粗多糖含量測定方法學(xué)驗證

1、v1.0可編輯可修改粗多糖含量測定方法學(xué)研究資料一、儀器與試藥1二、方法的研究21 .檢測波長的測定22 .樣品及對照制備方法2三、方法學(xué)驗證31 .線性32 .精密度實驗43 .穩(wěn)定性實驗44 .重復(fù)性試驗55 .中間精密度實驗56 .準(zhǔn)確度試驗61v1.0可編輯可修改甚參顆粒粗多糖含量測定方法起草說明標(biāo)志性成分粗多糖含量測定的方法來源于保健食品功效成分檢測方法白鴻主編(中國中醫(yī)藥出版社)的第二法，該方法的原理是：多糖經(jīng)乙醇沉淀分離后，去除其他可溶性糖及雜質(zhì)的干擾，糖與硫酸在沸水浴中加熱脫水生成羥甲基吠喃甲醛(羥甲基吠喃糠醛)，再與慈酮縮合成藍綠色化合物，其顯色強度與溶液中糖的濃度成正比，在

2、625nm波長下比色測定。主要研究資料如下：一、儀器與試藥1、儀器(1)離心機(湘南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號 TD25-WS ;(2) 離心管：50ml;(3)水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司，型號 DK-S26);(4)旋渦混合器(DioCote , SA8);(5) SHIMADZU UV-1800 紫外可見光分光光度計；(6) JB760-68 石英比色皿(宜興市偉鑫儀器有限公司)；(7) TU-1901 雙光束紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；2、試藥(1)葡萄糖：廣州化學(xué)試劑廠，分析純，批號為 -1 ;(2)無水乙醇：西隴化學(xué)股份有限公司，分析純，批號為

3、160802 1 ;(3)慈酮：國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號為；(4)硫酸：廣州化學(xué)試劑廠，分析純，批號為 -1 ;(5)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：標(biāo)準(zhǔn)稱取干燥恒重的分析純級葡萄糖，加水溶解，并定容至50ml,此溶液1ml含10mg葡萄糖，用前稀釋100倍為使用液(ml)。(6)斌酮硫酸溶液(W/V):準(zhǔn)確稱取慈酮置于燒杯中，緩緩加入100ml 80陶酸溶解，溶解后呈黃色透明溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。（i）樣品顆粒：xxxxxt限公司提供。、方法的研究粗多糖含量測定的方法來源于保健食品功效成分檢測方法白鴻主編（中國中醫(yī)藥出版社）的第二法，本研究針對葡萄糖對照以及樣品的的吸光度進行檢測波長測定，如下所示:1

4、 .檢測波長的測定取葡萄糖對照品溶液、樣品溶液進行紫外光譜掃描，結(jié)果顯示對照品和樣品均在625nm波長附近有最大吸收。0 252OQ34L 2D9 67 400序號波長吸光度12序號波長吸光度12葡萄糖對照品紫外波長吸收圖甚參顆粒樣品溶液紫外波長吸收圖2 .樣品及對照制備方法（1）樣品提?。悍Q取混合均勻的固體樣品，置于 100ml容量瓶中，加水80ml左右，于沸水浴中加熱1小時，冷卻至室溫后補加水至刻度（ V1）,混勻后過濾，棄去初濾液，收集余 下濾液供沉淀粗多糖。（2）沉淀粗多糖：準(zhǔn)確吸取上濾液（或液體樣品）（V2）,置于50ml離心管中（或于15ml具塞離心管中），加入無水乙醇20ml （

5、或8ml）,混勻，于4c冰箱靜置4小時以上，以4000r/min離心5min ,棄去上清液，殘渣用 80% （V/V）乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上 清液，反復(fù)操作3次。殘渣用水溶解并定容至 10ml （V3）。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液 0ml、（相當(dāng)于葡萄糖0mg、） 置于10ml比色管中，補加水，加入蕉酮硫酸溶液6ml,在旋渦混合器上混勻，置沸水浴中加熱10min,取出，在流水中冷卻 20min后，用分光光度計在 625nn長處以試劑空白為參比， 1cm：匕色皿測定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（4）樣品測定：準(zhǔn)確吸取樣品待測液（含

6、糖量20100 pg）,按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟于625nn長下測定吸光度值并求出樣品含量。三、方法學(xué)驗證1 .線性取適量葡萄糖對照品，精密稱定，加水制成ml的葡萄糖對照品儲備溶液，分別精密吸取葡萄糖對照品儲備溶液 0ml，置于10ml比色管中，補加水，依法測定。得標(biāo)準(zhǔn)曲線儲備液。依法測定，分別制成含葡萄糖為0、（ig、（ig、g、g、g、g的溶液，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，葡糖糖對照品的含量 （為為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見下圖，其回歸方程為：y=+ （r=）,試驗表明葡萄糖對照品在0wg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。見表1。表1線性考察結(jié)果含量0（科g）吸光度（Y回歸方程y=+ r=粗多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如下:粗多

7、糖又照在0wg內(nèi)成良好的線性關(guān)系。2 .精密度實驗取一供試品溶液，連續(xù)測定6次，記錄吸光度，結(jié)果見表2。試驗結(jié)果 RStX% ( RSD =%, n=6),說明儀器精密度良好。表2儀器精密度試驗測定結(jié)果序號吸光度平均吸光度RS*73 .穩(wěn)定性實驗取同一樣品，按以下時間測定，記錄吸光度，結(jié)果見表3。表3粗多糖穩(wěn)定性試驗結(jié)果時間0min30min1h2h3h4h03313吸光度1hRSD（%）2hRSD（%）4hRSD（%）結(jié)果表明供試品溶液在顯色反應(yīng)完成后4小時內(nèi)穩(wěn)定。4 .重復(fù)性試驗取同一供試品，按供試品制備方法制備 6份供試品溶液，并按樣品及對照制備方法測定 粗多糖含量，結(jié)果見表 4。表4粗

8、多糖重復(fù)性試驗測定結(jié)果（單位：mg/100g）樣品編號123456含量（mg/100ml）348343335330335338平均含量338RSD （衿結(jié)果表明6份供試品溶液按照粗多糖的檢測方法測定重復(fù)性好。5 .中間精密度實驗取同一供試品（批號：150401）,由另一操作者于不同時間、不同儀器操作，按供試品制備方法制備6份供試品溶液，并按 樣品及對照制備方法 測定粗多糖含量，結(jié)果見表5。表5粗多糖中間精密度試驗測定結(jié)果（單位：mg/100g）標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果：含量0（科g）吸光度（Y 0回歸方程y=+ r=樣品測定結(jié)果：樣品編號123456含量（mg/100ml）294285297273297287平均含量289RSD （衿結(jié)果表明6份供試品溶液按照粗多糖的檢測方法測定進行的中間精密度實驗精密度良 好。6 .準(zhǔn)確度試驗采用加樣回收法，精密稱取本品（批號：150401,平均含量：338mg/100g,平均吸光度：） 各6份，按照樣品及對照制備方法 中制備得樣品待測液 6份，分別從6份待測液中吸取1ml 置于10ml比色皿中，再分別精密加入1ml 100難度的對照品溶液（濃度： ml）,依法進行測定，記錄吸光度，以吸光度計算回收率， 結(jié)果見表6。6份樣