基因克隆的技術(shù)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上基因克隆技術(shù)摘要：基因克隆技術(shù)是分子生物學(xué)的核心技術(shù)，其目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝，用于深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，并可達(dá)到人為改造細(xì)胞以及物種遺傳性狀的目的。本論文主要從以下幾個(gè)方面來介紹基因克隆技術(shù)：目的基因的獲得 、目的基因和載體的連接、重組分子的擴(kuò)增和鑒定。關(guān)鍵詞：目的基因；限制性內(nèi)切酶；克?。恢亟M分子ABSTRACT：Gene cloning technology is the core of molecular biology technology, its purpose is obtain a gene or DNA fragments o

2、f the copy, used for in-depth analysis the structure and function of genes, and may achieve human cells and the transformation of the species genetics purpose.This thesis mainly from the following several aspects to introduce gene cloning technology: the purpose of the gene for the purpose, genes an

3、d carrier, restructuring of the molecules connected amplification and identification.Keywords： purpose gene;restriction endonuclease;clone;restructuring molecules 基因克隆是70年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有革命性的研究技術(shù)，可概括為分、切、連、轉(zhuǎn)、選?！胺帧笔侵阜蛛x制備合格的待操作的DNA，包括作為運(yùn)載體的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特異的限制性內(nèi)切酶切開載體DNA，或者切出；“連”是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA

4、連接起來，形成重組的DNA分子；“轉(zhuǎn)”是指通過特殊的方法將重組的DNA分子送入中進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增；“選”則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個(gè)體?；蚩寺〖夹g(shù)包括把來自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達(dá)，從而產(chǎn)生和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。1. 目的基因的獲得目的基因是指所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因。獲得目的基因是分子克隆過程中最重要的一步?；蚬こ塘鞒痰牡谝徊骄褪谦@得目的DNA片段,。所需目的基因的來源, 不外乎是分離自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化學(xué)合成法、cDNA法及建立基

5、因文庫的方法來篩選11.1 PCR方法1.1.1 PCRPCR 是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA2。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）又稱無分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的

6、作用下可以變性解鏈成單鏈，在與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制3。 PCR由變性-退火（復(fù)性）-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至4060左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合

7、；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，于72左右，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)擴(kuò)增放大幾百萬倍4。1.1.2 RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）又稱為，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。其原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDN

8、A。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)4。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞/組織中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。1.1.3 realtime PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國applied biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)的PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，定量準(zhǔn)，等優(yōu)點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用5。所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入

9、熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)不僅廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域，而且也開始作為一種診斷手段應(yīng)用于獸醫(yī)臨床。其應(yīng)用涉及到的范圍包括病原體的檢測、基因表達(dá)的定量和等位基因的鑒定等多個(gè)領(lǐng)域6。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)是在帶透明蓋的塑料小管中，激發(fā)光可以直接透過管蓋，使其中的熒光探針被激發(fā)。熒光探針事先混合在PCR反應(yīng)液中，只有與DNA結(jié)合后，才能夠被激發(fā)發(fā)出熒光。隨著新合成目的DNA片段的增加，結(jié)合到DNA上的熒光探針，即被激發(fā)產(chǎn)生的熒光相應(yīng)增加3。Woo等11利用SYBR Green I作為熒光染料建立了一種

10、鑒定鉤端螺旋體的方法，利用熔點(diǎn)曲線分析來區(qū)別特異產(chǎn)物、引物二聚體和非特異性產(chǎn)物，不需要電泳來鑒定，該方法快速而敏感，整個(gè)過程在20 min內(nèi)完成。Jamest 51等應(yīng)用TaqMan探針建立了從小牛腹瀉糞便中定量檢測水源性寄生蟲小隱孢子蟲的C j基因和18S rRNA的方法。Frank等12建立了基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)RT-PCR方法，從感染馬傳染性貧血病毒(EIAV)的馬血漿中定量檢測EIAV的荷裁量，比競爭性RTPCR更省事，有更大的檢測范圍。1.2 基因組文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和篩選 將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化后插入到適當(dāng)載體中，得到含有不同插入片段的克隆載體，這種克隆載體的

11、混合物含有長短不同的基因組片段，這就是基因文庫。若將細(xì)胞內(nèi)所有mRNA均逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后將所有cDNA片段克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，構(gòu)建成含有不同cDNA片段的克隆載體混合物，這就是cDNA文庫。cDNA 的合成可用RT - PCR 法，也稱反轉(zhuǎn)錄PCR9。它是一種酶促合成法, 即以mRNA為模板, 在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下, 以4 種脫氧核苷三磷酸為材料合成DNA(cDNA), 再經(jīng)復(fù)制后即成雙鏈DNA。從真核生物中提取mRNA, 由于mRNA 后有100- 200 bp 的Poly(A), 用與Poly(A)互補(bǔ)的12- 18個(gè)核苷酸的Oligo (dT) 合成的一種組織中所有mRNA 對應(yīng)的c

12、DNA 第一鏈。然后使用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA 第一鏈末端加上多聚C, 經(jīng)變性和水解mRNA 后, 加入1 個(gè)末端為多聚G 的引物合成其互補(bǔ)鏈( 第二條鏈) , 再經(jīng)PCR 進(jìn)行大量擴(kuò)增。因?yàn)檎婧松锏幕蛴删幋a的外顯子和大量不編碼的內(nèi)含子兩種序列組成, 用這種方法得到的基因沒有內(nèi)含子, 不具有啟動(dòng)子和終止子, 所以缺乏功能活性。如果外接一段調(diào)節(jié)序列, 就能在受體細(xì)胞中表達(dá), 所以此法是克隆真核生物基因的有效方法7。自從1970 年Temin 等發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶以來,此法已廣泛應(yīng)用于人8、豬、田鼠、鴨子。當(dāng)獲得了基因組文庫或cDNA文庫，可以根據(jù)已知的信息合成特異性探針，采用核酸分子雜交的方法從文庫

13、中篩選感興趣的基因片段，這仍是目前獲得新基因的一種常用手段。1.3 化學(xué)合成法制備基因片段 采用DNA合成儀，對目的基因進(jìn)行分段合成，然后進(jìn)行連接，可以得到所需的目的基因?；瘜W(xué)合成法可以改變原始的基因序列，甚至可以合成自然界不存在的序列。在合成過程中可以根據(jù)需要改變的密碼子，如將真核基因序列中不易在E. coli中利用的稀有密碼子改成E. coli偏愛的密碼子，有利于真核基因在E. coli中的表達(dá)。2. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 DNA體外重組是將目的基因在DNA作用下，連接到合適的載體DNA上，以便下一步轉(zhuǎn)化之用。這種由兩種不同DNA片段重新組合而成的DNA稱重組DNA，簡稱重組體。重組的DNA分子

14、是在DNA連接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。 DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。 T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應(yīng)分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物；然

15、后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應(yīng)通常將兩個(gè)不同大小的片斷相連10。 很多DNA聚合酶在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)會(huì)在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA每條鏈的3端加上一個(gè)突出的堿基A。pUCm-T載體是一種已經(jīng)線性化的載體，載體每條鏈的3端帶有一個(gè)突出的T。這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進(jìn)行正確的AT配對，在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的重組載體。 連接反應(yīng)的溫度在37時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度

16、，即1216，連接1216h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。3. 重組分子的擴(kuò)增和鑒定3.1 重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 目的基因和載體在體外連接形成重組DNA分子后，需要被導(dǎo)入受體細(xì)胞中才能進(jìn)行增殖和（或）表達(dá)。接受重組DNA分子的細(xì)胞稱作受體細(xì)胞或宿主細(xì)胞。受體細(xì)胞分為原核細(xì)胞（如大腸桿菌）和真核細(xì)胞（如酵母、昆蟲細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞）。原核細(xì)胞可作為基因復(fù)制擴(kuò)增的場所，也可作為基因表達(dá)的場所；而真核細(xì)胞一般只用作基因表達(dá)系統(tǒng)。 受體細(xì)胞是重組基因增殖的場所，所以對受體細(xì)胞也應(yīng)具有幾點(diǎn)要求：容易接納重組DNA分子；對載體的復(fù)制擴(kuò)增無嚴(yán)格限制；不存在特

17、異的能降解外源DNA的內(nèi)切酶體；不對外源DNA進(jìn)行修飾。由于載體的不同，所具備的篩選標(biāo)志不同，所用的受體細(xì)胞也不同，因此可根據(jù)所用的載體選擇合適的受體細(xì)胞。一般將重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)化，而導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)染。未經(jīng)處理的大腸桿菌很難接受外源重組DNA分子，但經(jīng)物理或化學(xué)方法處理后，細(xì)菌對攝取外來DNA分子變得敏感了，這種經(jīng)處理而易接受外源DNA分子的細(xì)胞叫做感受態(tài)細(xì)胞。將重組DNA分子和感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞相混合，使重組DNA分子進(jìn)入大腸桿菌中，就可以實(shí)現(xiàn)重組DNA分子的轉(zhuǎn)化10。3.2 重組DNA分子的鑒定 重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后是否得到擴(kuò)增，擴(kuò)增后的重組DNA分

18、子是否正確，導(dǎo)入的重組DNA分子是否含有正確的插入片段，重組DNA分子能否表達(dá)插入的目的基因，一般可以采用以下幾種方法對重組DNA分子進(jìn)行鑒定。3.2.1. 篩選可根據(jù)所選用載體的特性，尤其是抗藥基因的存在與否進(jìn)行初步篩選。例如載體具有抗氨芐青霉素的抗性基因，若轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長，說明載體DNA被導(dǎo)入到了受體細(xì)胞中并且能夠擴(kuò)增繁殖。但這種篩選并不能說明目的基因一定連接到了載體上。但通過抗藥基因的失活篩選可以證明有外源基因插入。3.2.2. X-gal篩選有些載體為了方便篩選，根據(jù)細(xì)菌乳糖操縱子原理，將LacZ基因構(gòu)建到了載體的多克隆酶切位點(diǎn)處。如果目的基因連接成功，La

19、cZ基因?qū)⒂捎谀康幕虻牟迦攵Щ?，不能產(chǎn)生分解乳糖及其類似物的半乳糖苷酶，菌落在含有X-gal的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)白色，無目的基因插入的克隆菌落為藍(lán)色。根據(jù)這種特性，可以基本判斷重組成功與否。3.3.3. 酶切電泳鑒定將重組DNA分子提取出來，用特定內(nèi)切酶切割重組DNA分子并電泳。如果目的基因被成功地插入到了載體分子中，可以通過目的基因兩端的酶切位點(diǎn)將目的基因切割下來，經(jīng)糖凝膠電泳即可以判斷目的基因的存在與否，這是簡便而常用的鑒定方法。3.3.4. 序列分析經(jīng)過初步鑒定后的重組DNA分子往往需要進(jìn)行目的基因片段的DNA序列分析，通常采用多克隆酶切位點(diǎn)兩端的載體序列作為測序時(shí)引物的結(jié)合位點(diǎn)，即所謂的

20、通用引物。有關(guān)DNA序列分析技術(shù)將在有關(guān)章節(jié)詳細(xì)敘述。一般需要表達(dá)的目的基因都必須經(jīng)過DNA序列分析予以確認(rèn)。3.3.5. 其他方法如采用核酸分子雜交或菌落原位雜交鑒定重組DNA分子，或采用蛋白印跡方法直接檢測目的蛋白的表達(dá)情況。4. 一些常用試劑的配置 在實(shí)驗(yàn)過程中，需要配置一些試劑，如LB培養(yǎng)基，瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液等，具體配置方法如下13。4.1 LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)液、平板的配制配制每升LB培養(yǎng)液，應(yīng)在950ml去離子水中加入：細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物（bacto-yeastextract）5g細(xì)菌培養(yǎng)用胰化（bacto-tryptone） 10gNaCl 10g搖動(dòng)容

21、器直至溶質(zhì)完全溶解，用5mol/L NaOH(約0.2ml)調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1L，在高壓下蒸汽滅菌20min。LB平板的配制：先按上述配方配制液體培養(yǎng)基，臨高壓滅菌前加入糖15g/L，同法高壓蒸汽滅菌20min。從高壓滅菌器取出培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)輕輕旋動(dòng)以使熔解的瓊脂糖能均勻分布于整個(gè)培養(yǎng)基溶液中，應(yīng)使培養(yǎng)基降溫至50時(shí)，加入等不耐熱的物質(zhì)。4.2 瓊脂糖凝膠的配制根據(jù)所需凝膠的濃度稱取瓊脂糖，加入相應(yīng)電泳緩沖液中，用微波爐加熱煮沸至瓊脂糖完全溶解，加入適量TAE混勻，適當(dāng)冷卻后傾入凝膠鑄槽中，插入梳子，凝膠厚度不超過梳孔。4.3 電泳緩沖液 Tris-乙酸（TAE）：50&

22、#215;濃貯存液（每升）：242gTri堿57.1m、冰乙酸100ml、0.5mmol/L EDTA(pH8.0)使用時(shí)再稀釋50倍。 Tris-磷酸（TPE）：10×濃貯存液（每升）：108gTri堿15.5ml、85磷酸（1.679g/ml）40ml、0.5mmol/L EDTA(pH8.0)使用時(shí)再稀釋10倍。 Tris-硼酸（TBE）：5×濃貯存液（每升）：54gTri堿27.5g、硼酸20ml、0.5mmol/L EDTA(pH8.0）使用時(shí)再稀釋10倍。4.4 30丙烯酰胺： 將29g丙烯酰胺和1gN,N亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中，加熱至37溶解

23、之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。用Nalgene濾器(0.45孔徑)過濾除菌查證該溶液的pH值應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存于室溫。4.5 1mol/L CaCl2： 在200ml純水中（Milli-Q水或相當(dāng)級別的水）溶解54gCaCl2·6H2O，用0.22濾器過濾除菌，分裝成10ml小份貯存于20。 2.5mol/L CaCl2： 在20ml水中溶解13.5gCaCl2·6H2O，用0.22濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于20。4.6 1mol/L二硫蘇糖醇（）： 用20ml0.01mol/L乙酸鈉溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT，過濾除菌后分裝成1ml小份

24、貯存于20。4.7 0.5mol/LEDTA(pH8.0)： 在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na·H2O），在磁力上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，然后定容至1升，分裝后高壓滅菌備用。4.8 溴化乙錠（10mg/ml）： 在100ml水中加入1g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。4.9 10%十二烷基硫酸鈉（SDS）： 在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加入水定容至1L，分裝備用。5. 總結(jié)在分子生物學(xué)中，基因克隆是一

25、種常用的技術(shù)。其中關(guān)鍵技術(shù)是DNA重組技術(shù)，它利用酶學(xué)方法將不同來源的DNA分子進(jìn)行體外特異性切割，重新拼接組裝成一個(gè)新的雜合DNA分子。在此基礎(chǔ)上將雜合DNA分子轉(zhuǎn)入一定宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代分子，此過程稱基因克隆。有目的地通過基因克隆技術(shù)，人為操作改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過程總稱為基因工程。本論文主要介紹了基因克隆技術(shù)的幾個(gè)重要過程。參考文獻(xiàn)：1 薩姆布魯克J., E. F. 弗里奇, T. 曼尼阿蒂斯, 著.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南M.北京:科學(xué)出版社, 1999:60- 75.2 董明, 宮月華, 王蘭, 等.DNA 提取的應(yīng)用與相關(guān)技術(shù)分析J.遺傳, 2003, 25(2):205- 207.序列的方法, 故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。3 朱玉賢，李毅，鄭曉峰，著.現(xiàn)代