糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控的分子機(jī)制

1、精品文檔項目名稱：糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控的分子機(jī)制首席科學(xué)家：林圣彩廈門大學(xué)起止年限：2011.1 至 2015.8依托部門：教育部二、預(yù)期目標(biāo)1. 總體目標(biāo)確定機(jī)體和細(xì)胞在不同生理狀況和環(huán)境因素下維持糖脂代謝穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制， 闡明在細(xì)胞生長和應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用的調(diào)節(jié)因子調(diào)控細(xì)胞代謝的信號通路網(wǎng)絡(luò)， 為糖脂代謝紊亂造成的肥胖、脂肪肝、 糖尿病和癌癥的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。2. 五年預(yù)期目標(biāo)(1) 建立對實驗動物代謝相關(guān)的生理生化指標(biāo)分析的技術(shù)平臺，發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因敲除或轉(zhuǎn)基因小鼠造成糖脂代謝紊亂的信號通路。(2) 較系統(tǒng)地描述在逆境下機(jī)體和細(xì)胞調(diào)控糖脂代謝的分子網(wǎng)絡(luò)以及調(diào)控過程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)和蛋白

2、質(zhì)復(fù)合體的動態(tài)調(diào)控機(jī)制。(3) 發(fā)現(xiàn)新的參與代謝調(diào)控的基因，為代謝性疾病和腫瘤的防治提供新的分子靶標(biāo)。(4) 培養(yǎng)高質(zhì)量博士研究生20-30 名，培養(yǎng)3-5 名享有國際知名度的專家和5-8名中青年學(xué)術(shù)帶頭人。(5)在國際重要刊物發(fā)表SCI論文15-25篇，其中爭取在Cell、Nature、Science或其子刊等影響因子10 以上雜志發(fā)表研究論文5-10 篇， 申請發(fā)明專利3-5 項。三、研究方案1 . 總體研究方案細(xì)胞能量代謝是細(xì)胞最基本、最重要的活動之一，與細(xì)胞的繁殖、分化、凋亡、 運動、 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及多種重要疾病的發(fā)生密切相關(guān)，是生命科學(xué)的一個重要領(lǐng)域。 細(xì)胞要通過能量感應(yīng)系統(tǒng)隨時監(jiān)測其能

3、量水平狀態(tài)，在不同的物質(zhì)和能量狀態(tài)下要不斷地通過細(xì)胞內(nèi)的代謝調(diào)控途徑來調(diào)節(jié)其代謝水平以達(dá)到一種穩(wěn)態(tài)。同時， 細(xì)胞在面對內(nèi)外界一些不良因素時也會做出相應(yīng)的代謝變化，這些應(yīng)激反應(yīng)對細(xì)胞正常的生長和功能是極其重要的。如果這些應(yīng)激反應(yīng)失調(diào)，就會使細(xì)胞代謝發(fā)生異變，導(dǎo)致如前所述的多種人類重大疾病的發(fā)生。本項目的總體研究方案擬利用我們在蛋白質(zhì)科學(xué)、細(xì)胞代謝、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究領(lǐng)域的研究優(yōu)勢和技術(shù)手段，結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)、動物生理學(xué)等學(xué)科的研究方法，集中力量多層次、多角度地研究與細(xì)胞代謝調(diào)控相關(guān)的信號通路網(wǎng)絡(luò)，分離和鑒定參與細(xì)胞代謝調(diào)控的新的基因和信號通路，探討各個信號通路之間的動態(tài)調(diào)控機(jī)制，并研究細(xì)胞異常代謝

4、的信號通路，揭示代謝異常與糖尿病、腫瘤等重大疾病的關(guān)系。項目總體研究方案如下圖1：隨意編輯精品文檔內(nèi)外環(huán)境因素（缺氧、營養(yǎng)缺乏或過剩、癌基因突變等）糖脂轉(zhuǎn)運調(diào)控因子（Glu4、Tankyrase、Cide等）細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子（Wnt、TR3、ckip-1 等）應(yīng)激反應(yīng)因子（p53、AMPK、HIF1 等）隨意編輯2 .技術(shù)路線由于代謝調(diào)控常常涉及多種組織、 器官乃至整個機(jī)體，因此利用基因敲除小 鼠模型來確證基因在代謝過程中的生理功能已成為“金標(biāo)準(zhǔn)”。本項目組已經(jīng)擁有或正在構(gòu)建各種基因敲除小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠模型，包括 TNKS2、PTEN、 CKIP-1、cideb、p53、Lkb1、Tip60基

5、因敲除小鼠以及cidea轉(zhuǎn)基因小鼠。我 們將利用這些小鼠模型，比較研究代謝調(diào)控在正常生理狀況以及不同內(nèi)外因素的 刺激下細(xì)胞能量代謝的變化及其調(diào)控的信號通路網(wǎng)絡(luò)。同時，我們也將借助體外 細(xì)胞培養(yǎng)，特別是比較研究正常細(xì)胞以及月中瘤細(xì)胞在低氧狀況下和目前常規(guī)培養(yǎng) 狀況下代謝調(diào)控的異同，并與機(jī)體內(nèi)生理條件下代謝調(diào)控的情況相比較，尋找適合代謝調(diào)控研究的細(xì)胞培養(yǎng)模型。 在此基礎(chǔ)上驗證從動物模型得到的結(jié)果，并在分子水平上進(jìn)一步深入研究影響細(xì)胞代謝的信號通路網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制。止匕外，我們將通過酵母雙雜交、分子篩層析、免疫共沉淀和質(zhì)譜等等蛋白質(zhì)研究手段捕捉 并鑒定與代謝調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)復(fù)合體及其組份，從而為闡明代

6、謝調(diào)控中各種蛋 白質(zhì)復(fù)合體的動態(tài)組裝奠定基礎(chǔ)。同時，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析來揭示各種蛋白質(zhì)復(fù)合體中蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系。故，項目的總體技術(shù)路線如圖 2:課題1/2/3課題2/1/3正常生理狀況 逆境狀況圖2.項目的總體技術(shù)路線3 .創(chuàng)新與特色本項目擬利用已有或正在進(jìn)行的各種基因敲除小鼠模型， 在動物個體的基礎(chǔ) 上闡明代謝調(diào)控的機(jī)理和生理作用。同時，借助我們在脂質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋 白質(zhì)組學(xué)、功能基因組學(xué)方面的研究基礎(chǔ)和優(yōu)勢，對調(diào)控糖脂代謝穩(wěn)態(tài)的分子機(jī) 制進(jìn)行研究，探索細(xì)胞在不同逆境（低氧、缺氧、高脂等）下的代謝方式的轉(zhuǎn)變 及其調(diào)控信號通路網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化，特別是深入探討細(xì)胞生長和應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因

7、子對細(xì)胞代謝的調(diào)控作用,將在分子水平、細(xì)胞水平以及動物個體水平上增進(jìn)我們對代謝調(diào)控以及異常代謝與細(xì)胞異常增殖之間的關(guān)系的認(rèn)識。為最終闡明細(xì)胞糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控的分子機(jī)制和相關(guān)重大疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。4 .課題設(shè)置課題1糖脂轉(zhuǎn)運及其穩(wěn)態(tài)調(diào)控的的分子機(jī)制研究內(nèi)容：細(xì)胞內(nèi)糖脂代謝的穩(wěn)態(tài)調(diào)控是維持細(xì)胞或機(jī)體基本生命活動的基礎(chǔ)，糖脂代謝的紊亂與糖尿病、肥胖、脂肪肝、心血管疾病、細(xì)胞異常增殖以及癌癥的發(fā)生 和發(fā)展密切相關(guān)。本課題將在分子、細(xì)胞和基因敲除小鼠水平上研究Axin、AMPK、TNKS2、PTEN、Cideb、Cidea等基因?qū)ζ咸烟寝D(zhuǎn)運、脂肪合成和儲 存、脂滴的形成等代謝途徑的調(diào)節(jié)作用及其與肥

8、胖癥、脂肪肝和細(xì)胞異常增殖的 關(guān)系。從細(xì)胞學(xué)的角度來看，肥胖的發(fā)生是由于脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加以及脂肪細(xì) 胞中脂滴變大兩個方面引起的。研究表明，伴隨著脂滴的變大，脂肪細(xì)胞變大， 導(dǎo)致細(xì)胞炎癥因子分泌的變化，例如 resistin、TNF a和游離脂肪酸等分泌的增 加，最終導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生。因此，對脂滴的形成過程的研究，不僅有助于我們了解脂滴的生物學(xué)功能， 而且對肥胖及肥胖引起的其它代謝 綜合癥疾病，有深遠(yuǎn)意義。課題 1擬開展以下幾個方面的研究：1. 糖代謝的穩(wěn)態(tài)調(diào)控通過前期工作，我們發(fā)現(xiàn) Axin和AMPK 能相互作用并增強 AMPK響應(yīng) 能量缺失的刺激，即AMPKa的第172位

9、蘇氨酸的磷酸化。Axin敲低的細(xì)胞在 受到低糖刺激的情況下，AMPKa的第172位蘇氨酸的磷酸化水平增加幅度與正 常細(xì)胞相比大幅降低。這表明 Axin是應(yīng)對糖穩(wěn)態(tài)變化的重要因子，且在 AMPK精品文檔活性調(diào)控的過程中扮演了重要角色。我們擬進(jìn)行以下實驗，深入闡明Axin 、AMPK 和糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控的關(guān)系：(1) 研究 Axin 調(diào)控 AMPK 活性的分子機(jī)制研究 Axin 調(diào)節(jié) AMPK 的激活是通過影響 AMPK 上游激酶與AMPK 的相互作用還是影響了AMPK 三個亞基之間的相互作用。(2) 應(yīng)用小鼠模型研究Axin 缺失或突變導(dǎo)致的AMPK 活性的變化利用腺病毒感染系統(tǒng)特異性地敲低小鼠肝臟或

10、肌肉中的Axin ，或利用條件性基因敲除技術(shù)敲除小鼠肝臟或肌中的Axin ，對這些小鼠施以饑餓等影響能量水平的刺激，觀察動物體內(nèi)AMPK 活性的變化。(3) 應(yīng)用小鼠模型研究Axin 缺失或突變導(dǎo)致的糖穩(wěn)態(tài)平衡的改變對上述小鼠進(jìn)行糖代謝相關(guān)生化指標(biāo)的測定以及AMPK 參與糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平的檢測。(4) 研究 Aurora 在 Axin 調(diào)控 AMPK 活性中的作用Aurora 是在生長中起重要作用的激酶，能調(diào)控Axin 在中心粒上的定位，因此，我們擬研究Aurora 是否在 Axin 調(diào)控 AMPK 活性中也起作用。2. 研究葡萄糖轉(zhuǎn)運和脂肪細(xì)胞生成的分子機(jī)制以及糖脂代謝異常與肥胖和胰

11、島素抵抗的關(guān)系(1) 研究 Axin 和 TNKS2 對葡萄糖轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)機(jī)理我們通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn) Axin 能與 TNKS2 相互作用；TNKS2 與 Kif3a 之間相互作用；Axin 與 Kif3a之間也存在相互作用。Kif3 是由 Kif3a、 Kif3b 和 KAP3 構(gòu)成的異源三聚體。它是一種依賴于微管的馬達(dá)動力蛋白質(zhì)復(fù)合體，可以向微管正極定向移動，在細(xì)胞內(nèi)承擔(dān)膜性細(xì)胞器或生物大分子復(fù)合物的運輸功能。已有的研究表明在3T3-L1脂肪細(xì)胞中Kif3 參與胰島素調(diào)節(jié)的Glut4 向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運。TNKS2 與 GSV(Glut4 storage vesicle) 上的 IRAP 有

12、相互作用。我們將通過免疫熒光實驗確定Kif3a 、 TNKS2、 Axin 和 Glut4 之間是否有共定位，而且在胰島素刺激下是否有向細(xì)胞膜共轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。同時，我們將用siRNA 干擾 C2C12 細(xì)胞中 TNKS2、Axin 及 Kif3a 的表達(dá)，觀察細(xì)胞對胰島素刺激下葡萄糖吸收的反應(yīng)。另外，用TNKS2 抑制劑XAV939( 由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院沈月毛教授合成)刺激 C2C12細(xì)胞， 觀察該抑制劑是否能降低胰島素刺激引起的葡萄糖的吸收。通過上述實驗我們將證明Kif3a、 TNKS2、 Axin 是否通過形成復(fù)合體來調(diào)控胰島素刺激的Glut4的轉(zhuǎn)運，從而調(diào)節(jié)葡萄糖的吸收。(2) 分離

13、TNKS2 的新的蛋白質(zhì)復(fù)合體為了更全面的找到以TNKS2 為核心的調(diào)節(jié)糖脂代謝的分子網(wǎng)絡(luò)，我們擬構(gòu)建TNKS2 不同片段的餌，使其覆蓋TNKS2全蛋白質(zhì)序列，進(jìn)行大規(guī)模的酵母雙雜交實驗。另一方面，我們擬以小鼠的肌肉、脂肪組織為原料，采用以高效液相色譜為核心的生化分離手段結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析技術(shù)，分離鑒定出不同生理水平下TNKS2 復(fù)合體中的蛋白質(zhì)組份，并用免疫共沉淀、免疫熒光共定位及GST- pulldown 等方法進(jìn)一步驗證這些蛋白質(zhì)與TNKS2 的相互作用。(3) 研究 TNKS2 的多聚 ADP 核糖化酶活性在調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運及脂肪細(xì)胞生成中的作用。首先我們將通過質(zhì)譜手段檢測胰島素是否調(diào)控T

14、NKS2 的翻譯后修飾，進(jìn)而研究該修飾是否影響TNKS2 的多聚 ADP 核糖化酶的活性及TNKS2 和其相互作用蛋白質(zhì)的結(jié)合。此外，由于TNKS2 具有多聚ADP 核糖化酶的活性，我們將考察TNKS2 是否介導(dǎo)與其相互作用的蛋白質(zhì)的多聚ADP 核糖化修飾。在此基礎(chǔ)上我們將構(gòu)建TNKS2 的多聚 ADP 核糖化酶活性缺失的表達(dá)載體，研究其形成復(fù)合體的能力及調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運和脂肪細(xì)胞生成的作用。(4) 在動物水平上研究調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運及脂肪細(xì)胞生成的分子機(jī)制。全面分析TNKS2 基因敲除小鼠與代謝相關(guān)的表型，包括小鼠在不同生長時期、不同生長條件（饑餓或飽食、缺氧等）下的體重、體溫、不同部位脂肪組織的

15、重量和脂肪細(xì)胞的數(shù)量、內(nèi)臟器官的重量等。同時測定小鼠血液中血糖、甘油三酯、不飽和脂肪酸、胰島素、胰高血糖素及瘦素的含量；脂肪組織中脂肪的含量；肝臟和肌肉中糖原的含量等。此外， 對小鼠進(jìn)行葡萄糖耐受試驗、丙酮酸耐受試驗及胰島素耐受試驗，測定小鼠脂肪和肌肉的葡萄糖吸收效率。由于腺病毒感染系統(tǒng)可以特異性地攻擊肝臟和肌肉，我們將利用該系統(tǒng)在小鼠的肝臟和肌肉中導(dǎo)入針對Axin及上述新發(fā)現(xiàn)的TNKS2的復(fù)合體的組份的siRNA ,測定小鼠與代謝相關(guān) 的表型，確定這些分子及其復(fù)合體在調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運及脂肪細(xì)胞生成中的作用。同時， 我們將建立上述基因的條件性敲除或敲入小鼠，分析這些小鼠與糖脂代謝相關(guān)的表型，為分

16、子及細(xì)胞水平的研究結(jié)果提供生理證據(jù)。另一方面，我們擬與廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院合作，在肥胖癥、糖尿病等代謝相關(guān)疾病的病人中檢測脂肪組織中TNKS2 的表達(dá)及基因突變情況，以期為代謝相關(guān)性疾病的早期分子診斷提供依據(jù)。3. 脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控的機(jī)制研究 Cide 家族蛋白質(zhì)（Cidea ， Cideb 和 Fsp27 ） ， PTEN 和 AMPK 在脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞中脂代謝穩(wěn)態(tài)包括脂儲存，脂分解和分泌中的作用，運用轉(zhuǎn)基因和基因敲除模型在動物水平上研究脂代謝與脂肪肝發(fā)生，肝組織纖維化，炎癥反應(yīng)，細(xì)胞異常增殖之間關(guān)系。(1) Cide 家族蛋白質(zhì)在脂肪細(xì)胞中脂滴形成、融合與水解的作用及其機(jī)制我們通過Fsp2

17、7 基因敲除小鼠，小鼠胚胎纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞株3T3-L1的研究表明Fsp27 蛋白質(zhì)定位于脂滴表面，可控制脂肪細(xì)胞中脂滴的形成，脂水解， 并在脂肪細(xì)胞中基因表達(dá)調(diào)控以及胰島素的敏感性中起重要作用。但其作用的分子機(jī)制還不清楚。我們將通過生物化學(xué)方法分離和純化Fsp27 以及脂滴，建立體外脂滴融合體系，并通過細(xì)胞影像系統(tǒng)活體詳細(xì)研究脂滴的動態(tài)變化過程。我們將采用酵母雙雜交、免疫共沉淀的方法，尋求與Fsp27 相互作用的蛋白質(zhì)，研究其與Fsp27 相互協(xié)調(diào)調(diào)控脂滴的動態(tài)變化。同時，我們還將建立脂肪細(xì)胞特異過表達(dá)Fsp27 的轉(zhuǎn)基因小鼠，研究在Fsp27 過表達(dá)后動物脂肪細(xì)胞的脂滴的大小、脂水解的活

18、性、脂肪細(xì)胞的分化以及胰島素敏感性、血脂的含量以及脂肪過量積累對肝臟和骨骼肌的脂代謝等的關(guān)系；并用脂質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等方法研究Fsp27 調(diào)控脂肪細(xì)胞脂代謝的分子機(jī)制。(2) CIDE 蛋白質(zhì)、PTEN、 AMPK 等調(diào)控肝臟細(xì)胞脂代謝的機(jī)制利用我們現(xiàn)有的Cide 家族敲除小鼠和將建立的PTEN 肝臟特異敲除小鼠，我們將研究：CIDE蛋白質(zhì)和PTEN在肝臟細(xì)胞中脂肪積累、脂肪合成、脂肪酸氧化以及VLDL 分泌等脂代謝的調(diào)控機(jī)制；肝臟脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控與脂肪肝的發(fā)生；利用酵母雙雜交、免疫共沉淀、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等手段找尋在肝臟中與CIDE 家族蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)以及受CIDE 蛋白

19、質(zhì)調(diào)控的代謝網(wǎng)絡(luò)。 利用化學(xué)誘變劑促使肝臟細(xì)胞發(fā)生癌變。研究從脂肪肝發(fā)生后到肝臟的癌變過程中糖脂代謝的變化，炎癥因子的變化情況及致癌相關(guān)基因的表達(dá)情況。檢測脂肪肝發(fā)生、組織纖維化、癌變以及與炎癥反應(yīng)之間關(guān)系。利用原代肝細(xì)胞或肝細(xì)胞系為模型詳細(xì)研究CIDE 蛋白質(zhì)、 PTEN 和 AMPK 在肝細(xì)胞中脂肪積累、脂代謝的調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制。從轉(zhuǎn)基因和肥胖小鼠中分離原代肝細(xì)胞及利用實驗室已有的肝細(xì)胞系，用各種因子如炎癥因子、脂肪酸、 細(xì)胞凋亡因子等刺激，詳細(xì)研究肝細(xì)胞的脂肪積累、細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制，在細(xì)胞和分子水平上解釋肝臟的脂肪積累和其病變的關(guān)系。4. 研究甘油代謝限速酶GK、 胰島

20、素信號通路重要節(jié)點分子Akt1 以及肝臟重要轉(zhuǎn)錄因子HNF1 a在糖尿病發(fā)生、發(fā)展、與調(diào)控過程中的分子機(jī)制。(1) GK/TR3 相互作用在肝細(xì)胞糖原異生代謝的影響：GK 與 TR3 相互作用的特性，如相互作用結(jié)構(gòu)域、影響因素、特異性等；GK 對 TR3 調(diào)控功能的影響，包括 TR3 的轉(zhuǎn)錄活性及DNA 結(jié)合活性；GK/TR3 相互作用對肝細(xì)胞功能及糖異生代謝的影響；應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠分析GK/TR3 相互作用對糖異生代謝及胰島素水平等的影響。(2) 研究 Akt 蛋白質(zhì)復(fù)合體功能：擬通過串聯(lián)親和純化技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)的實驗策略純化鑒定人肝癌細(xì)胞的Akt1 蛋白質(zhì)復(fù)合體，獲得一批Akt1 的候選相互

21、作用蛋白質(zhì)。HNF1 a /14-3-3己相互作用的分子機(jī)制及其在 HNF1 a選擇性調(diào)控基因表達(dá)中的作用進(jìn)行深入研究：HNF-3-3討目互作用的特性(如作用位點、特異性、影響因素等)及相互作用的功能(如促進(jìn)二聚化、穩(wěn)定磷酸化、增強DNA的結(jié)合、增強轉(zhuǎn)錄激活活性、介導(dǎo)泛素化、以及是否介導(dǎo)HNF1 a與其它蛋白質(zhì)的協(xié)同調(diào)控等)。研究目標(biāo) ：1. 鑒定 5-10 個與糖脂代謝相關(guān)的基因的功能，并闡述其在維持糖脂代謝穩(wěn)態(tài)的過程中的分子機(jī)制；2. 闡述以上基因是如何通過調(diào)控糖脂代謝穩(wěn)態(tài)而影響肥胖、糖尿病、細(xì)胞異常增殖的發(fā)生發(fā)展的。承擔(dān)單位：廈門大學(xué)、清華大學(xué)、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所課題負(fù)責(zé)人：林圣彩

22、學(xué)術(shù)骨干：李蓬、宋詠梅、楊叔禹、林舒勇、李丹課題經(jīng)費比例：33%課題 2 調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子調(diào)控能量代謝的分子機(jī)制研究內(nèi)容：細(xì)胞在異常增殖和應(yīng)激反應(yīng)下會發(fā)生能量代謝的改變，但是導(dǎo)致代謝改變的分子機(jī)理仍不清楚。目前的研究表明調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子在調(diào)控能量代謝中也起重要作用，如我們發(fā)現(xiàn)CKIP-1可以影響肥胖的發(fā)生和瘦素的分泌； p53 被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞代謝特別是腫瘤細(xì)胞的異常代謝中具有重要的功能，通過對不同靶基因表達(dá)的調(diào)控和參與調(diào)節(jié)mTOR、NF- kB等代謝核心信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控氧化磷酸化、糖酵解等過程；TR3 除了調(diào)節(jié)糖異生途徑外，還參與調(diào)控糖酵解、糖原分解和磷酸甘油的

23、穿梭轉(zhuǎn)運。此外，低氧是典型的逆境應(yīng)激反應(yīng)；適度低氧所引起的細(xì)胞代謝的變化和能量的產(chǎn)生及利用不同于以往的缺氧效應(yīng)。低氧引起細(xì)胞代謝改變的分子機(jī)制及生化過程目前仍不清楚。本課題擬以CKIP-1 、p53 、 TR3 和 HIF1 信號通路為中心，深入探討細(xì)胞在各種應(yīng)激反應(yīng)中能量代謝的變化和分子機(jī)制。課題2 擬開展的研究內(nèi)容如下：1.研究CKIP-1在肥胖和瘦素分泌過程中的地位以及TGFB超家族信號通路在能量代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用利用 CKIP-1-/- 小鼠模型研究CKIP-1 在肥胖和瘦素分泌過程中的地位以及TGF B超家族信號通路在能量代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用，闡明其發(fā)揮功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。(1)

24、前期研究發(fā)現(xiàn)，在正常飲食下，CKIP-1+/+ 與 CKIP-1-/- 小鼠體重增加并無二致；而在高脂飲食下，CKIP-1-/- 小鼠體重顯著增加。我們首先擬開展實驗的是檢測高脂飲食下的血糖穩(wěn)態(tài)維持有無異常，即以空腹血糖，葡萄糖耐受和胰島素抵抗等指標(biāo)來確定 CKIP-1-/-小鼠是否具有II型糖尿病表型。此外，檢測CKIP-1+/+ 與 CKIP-1-/- 小鼠血清中甘油三酯、總膽固醇、高密度和低密度載脂蛋白質(zhì)含量，以確定CKIP-1 是否影響了血脂代謝。另一方面，我們也會對高脂飲食下CKIP-1-/- 小鼠體重顯著增加的原因作出探究，擬對兩種基因型小鼠攝食量，活動性，呼吸熵，線粒體氧化效率等

25、反映能量利用的指標(biāo)做出評估，以期找到 CKIP-1-/- 小鼠肥胖易感的原因。(2) 我們擬研究正常和高脂飲食下CKIP-1+/+ 與 CKIP-1-/- 小鼠脂肪組織總量、脂肪細(xì)胞個體大小以及脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如瘦素(leptin) 、脂聯(lián)素(adiponectin) 、抵抗素(resistin) 等重要指標(biāo)的變化，檢測兩種基因型小鼠肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯儲存量以及調(diào)控其儲存的關(guān)鍵蛋白質(zhì)如PPAR a等的表達(dá)水平，明 確 CKIP-1 基因?qū)χ炯?xì)胞、肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞功能的調(diào)控作用。同時，進(jìn)行兩種基因型小鼠骨骼肌能量代謝指標(biāo)的比較，評估氧化磷酸化過程中重要蛋白質(zhì)UCP 家族的表達(dá)變化差異。(

26、3) 闡明 CKIP-1 基因調(diào)控細(xì)胞代謝的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究在正常和高脂飲食下CKIP-1 缺失對 JNK 通路及 PI3K-AKT-mTOR 通路的影響；研究CKIP-1 對于p53 在代謝調(diào)控中作用的影響及其信號通路；并研究 CKIP-1 是否可以通過調(diào)節(jié)泛素連接酶Smurfl降解Smadl來影響TGF B /BMP超家族信號通路對于能量 穩(wěn)態(tài)的維持。2. 異常細(xì)胞代謝的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控的分子機(jī)制以 p53 為節(jié)點分子尋找選擇性調(diào)控p53 代謝相關(guān)途徑的分子，并對這些分子的功能及作用機(jī)制進(jìn)行研究，揭示在細(xì)胞變異及在逆境應(yīng)激反應(yīng)中p53 參與代謝調(diào)控的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)制。(1) KRAB

27、 型鋅指蛋白質(zhì)家族中代謝相關(guān)的p53 選擇性調(diào)控分子篩選：第一輪篩選：比照Apak 的功能特點，即在應(yīng)激信號下，發(fā)生磷酸化與p53 解離，解除對 p53 的抑制功能，提供生物信息學(xué)分析，將含有各種應(yīng)激信號相關(guān)激酶磷酸化位點的成員克隆及確認(rèn)表達(dá)；第二輪篩選：通過報告基因活性測定篩選出能抑制 p53 轉(zhuǎn)錄活性的成員；第三輪篩選：通過實時定量PCR 及 ChIP 實驗篩選能夠選擇性調(diào)控p53 代謝相關(guān)靶基因表達(dá)的成員；(2) 代謝相關(guān)的p53 選擇性調(diào)控分子的功能及作用機(jī)制研究：A 經(jīng)過以上三輪篩選，得到 p53 選擇性代謝調(diào)控分子成員后，檢測它們?nèi)绾握{(diào)控 p53 的活性、穩(wěn)定性，是否影響p53 的

28、翻譯后修飾；針對細(xì)胞代謝途徑，選擇性的檢測它們對糖代謝途徑、合成代謝途徑、細(xì)胞自噬、脂類代謝等途徑的調(diào)控功能及變化等進(jìn)行系統(tǒng)研究。B.分析在細(xì)胞異變及在逆境應(yīng)激反應(yīng)，如缺氧及營養(yǎng)匱乏等條件下，調(diào)控分子與p53 的結(jié)合狀態(tài), p53 活性的變化及變化機(jī)制等。(3) 對 p53 選擇性代謝調(diào)控分子進(jìn)行組織細(xì)胞表達(dá)譜分析：通過 Northernblot 、 q-PCR 、 Western blot 等手段分析相關(guān)成員的細(xì)胞、組織、器官表達(dá)譜，揭示它們的分布規(guī)律，不同成員之間的重疊性。(4) 對 p53 選擇性代謝調(diào)控分子進(jìn)行功能協(xié)同關(guān)系研究：對于組織表達(dá)譜有重疊的 p53 選擇性代謝調(diào)控分子，通過單

29、一和聯(lián)合RNAi 技術(shù)敲低一個或多個成員的表達(dá)，檢測它們在p53 調(diào)控中的功能重疊度。3. 細(xì)胞在逆境應(yīng)激反應(yīng)中能量代謝的調(diào)控機(jī)制我們將在低氧和缺氧條件下研究細(xì)胞代謝的變化及其分子機(jī)制。利用不同的類型的細(xì)胞為模型，明確低氧和缺氧與細(xì)胞行為的關(guān)系，分離鑒定參與低氧和缺氧逆境中的能量代謝調(diào)控的關(guān)鍵因子分子并闡明其分子機(jī)制。(1) 揭示細(xì)胞在低氧或缺氧環(huán)境中能量代謝的變化比較分析細(xì)胞在低氧或缺氧環(huán)境中能量代謝的變化與細(xì)胞行為的關(guān)系，以及對 HIF1 信號通路和代謝調(diào)控相關(guān)的酶的調(diào)節(jié)作用。研究細(xì)胞在低氧和缺氧環(huán)境中的代謝變化。主要檢測氧化磷酸化水平，葡萄糖的轉(zhuǎn)運和酵解，糖原的合成和 ATP 的產(chǎn)生和利

30、用等；以及對低氧誘導(dǎo)因子(HIF1 )和下游靶基因如調(diào)控氧化磷酸化和糖酵解相關(guān)酶的活性和表達(dá)的變化和調(diào)控關(guān)系。從缺氧的另一方面，研究缺氧誘導(dǎo)ROS 產(chǎn)生過程中，對細(xì)胞損傷修復(fù)具有重要調(diào)節(jié)作用的APE/Ref-1 的作用和對代謝的調(diào)節(jié)。確認(rèn)缺氧誘導(dǎo)的ROS 是否引起APE/Ref-1的泛素化修飾，及該泛素化途徑是否通 過 p53-MDM2 通 路介導(dǎo) 。探討APE/Ref-1 可否被缺氧誘導(dǎo)的ROS 磷酸化，及ROS 清除劑是否具有抑磷酸化作用，并在此基礎(chǔ)上探討該作用是否為其泛酸化的前提。探究氧化應(yīng)激中APE/Ref-1 在低氧或缺氧環(huán)境中對細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)和調(diào)控機(jī)制的研究(2) 探究細(xì)胞在低

31、氧或缺氧環(huán)境中對細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，篩選鑒定在不同氧濃度條件下參與能量代謝的重要的蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶及泛素連接酶 蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶和泛素連接酶篩選：通過2D gel/DIGE 法篩選蛋白質(zhì)激酶。在常氧、正常低氧、低氧和無氧的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，提取細(xì)胞提取物，然后利用ATP-sepharose 親和層析柱子來分離、富集蛋白質(zhì)激酶。利用DIGE 技術(shù)在 2D 膠上分離顯示差異表達(dá)的蛋白質(zhì)激酶，用質(zhì)譜蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)來鑒定這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)激酶。 過表達(dá)篩選：構(gòu)建HRE(hypoxiaresponse element)-luciferase 報告基因，然后與蛋白質(zhì)激酶cDNA 表

32、達(dá)文庫、蛋白質(zhì)磷酸酶cDNA 表達(dá)文庫以及泛素連接酶cDNA 表達(dá)文庫共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過比較在常氧、正常低氧、低氧和無氧的細(xì)胞培養(yǎng)條件下luciferase 的表達(dá)差異來篩選能夠誘導(dǎo)激活HRE 的蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶以及泛素連接酶。 在細(xì)胞中瞬間過表達(dá)蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶以及泛素連接酶cDNA 表達(dá)文庫，然后在常氧、正常低氧、低氧和無氧的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞。然后利用乳糖產(chǎn)生的檢測報導(dǎo)系統(tǒng)來比較細(xì)胞中乳糖產(chǎn)生量的不同來篩選出能夠調(diào)節(jié)糖酵解的蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶和泛素連接酶。 在細(xì)胞中瞬間過表達(dá)蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶以及泛素連接酶cDNA 表達(dá)文庫，然后在常氧、正常低氧、低氧和無氧的條

33、件下培養(yǎng)這些細(xì)胞。用葡萄糖熒光類似物2-NBDG(2-N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino-2-deoxy-glucose) 來標(biāo)記細(xì)胞。比較2-NBDG 被轉(zhuǎn)運的不同來篩選能夠調(diào)節(jié)糖酵解的蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶和泛素連接酶。(3) 對參與低氧或缺氧環(huán)境中細(xì)胞能量代謝調(diào)控的蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶和泛素連接酶的信號通路和分子機(jī)制的研究通過 RNAi 技術(shù)，用這些候選基因的 siRNA 來敲低它們在細(xì)胞中的表達(dá)，在常氧、正常低氧、低氧和無氧的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞。然后檢測HRE-luciferase 的表達(dá)、乳糖的產(chǎn)生或?qū)?-NBDG轉(zhuǎn)運的影響來進(jìn)

34、一步核實這些候選基因是否參與了在低氧或缺氧環(huán)境中對細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)。如果數(shù)目太多，將會根據(jù)這些基因的具體情況分別挑選4-5個蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶、泛素連接酶做進(jìn)一步的生化功能研究。對于挑選的蛋白質(zhì)激酶，尋找它們參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑、作用底物以及作用底物的磷酸化位點。 作用底物被磷酸化后對底物的亞細(xì)胞定位、酶活性等等功能的影響。對于挑選的蛋白質(zhì)磷酸酶，同樣的要尋找它們作用的底物以及底物上被影響的磷酸化位點， 這些位點對底物的亞細(xì)胞定位、酶活性等的影響。對于挑選的泛素連接酶，通過Yeast-2-Hybrid ， TAP-tag (Tandem-affinity-purification) 方法

35、來幫助鑒定這些連接酶的底物。在這基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究泛素連接酶與它們蛋白質(zhì)底物的相互作用及調(diào)節(jié)(比如這種作用是否受其它蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后修飾(例如磷酸化)的調(diào)節(jié)) 。這些蛋白質(zhì)底物被泛素化后的命運(是被降解了還是影響它們的亞細(xì)胞定位還是其它影響)。 進(jìn)一步生化研究的候選蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶和泛素連接酶以及它們作用的底物，在細(xì)胞水平上將做進(jìn)一步的功能研究，探討它們的生化特性在不同氧濃度培養(yǎng)的條件下如何發(fā)生變化，這些變化與整個細(xì)胞的能量代謝變化之間的關(guān)系，包括氧的利用、糖的跨膜轉(zhuǎn)運、糖酵解的變化。4. 核受體 TR3 對細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)作用前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)利用高脂飼料分別喂養(yǎng)TR3 野生型和敲除型小鼠時，

36、TR3野生型小鼠在總脂肪含量、血液甘油三酯、游離脂肪酸、白色脂肪細(xì)胞大小等肥胖指標(biāo)上，都表現(xiàn)出高于TR3 敲除小鼠的表型。這些結(jié)果提示TR3 在機(jī)體脂肪代謝調(diào)控上發(fā)揮了一定的作用。此外， TR3 除了調(diào)節(jié)糖異生途徑外，還參與調(diào)控糖酵解、糖原分解和磷酸甘油的穿梭轉(zhuǎn)運。因此，我們將開展以下研究：(1) TR3 通過影響AMPK 通路調(diào)控糖代謝在前期實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在正常肝細(xì)胞中過表達(dá) TR3可以抑制AMPKa的 磷酸化水平；而用siRNA抑制TR3的表達(dá)，則AMPKa的磷酸化水平上升。但 是，AMPKa蛋白質(zhì)水平則不受影響，說明 TR3參與調(diào)控AMPK的磷酸化。同 時，我們發(fā)現(xiàn)TR3能與AMPKa

37、結(jié)合。因此，我們將進(jìn)一步研究TR3與AMPKa 的結(jié)合是如何調(diào)節(jié)AMPKa的活性并影響糖代謝穩(wěn)態(tài)的。(2) TR3 對脂肪代謝的調(diào)控作用在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)TR3 能與 STAT3 相互作用，而Leptin-STAT3 通路在脂肪代謝調(diào)節(jié)中起重要作用。我們將研究TR3 對 Leptin 刺激下 STAT3 轉(zhuǎn)錄激活活性的影響，闡明TR3 對于 Leptin 誘導(dǎo)下 STAT3 轉(zhuǎn)錄激活活性的調(diào)控作用。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)野生型小鼠肝臟中STAT3 的磷酸化水平低于敲除型小鼠。因此，我們將深入地分析TR3調(diào)控STAT3磷酸化的分子機(jī)制和信號通路。(3) TR3 的激動劑在調(diào)節(jié)糖脂代謝中的作用我們實驗室最

38、近從植物內(nèi)生真菌Dothiorell sp. 的菌絲中分離得到一種化合物，稱為cytosporone B(Csn-B) ，發(fā)現(xiàn)它能特異性結(jié)合到TR3 配體結(jié)合區(qū)，誘導(dǎo) TR3 蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，提高 TR3 的轉(zhuǎn)錄激活活性。動物實驗進(jìn)一步表明Csn-B還能在小鼠體內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖的生理功能。因此，我們將以Csn-B 作為母體結(jié)構(gòu)，人工合成大量的Csn-B 系列衍生物，從這些衍生物中篩選出有效的治療糖尿病的潛在藥物。同時， 通過小鼠模型研究該系列化合物在血糖和脂肪代謝中的獨特作用，為以TR3 為靶點的藥物篩選提供理論依據(jù)。研究目標(biāo)：1. 闡明 CKIP-1 、 TR3、 KZNF 等調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的關(guān)

39、鍵因子在不同逆境應(yīng)激反應(yīng)中調(diào)控能量代謝的分子機(jī)制；2. 揭示 p53 、 HIF1 、 AMPK 等應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子在不同逆境應(yīng)激反應(yīng)中參與細(xì)胞代謝調(diào)控的信號通路及相關(guān)分子機(jī)制。承擔(dān)單位：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所、中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所、廈門大學(xué)、浙江大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：朱玲玲學(xué)術(shù)骨干：田春艷、吳喬、夏總平、吳麗穎、于淼、陳航姿課題經(jīng)費比例：34%課題 3 ： 重要代謝調(diào)節(jié)因子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和調(diào)節(jié)機(jī)制研究內(nèi)容：細(xì)胞代謝的調(diào)控主要是通過蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用來實現(xiàn)的。因此， 對于在代謝調(diào)控中起重要作用的調(diào)節(jié)因子如能量感應(yīng)分子AMPK、 腫瘤抑制因子p53和

40、 Axin 等、葡萄糖轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白質(zhì)TNKS 等及其復(fù)合體的分子結(jié)構(gòu)研究將對我們深入了解并闡明這些蛋白質(zhì)分子及其復(fù)合體本身的調(diào)節(jié)機(jī)制以及在代謝調(diào)控信號通路網(wǎng)絡(luò)中相互作用的分子機(jī)理具有非常重要的意義。對于AMP 調(diào)節(jié)AMPK 活力的分子機(jī)理，特別是AMPK 三聚體全酶的活力調(diào)控機(jī)制目前仍待進(jìn)一步探討和闡明。除了作為能量的感應(yīng)分子來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)，AMPK能夠通過其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控細(xì)胞的生長水平，特別是AMPK 的激活可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長。然而， 關(guān)于 AMPK 調(diào)控細(xì)胞生長的機(jī)理還很不清楚。另外，越來越多的證據(jù)表明AMPK 在調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老和死亡方面也具有重要的作用。我們的研究結(jié)果

41、發(fā)現(xiàn)AMPK 可以通過影響Wnt 信號途徑來調(diào)控細(xì)胞周期，從而影響細(xì)胞的生長；體軸發(fā)育抑制因子Axin ( Axis inhibitor )和組蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶Tip60 都可以與AMPK 發(fā)生相互作用，并且AMPK 可以在 Axin 存在的條件下磷酸化Tip60 。我們之前的研究表明Tip60 參與 Axin 和 HIPK2( homeodomain-interacting protein kinase 2 )介導(dǎo)的p53 信號通路，來決定細(xì)胞在不同的DNA 損傷的情況下是進(jìn)行DNA 修復(fù)還是凋亡，因此，AMPK有可能是通過調(diào)節(jié)Tip60 的磷酸化來選擇性地調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長停滯或凋亡。此外，最

42、近的研究結(jié)果表明，TNKS 可以通過調(diào)節(jié)GLUT4 的外吐來調(diào)控葡萄糖的吸收， 因此在葡萄糖的轉(zhuǎn)運中起著重要的作用。通過對 TNKS 基因敲除小鼠的研究， 發(fā)現(xiàn)在這些小鼠中表現(xiàn)出能量消耗、脂肪酸氧化以及胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖利用效率增加。最新發(fā)表在Nature 上的研究結(jié)果和我們的研究結(jié)果都發(fā)現(xiàn)TNKS可以與體軸抑制因子Axin 結(jié)合，更令人感興趣的是我們發(fā)現(xiàn)Axin 可以介導(dǎo)AMPK 與 TNKS 的相互作用。因此， Axin/AMPK/TNKS 復(fù)合體結(jié)構(gòu)的研究對于揭示葡萄糖轉(zhuǎn)運的分子機(jī)制具有重要的意義。圍繞這些問題，我們將進(jìn)行以下研隨意編輯精品文檔究：1. AMPK活性調(diào)控的分子機(jī)制我們從大

43、鼠、果蠅、酵母等多個物種中分別克隆了不同來源的AMPK 、和 T三種亞基，構(gòu)建了各種包含激酶結(jié)構(gòu)域的長短各異的三聚體復(fù)合物，并嘗試進(jìn)行亞基的不同isoform或不同物種之間的排列組合，并進(jìn)行了初步品 體學(xué)研究，已經(jīng)獲得了一些 AMPK的晶體，并且正在進(jìn)一步優(yōu)化中。我們希望 能解析出AMPK異源三聚體全酶的晶體結(jié)構(gòu)，從原子水平上全面闡明AMPK的 激活機(jī)制。2. 參與葡萄糖轉(zhuǎn)運調(diào)控的蛋白質(zhì)復(fù)合體的分子結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)機(jī)制為了進(jìn)一步研究AMPK與TNKS的作用機(jī)制以及AMPK是否可以通過磷酸化TNKS以調(diào)節(jié)葡萄糖的轉(zhuǎn)運，我們擬進(jìn)行三個方面的研究：(1)確定AMPK調(diào)控TNKS的磷酸化位點。我們將用免疫共

44、沉淀的辦法純化比 較在Axin存在和缺失的情況下的 TNKS,應(yīng)用MALDI-TOF質(zhì)譜來確定TNKS 中AMPK的特異的磷酸化位點，并用定點突變結(jié)合Phospho-mapping 的方法 來驗證其磷酸化位點。(2)研究AMPK是否可以通過磷酸化TNKS來控制GLUT4或其它家族成員的細(xì) 胞定位和功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)葡萄糖的轉(zhuǎn)運，并闡明其具體的分子調(diào)節(jié)機(jī)制和信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)途徑。(3)共結(jié)晶AMPK、TNKS和Axin ,在Axin的存在下，分別取得 AMPK和無 活性的AMPK (dominant inactive mutant )與TNKS相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合 體晶體，從而闡明AMPK對TNKS的磷酸

45、化的位點以及磷酸化對 TNKS構(gòu)象造成的影響。3. AMPK代謝通路對細(xì)胞生長及死亡的調(diào)控機(jī)理(1)首先，我們將確定AMPK和Wnt信號通路之間的交互關(guān)系，AMPK是如何 影響Wnt信號通路的。我們擬通過應(yīng)用LUMIER (Luminescence-basedMammalian Interactome Mapping )的手段，檢測 AMPK或其下游靶點蛋白 質(zhì)與Wnt信號通路中的節(jié)點蛋白質(zhì)分子以及各種調(diào)節(jié)因子的蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相 互作用，并應(yīng)用免疫沉淀的方法加以驗證，從而明確AMPK調(diào)節(jié)Wnt信號途徑的分子機(jī)理，并在此基礎(chǔ)上探討能量代謝信號是如何通過 AMPK和Wnt信號途 徑來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和

46、細(xì)胞生長的。(2)由于細(xì)胞通常是通過多渠道、多方面的調(diào)控以達(dá)到一個有效、精確的效果， 因此，除了研究AMPK和Wnt信號通路之間的聯(lián)系，我們也將考察 AMPK是 否對其它如p53和細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子TGF等這些在細(xì)胞生長調(diào)控中起重要作 用的信號通路也存在調(diào)控作用，并且闡明 AMPK對這些信號通路的調(diào)節(jié)作用和 分子機(jī)制，從而得到一個相對全面的、具有整體性的能量代謝與細(xì)胞生長調(diào)控信 號通路之間的關(guān)系。(3)確定AMPK調(diào)控的Tip60的磷酸化位點。我們將用免疫共沉淀的辦法分別純化出在AMPK活性被激活或被抑制條件下的 Tip60 ,并且應(yīng)用MALDI-TOF 質(zhì)譜來確定 Tip60中AMPK的特異的

47、磷酸化位點，并用 定點突變結(jié)合 Phospho-mapping 的方法來驗證其磷酸化位點。AMPK在細(xì)胞凋亡中 確定Tip60的磷酸化對于Axin和HIPK2調(diào)控的p53信號通路的影響，探 討其在細(xì)胞生長停滯和細(xì)胞凋亡選擇中的作用，進(jìn)而探討隨意編輯精品文檔的作用和調(diào)控機(jī)制。(5) 闡明能量代謝信號、特別是能量的異常代謝通過能量感應(yīng)分子AMPK 調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號途徑和分子機(jī)理，并探討在腫瘤細(xì)胞中是否存在異常代謝的機(jī)制使得能量代謝信號通過AMPK 調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用被抑制，從而使腫瘤細(xì)胞得以異常增生。研究目標(biāo)：1. 闡明 AMPK 三聚體全酶的活性調(diào)節(jié)的分子機(jī)制；2. 闡明 AMPK 、 Axi

48、n 、 TNKS 之間相互作用的分子機(jī)制；3. 揭示 AMPK 通過 Wnt 、 Tip60 或其它信號通路調(diào)控細(xì)胞生長與死亡的分子機(jī)理。承擔(dān)單位：清華大學(xué)、廈門大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：吳嘉煒學(xué)術(shù)骨干：王志新、王洪睿、周海夢、丁鳳、尹震宇課題經(jīng)費比例：33%5各課題間的相互關(guān)系本項目將圍繞糖、脂代謝在細(xì)胞和機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制及細(xì)胞在不同環(huán)境因素(如低氧、能量缺乏或過剩等)刺激下糖脂代謝調(diào)控的機(jī)制及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在細(xì)胞和動物水平上開展以下研究：1. 闡明在不同的生理狀況和環(huán)境因素下機(jī)體和細(xì)胞調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運和脂肪代謝的分子機(jī)制；闡明在這些不同的條件下機(jī)體和細(xì)胞維持代謝穩(wěn)態(tài)的機(jī)理；闡明Axin 、 Cide

49、a 及與其相互作用的蛋白質(zhì)（復(fù)合體）調(diào)節(jié)糖脂轉(zhuǎn)運及代謝的分子機(jī)理，并揭示其生理功能。2. 探討細(xì)胞發(fā)生代謝異常的內(nèi)在因素和環(huán)境因素，從分子水平上揭示外來刺激如何通過影響調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子如p53 、 KRAB、 CKIP-1 、 TR3等的功能來調(diào)控代謝穩(wěn)態(tài)，并研究細(xì)胞異常增生影響代謝調(diào)控信號通路的分子機(jī)制，初步建立細(xì)胞異常增生和異常代謝之間相互影響的信號通路網(wǎng)絡(luò)。3. 重要代謝調(diào)節(jié)因子如能量感應(yīng)分子AMPK 、腫瘤抑制因子p53 和 Axin 、葡萄糖轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白質(zhì)TNKS等及其復(fù)合體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和調(diào)節(jié)機(jī)制。根據(jù)以上研究內(nèi)容，本項目共設(shè)置以下3個課題：課題 1. 糖脂轉(zhuǎn)運及其穩(wěn)態(tài)

50、調(diào)控的的分子機(jī)制。 系統(tǒng)研究糖、脂代謝的穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制，包括葡萄糖和脂肪的轉(zhuǎn)運機(jī)制、機(jī)體和細(xì)胞維持其糖、脂代謝處于相對穩(wěn)定狀態(tài)的分子機(jī)制。著重分離和鑒定參與葡萄糖轉(zhuǎn)運和脂肪肝形成的新基因和蛋白質(zhì)復(fù)合體，并研究這些蛋白質(zhì)（復(fù)合體）與其它蛋白質(zhì)（復(fù)合體）的相互作用。課題 2. 調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子調(diào)控能量代謝的分子機(jī)制。 研究機(jī)體和細(xì)胞在各種逆境因素下， 特別是低氧條件下能量代謝調(diào)控的機(jī)制，同時探討調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子對細(xì)胞代謝變化的影響以及調(diào)控這些變化的信號通路和反應(yīng)機(jī)制。課題 3. 重要代謝調(diào)節(jié)因子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和調(diào)節(jié)機(jī)制。以結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)為平臺， 研究重要代謝調(diào)節(jié)因子

51、如能量感應(yīng)分子AMPK 、 腫瘤抑制因子p53 和 Axin 、葡萄糖轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白質(zhì)TNKS、脂類代謝相關(guān)蛋白質(zhì)Cide、缺氧應(yīng)激因子HIF1等及其復(fù)合體的分子結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)機(jī)制，深入探索細(xì)胞通過這些節(jié)點蛋白質(zhì)感應(yīng)并調(diào)控糖、脂代謝穩(wěn)態(tài)的分子途徑。這 3個課題之間既有承上啟下的關(guān)系，又相互補充支持，從不同的角度研究細(xì)胞糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控的分子機(jī)理，構(gòu)成了一個相對完整的研究項目。四、年度計劃研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年1 .采用分子和細(xì)胞生物學(xué)手段，確 定在糖脂代謝中起重要作用的蛋 白質(zhì)及網(wǎng)絡(luò)通路，鎖定其中重要蛋 白分子深入研究。2 .構(gòu)建一系列參與糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào) 控的分子的表達(dá)載體，包括Axin、 TNKS

52、2、Cide、CKIP-1、AMPK、 KZNF家族成員等及新篩選到的 與這些分子相互作用的蛋白的表 達(dá)載體。3 .研究低/缺氧環(huán)境中細(xì)胞的代謝變 化情況，篩選低/缺氧條件卜差異 表達(dá)的蛋白質(zhì)激酶。4 .嘗試AMPK異源二聚體的晶體 學(xué)研究，對構(gòu)建的各種包含激酶結(jié) 構(gòu)域的長短各異的三聚體復(fù)合物 進(jìn)行結(jié)晶篩選和晶體優(yōu)化。1 .確定在糖脂代謝穩(wěn)態(tài)中起重要作 用的蛋白質(zhì)分子。2 .確定以上蛋白質(zhì)分子在糖脂代謝 中的通路，包括糖脂的儲存、水解、 吸收、分泌與轉(zhuǎn)運等。3 .獲得若干個可顯著調(diào)控 p53下游 細(xì)胞代謝相關(guān)靶基因及細(xì)胞學(xué)效 應(yīng)的KZNF家族成員。4 .明確TR3與AMPK、STAT3等相 互

53、作用的時空效應(yīng)。5 .確定在低/缺氧時細(xì)胞能量代謝 變化的特點，初步篩選到因氧濃度 不同面差異表達(dá)的蛋白激酶。6 .在SCI刊物上發(fā)表義章2-4篇。研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)1.研究Axin通過調(diào)節(jié)AMPK調(diào)控糖1.揭小Axin通過調(diào)節(jié)AMPK調(diào)控糖代謝穩(wěn)態(tài)的機(jī)理；研究 AMPK是代謝穩(wěn)態(tài)的機(jī)理。否可以通過磷酸化TNKS來控制GLUT4的轉(zhuǎn)運。2.確定糖脂代謝中起重要功能的蛋白質(zhì)的定位與轉(zhuǎn)位過程。2.嘗試對Axin、TNKS及AMPK復(fù)3.發(fā)現(xiàn)由Aurora-A 調(diào)控的 Wnt信合體進(jìn)行結(jié)晶。號通路的關(guān)鍵蛋白。3.建立Cide成員中多基因做除小4.明確CKIP-1基因?qū)χ炯?xì)胞等/、鼠以及組織特異性表達(dá)

54、轉(zhuǎn)基因小同類型細(xì)胞功能的調(diào)控作用。第鼠模型。5.在生化和細(xì)胞學(xué)水平明確KZNF4.研究糖脂代謝中起重要功能的蛋家族中的成員通過調(diào)控p53的功二白質(zhì)的定位與轉(zhuǎn)位過程。能調(diào)節(jié)糖脂代謝的機(jī)理。5.研究正常和高脂飲食下 CKIP-1缺6.初步闡明闡明TR3影響AMPK磷年失對糖脂代謝的影響。酸化的分子機(jī)理。6.研究KZNF家族中的成員通過調(diào)7.探討低/缺氧導(dǎo)致ROS積累后對控p53的功能調(diào)節(jié)糖脂代謝的機(jī)誘導(dǎo)APE/Ref-1泛素化的可能作理。用。7.研究TR3影響AMPK磷酸化的分8.初步篩選到能調(diào)控HRE的蛋白激子機(jī)理。酶。8.研究低/缺氧卜產(chǎn)生的 ROS對9.在SCI刊物上發(fā)表4-6篇論文。APE

55、/Ref-1泛素化的影響；篩選低/缺氧誘導(dǎo)激活HRE的蛋白激酶。研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)9.研究 Aurora-A 的異常表達(dá)對于Wnt信號通路關(guān)鍵蛋白的影響。第三年1 .研究基于 Axin、TNKS2 和 Kif3a 的復(fù)合體在調(diào)控 Glut4轉(zhuǎn)運中的 機(jī)理；2 .研究Cide家族在脂肪合成、脂肪 積累、脂肪分泌等過程中的作用；3 .繼續(xù) AMPK 及 AMPK-axin-TNKS 復(fù)合體的蛋白質(zhì)晶體研究。4 .探討 CKIP-1 在瘦素、JNK、AP-1、 AKT及NF- KB等代謝相關(guān)信號途 徑中的調(diào)控作用及機(jī)制。5 .在逆境應(yīng)激條件下，KZNF家族中 的成員與p53的動態(tài)變化及機(jī) 理。6 .闡明TR3通過