細(xì)胞通過(guò)磁場(chǎng)時(shí)，細(xì)胞因磁性作用而被吸附，當(dāng)磁場(chǎng)解除后，標(biāo)記的細(xì)胞就可被洗脫而分離出來(lái)。與流式分選技術(shù)相比較，磁性分選的方法不需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)，幾乎所有實(shí)驗(yàn)室都有條件開(kāi)展；操作也非

29、常簡(jiǎn)單，而且分選的時(shí)間短有利于保持細(xì)胞活力；從分選的純度上，磁性分選也只是稍稍遜色。因此這項(xiàng)技術(shù)頗受研究者青睞，已經(jīng)成為細(xì)胞分選中應(yīng)用的主流技術(shù)。免疫磁珠的標(biāo)記方法可以分為直接標(biāo)記和間接標(biāo)記。直接標(biāo)記就是廠商已直接把單克隆抗體偶聯(lián)到磁珠上，使用時(shí)只需把細(xì)胞和磁珠混合孵育后就可過(guò)柱分選。但是一般直標(biāo)的磁珠種類有限，通常都是常用的抗體如CD34、CD133等等。間接標(biāo)記是把首先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行普通的一抗標(biāo)記，然后再與偶聯(lián)二抗的磁珠混合。間接標(biāo)記的方法更加靈活，對(duì)部分表達(dá)微弱的抗原還能增加磁性吸附的作用。實(shí)際上，由于依賴特殊的磁珠，磁性分離法的研發(fā)基本上依靠廠商推動(dòng)，技術(shù)方案上研究者也只能亦步亦趨。關(guān)于具

30、體的操作方案，各家廠商都在網(wǎng)站上都提供詳細(xì)的技術(shù)資料，本章只擇其要點(diǎn)而不一一贅述。從直觀的操作方式給免疫磁性分選法分類，大致可分為依賴分離柱和非依賴分離柱兩類。依賴分離柱的的磁性分選法的特點(diǎn)是使用磁性微珠和特制的分離柱，經(jīng)典代表是MACS系列產(chǎn)品，其注冊(cè)商標(biāo)MACS(Magnetic-activated cell sorting，磁性激活細(xì)胞分選)幾乎成為免疫磁珠分離法的代名詞。MACS分離柱是類似注射器針筒的塑料容器，但是填充有不同規(guī)格鐵珠，裝置于配套的永磁體后柱體內(nèi)即能形成高強(qiáng)度的磁場(chǎng)。MACS 的磁珠由多聚糖和氧化鐵構(gòu)成，直徑約50nm，論體積僅為細(xì)胞的 百萬(wàn)分之一，但經(jīng)過(guò)分離柱的磁場(chǎng)時(shí)

31、細(xì)胞即可被小小的磁珠牽附在分離柱上，未結(jié)合磁珠的細(xì)胞則流經(jīng)分離柱而進(jìn)入收集管。將分離柱與磁鐵分開(kāi)，柱中的磁場(chǎng)消失，結(jié)合磁珠的細(xì)胞就能被洗脫下來(lái)。由于有過(guò)柱和洗脫的過(guò)程，操作相對(duì)復(fù)雜，新手需要一定的訓(xùn)練。非依賴分離柱的分選的特點(diǎn)是無(wú)需分離柱，磁珠和細(xì)胞結(jié)合之后將細(xì)胞懸液管直接置于永磁體形成的強(qiáng)磁場(chǎng)中，標(biāo)記上的細(xì)胞便直接貼附在管壁上，除去上清，洗滌數(shù)次后留下的就是標(biāo)記的細(xì)胞，也直接收取上清中的細(xì)胞。目前采用這種方式的產(chǎn)品有Dynabeads和EasySep®等。由于過(guò)柱操作，分選流程上也更加簡(jiǎn)化，同時(shí)避免了過(guò)柱的過(guò)程對(duì)細(xì)胞的影響。但是沒(méi)有分離柱增強(qiáng)磁場(chǎng)的作用，Dynabeads采用體積更

32、大的磁珠(與細(xì)胞相仿的數(shù)量級(jí))來(lái)增強(qiáng)磁性吸附作用，吸附到的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)操作前需要將細(xì)胞與磁珠解離。 EasySep®雖然仍采用了較小的磁性微珠，但宣稱能保證吸附的效果。從分選策略上來(lái)分類，免疫磁性分選方法有可分為陽(yáng)性分選(positive selection strategy)，清除分選(depletion strategy)和聯(lián)合策略(combined strategy)等。簡(jiǎn)單的說(shuō)，陽(yáng)性分選就是磁性標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞群而富集這些細(xì)胞，而清除分選是磁性標(biāo)記那些不需要的細(xì)胞而去除之。聯(lián)合策略顧名思義就是將前兩者綜合使用，如在清除分選去掉不需要的細(xì)胞之后采用陽(yáng)性分選獲得目標(biāo)細(xì)胞群，或是聯(lián)合兩

33、次針對(duì)不同抗原陽(yáng)性分選的多重分選(MultiSort)。雖然具有很多優(yōu)點(diǎn)，磁性分選的也有一些比較明顯的缺陷，首先是死細(xì)胞的非特異性吸附問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題需要通過(guò)分選前預(yù)處理來(lái)解決。其次分選過(guò)程是一個(gè)“黑箱”，無(wú)法在分選時(shí)實(shí)時(shí)地了解到目標(biāo)細(xì)胞群在總細(xì)胞群中的比例，也無(wú)從知曉分選后目標(biāo)細(xì)胞在收集到的細(xì)胞中的純度。為了克服這個(gè)問(wèn)題，通常研究者需要對(duì)收集到的細(xì)胞再做流式檢測(cè)，也即是用相同抗原熒光抗體去標(biāo)記收集到的細(xì)胞。在產(chǎn)品的選擇上，顯然各廠家都宣揚(yáng)自身的優(yōu)點(diǎn)，研究者也很難對(duì)分選的效率和純度進(jìn)行絕對(duì)的比較。既往來(lái)看，MACS應(yīng)用比較廣泛，尤其腫瘤干細(xì)胞的文獻(xiàn)報(bào)道大多采用MACS，而其他的新產(chǎn)品和技術(shù)的應(yīng)用

34、也在不斷的增加。客觀的講，具體的方法各有所長(zhǎng)，研究者需要對(duì)分選的策略(分選陽(yáng)性細(xì)胞或去除陽(yáng)性細(xì)胞)，是否兼容流式檢測(cè)和減少對(duì)細(xì)胞影響等因素進(jìn)行綜合考慮。結(jié)語(yǔ)細(xì)胞分選技術(shù)相當(dāng)豐富，除了在本章中具體介紹的熒光激活細(xì)胞分選和免疫磁性細(xì)胞分選方法之外，還有很多技術(shù)比如密度梯度分離法，免疫淘洗法，親和層析法和細(xì)胞電泳法。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，很多方法的使用逐漸地減少了，或者成為其他方法的輔助和補(bǔ)充。在腫瘤干細(xì)胞的研究中，流式分選和免疫磁性法占據(jù)了主要的位置，這兩者方法可以相互裨益，也是目前應(yīng)用前景最為廣闊的分選方法。對(duì)比流式細(xì)胞分選和免疫磁性分選，毫無(wú)疑問(wèn)后者更經(jīng)濟(jì)實(shí)用，但是應(yīng)用的限制也顯而易見(jiàn)，也就是每次分選只能依賴于單個(gè)膜抗原，而實(shí)體瘤干細(xì)胞的研究卻常常為缺乏膜抗原的表達(dá)而苦惱不堪。從這個(gè)方面來(lái)看，擅長(zhǎng)多參數(shù)分選的流式細(xì)胞儀凸顯出它的優(yōu)勢(shì)。流式可以檢測(cè)的細(xì)胞特征不僅僅局限于表觀的特征，比如細(xì)胞大小，某抗原的表達(dá)；還可以深入的發(fā)掘功能方面的特征，根據(jù)染料拒染能力而建立的側(cè)群細(xì)胞分選就是最好的例證。隨著研究的進(jìn)展，流式分選所顯現(xiàn)出的趨勢(shì)就是由細(xì)胞膜外轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，有靜態(tài)的膜蛋白表達(dá)發(fā)展到檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)通路的活性和蛋白質(zhì)的相互作用，而這恰恰是缺乏膜抗原的實(shí)體瘤干細(xì)胞分選所需要的。這些應(yīng)用方向的例證包括：用熒光染料Aldefluor檢測(cè)細(xì)胞中ALDH酶的活性，并以此分選乳腺