黑曲霉產(chǎn)檸檬酸工藝條件的優(yōu)化解析

1、生物與化學(xué)工程學(xué)院專業(yè)實驗報告題目 黑曲霉產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化 學(xué)生姓名： 王一 專業(yè)班級： 生物工程2012010302班 學(xué) 號： 1201815076 課程名稱： 發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)綜合實驗 指導(dǎo)教師： 李信義 日 期： 2013.6.2-2013.6.29 黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸工藝條件的優(yōu)化摘要：檸檬酸是生物體主要代謝產(chǎn)物之一，在自然界中分布很廣，主要存在于檸檬、柑橘、菠蘿、梅、李、梨、桃、無花果等果實中，尤以未成熟者含量居多。檸檬酸又名枸櫞酸,分子式為C6H8O7 ,物理性質(zhì)：無色透明或半透明晶體，或粒狀、微粒狀粉末，有強烈酸味，稍有澀味；極易溶于水，溶解度隨溫度的升高而增大?；瘜W(xué)性質(zhì)

2、：從結(jié)構(gòu)上講檸檬酸是一種三羧酸類化合物，加熱至175°C時它會分解產(chǎn)生二氧化碳和水，剩余一些白色晶體。檸檬酸是一種較強的有機酸，有3個H+ 可以電離；加熱可以分解成多種產(chǎn)物，與酸、堿、甘油等發(fā)生反應(yīng)。 同時檸檬酸，是重要的工業(yè)原料。可從植物原料中提取，也可由糖進行發(fā)酵制得。本實驗研究了不同接種量、溫度、PH、發(fā)酵有效體積、溶解氧對黑曲霉產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵的效率，已選出最適宜黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸的條件。關(guān)鍵詞：黑曲霉 檸檬酸 發(fā)酵條件 優(yōu)化Abstract：Citric acid is one of the main metabolites of the organism, is widely d

3、istributed in nature, mainly in lemon, orange, pineapple, peach, pear, plum, fig fruit, especially in the most immature content. citric acid or citric acid. Molecular formula is,physical properties: colorless transparent or translucent crystal, or granular, granular powder, although have strong sour

4、, slightly astringent. Easily soluble in water, the solubility increases with the increasing of temperature. Chemical properties: citric acid from the structure is a kind of three carboxylic acid compounds, heated to 175°C it will decompose to produce carbon dioxide and water, the remaining num

5、ber of white crystal. Citric acid is a strong organic acid, 3 ionization; heating can be decomposed into a variety of products, reacts with the acid, alkali, glycerin etc.同時檸檬酸，是重要的工業(yè)原料?？蓮闹参镌现刑崛。部捎商沁M行發(fā)酵制得。實驗研究了不同硫酸銨濃度分別對黑曲霉搖瓶發(fā)酵和實罐發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的影響。在菌濃度、發(fā)酵過程接種量、培養(yǎng)時間、溫度在發(fā)酵過程中的變化幾個方面對實罐和搖瓶發(fā)酵進行了相關(guān)比較。 At the

6、same time, citric acid, is an important industrial raw materials. It can be extracted from plant materials, can also be prepared by sugar fermentation. The experimental study of different inoculation quantity, temperature, PH, dissolved oxygen, fermentation volume on the efficiency of citric acid fe

7、rmentation of Aspergillus niter, has to choose the most suitable fermentation conditions of Aspergillus niter.Keywords：Aspergillus niter Citric acid Fermentation Conditions Optimization 目 錄1.綜述12.實驗儀器藥品材料及分析方法12.1實驗設(shè)備12.2實驗試劑及材料12.3菌株12.4分析方法13.實驗設(shè)計23.1培養(yǎng)基的制備23.2斜面種子和液體種子的制備23.3溫度對檸檬酸發(fā)酵的影響23.4溶解氧對檸檬

8、酸發(fā)酵的影響23.5接種量對產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵的影響23.6發(fā)酵液有效體積對產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵的影響33.7初始PH值對產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵的影響3 3.8檸檬酸的測定34.結(jié)果與分析34.1不同初始PH的檸檬酸產(chǎn)率34.2不同接種量的檸檬酸產(chǎn)率44.3不同溫度的產(chǎn)檸檬酸率54.4不同發(fā)酵液有效體積的產(chǎn)檸檬酸率64.5不同溶氧的產(chǎn)檸檬酸率7 4.6正交實驗及結(jié)果75.結(jié)論與展望8 5.1結(jié)論8 5.2展望86.參考文獻87.感受91.綜述 檸檬酸（citric acid）又名枸櫞酸。檸檬酸是生物有機體三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物之一，廣泛存在于自然界各種生物體中，特別是在檸檬、柑橘、菠蘿、李、梅、桃等果實中含量較高，

9、某些植物的葉子如煙葉，以及動物的肌肉、唾液中也含有檸檬酸。檸檬酸是現(xiàn)在以生物化學(xué)方法生產(chǎn)產(chǎn)量最大的有機酸，也是世界上應(yīng)用最廣泛的有機酸。因其無毒、具有溫和爽快的酸味，水溶性好、酸味適度、易被吸收和價格低廉等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，占食品酸味劑用量的 60以上。主要被用作酸味劑（與檸檬酸鈉并用使酸味更加柔和，主要用于果汁、果凍、果醬、水果糖、冰棒、雪糕、食品、糕點等）、增溶劑、緩沖劑、抗氧化劑、除腥脫臭劑、風(fēng)味增進劑、膠凝劑、調(diào)色劑，番茄、豆類、胡蘿卜等蔬菜罐頭的 pH 調(diào)節(jié)劑等。檸檬酸作為重要的食品酸味劑除了能改善食品風(fēng)味外，還兼有抑制微生物生長、護色、改善黏度和流變性等作用。而且在醫(yī)藥

10、、飼料、化工、電子、紡織、石油、皮革、建筑、攝影、塑料、鑄造和陶瓷等工業(yè)領(lǐng)域也都有十分廣闊的應(yīng)用。 為了給黑曲霉檸檬酸發(fā)酵創(chuàng)造好的條件，本實驗研究了玉米粉凊液發(fā)酵的工藝條件。并為黑曲霉檸檬酸補料發(fā)酵打下了基礎(chǔ)。本實驗利用搖瓶發(fā)酵在實驗室采用單因子實驗和正交實驗研究了黑曲霉 Wsy-03 的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成（包括碳源，氮源），并對影響黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的發(fā)酵溫度、發(fā)酵初始 pH 及過程中 pH的控制、發(fā)酵接種量進行了研究，利用小型自控發(fā)酵罐對發(fā)酵溶解氧對黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的影響形成進行了系統(tǒng)研究，以尋求最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵控制條件，同時檸檬酸的補料發(fā)酵的研究提供可靠依據(jù)和堅實基礎(chǔ)。2.實驗儀器藥品

11、材料及分析方法2.1實驗設(shè)備 電子天平、生化培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫水浴鍋、堿式滴定管、離心機、搖床、電磁爐、酸度計。2.2實驗試劑及材料 NaOH溶液、葡萄糖、瓊脂、酚酞、玉米粉、Na2SO4、污水乙醇、蒸餾水、鹽酸、碘液、-淀粉酶、甲醇、（NH4）2SO4、MgSO4、KH2PO4。2.3 菌株 以檸檬酸主要生產(chǎn)菌株黑曲霉(Aspergillus niger)作為實驗菌株。2.4分析方法 通過改變發(fā)酵條件，最后測定產(chǎn)酸率確定各因素溫度、PH、溶氧、裝料系數(shù)、接種量等單因素的最佳發(fā)酵條件。本次實驗通過改變溫度、PH、溶氧、裝料系數(shù)、接種量等條件在搖床中發(fā)酵培養(yǎng)黑曲霉，并最終測定檸檬酸產(chǎn)率

12、確定最優(yōu)發(fā)酵條件。五種單因素實驗都分別取五個相鄰的條件作為對比，每個條件都做三個平行實驗求平均值。3.實驗設(shè)計3.1培養(yǎng)基制備（1）馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：將新鮮土豆洗凈去皮，稱取100g切塊，加入500ml蒸餾水，在白瓷缸中煮沸約20min，用8層紗布過濾，取濾液，加蒸餾水補溶液至500ml。將濾液繼續(xù)加熱，并加入10g葡萄糖，10g瓊脂。待瓊脂融化，即可。 （2）玉米淀粉培養(yǎng)基：將市售玉米粉經(jīng)50目標(biāo)準(zhǔn)分樣篩處理后，取30g玉米粉加入到250ml錐形瓶中，加入蒸餾水100ml，甲醇4.5ml，（NH4）2SO4 0.3g、MgSO4 0.075g、KH2PO4 0.3g，-淀粉酶0.5g。于7

13、0液化15min后用0.1%碘液檢測不顯藍色或極微淡藍色，即糖化完全。四層紗布過濾于250ml三角瓶即得糖化清液。3.2斜面種子和液體種子的制備 將冰箱保存的黑曲霉斜面菌種轉(zhuǎn)接到斜面活化PDA培養(yǎng)基上，37恒溫箱中培養(yǎng)2-3天，此時培養(yǎng)基上長滿大量黑色孢子的黑曲霉菌落，即為試管斜面活化。將已滅菌好的液體種子培養(yǎng)基拿到無菌室進行接種，用酒精燈燒過的接種環(huán)輕輕刮下3-5環(huán)孢子，接種到已冷卻好的液體種子培養(yǎng)基內(nèi)，包扎好后搖床28、200r/min培養(yǎng)24h，進行種子搖床培養(yǎng)。3.3溫度對檸檬酸發(fā)酵的影響 在無菌的條件下，用10ml的無菌移液管吸取10ml的液體種子，轉(zhuǎn)入已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30,

14、32,34,36，38條件下，設(shè)定轉(zhuǎn)速為200r/min，發(fā)酵時間為72h，進行搖床發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵完成后，測定不同的溫度條件下發(fā)酵液中檸檬酸的含量，確定檸檬酸發(fā)酵的最適溫度。3.4溶解氧對檸檬酸發(fā)酵的影響 在無菌條件下，用10ml的無菌移液管吸取10ml的液體種子，轉(zhuǎn)入已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在34調(diào)節(jié)不同的轉(zhuǎn)速，分別為150r/min,200r/min,250r/min,300r/min，350r/min，設(shè)定發(fā)酵時間為72h，發(fā)酵完成后測定不同轉(zhuǎn)速下發(fā)酵液中檸檬酸的含量，從而確定檸檬酸發(fā)酵的最佳轉(zhuǎn)速。3.5接種量對檸檬酸發(fā)酵的影響 在無菌的條件下，保持其他條件不變，分別以6%，8%，10%，

15、12%，14%接種量吸取液體種子到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在34下，設(shè)定轉(zhuǎn)速為300r/min，發(fā)酵時間為72h。發(fā)酵完成后測定不同的接種量條件下發(fā)酵液中檸檬酸的含量，確定檸檬酸發(fā)酵的最適接種量。3.6發(fā)酵液有效體積對檸檬酸發(fā)酵的影響 將搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)配至最適培養(yǎng)基組成及最適pH值后滅菌。在無菌操作下，用無菌移液管吸取5ml,7.5ml,10ml,12.5ml.15ml的液體種子，分別轉(zhuǎn)接入已調(diào)配好的發(fā)酵培養(yǎng)基即50ml，75ml，100ml，125ml，150ml中。在34下，設(shè)定轉(zhuǎn)速為300r/min，發(fā)酵時間為72小時進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵完成后，測定在不同的發(fā)酵液有效體積條件下發(fā)酵液中檸檬酸的含量

16、，確定在最適培養(yǎng)基組成下的最適發(fā)酵液有效體積。3.7初始PH值對檸檬酸發(fā)酵影響 調(diào)整搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6.2,6.5,6.8,7.1,7.4后進行高壓蒸汽滅菌。在無菌操作下，用無菌移液管吸取10ml的液體種子，在34，設(shè)定轉(zhuǎn)速為300r/min，發(fā)酵時間為72h，發(fā)酵完成后測定不同的初始pH值條件下發(fā)酵液中檸檬酸的含量，確定檸檬酸發(fā)酵的最適初始pH值。3.8檸檬酸的測定取5ml發(fā)酵液，離心取上清液，精確吸取4ml，加入100ml錐形瓶中，加入2-3滴0.1%酚酞指示劑，用0.1429 molL進行滴定，滴定至微紅色，平行滴定3次，記錄平均消耗NaOH的體積。滴定1ml樣品液

17、，每消耗1ml0.1429mol/LNaOH時的溶液為1%酸度，也即為發(fā)酵液產(chǎn)酸率（%）4.結(jié)果與分析4.1不同初始PH的檸檬酸產(chǎn)率 實驗室內(nèi)的搖床三角瓶發(fā)酵，調(diào)節(jié)合適的發(fā)酵初始 pH 值十分重要。特別是像檸檬酸發(fā)酵這種以淀粉作為發(fā)酵原料的發(fā)酵，發(fā)酵液初始 pH 的高低會直接影響到菌體糖化酶的活力，由于檸檬酸發(fā)酵是以玉米粉為原料的發(fā)酵過程，屬于邊糖化邊生長邊產(chǎn)酸的過程。初始 pH 值過低，會直接導(dǎo)致糖化酶活性低，淀粉不能完全水解，同時較低發(fā)酵 pH 值，會生成亞鐵氰化物，該化合物對黑曲霉菌體的生長有毒害作用。反之如果發(fā)酵液初始 pH 值較高，會使發(fā)酵過程中草酸和葡萄糖酸大量積累，使發(fā)酵液中雜酸

18、含量過高。不同發(fā)酵液初始 pH 值對檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響，見表1、圖1。表1.不同初始PH值的檸檬酸產(chǎn)率初始PH發(fā)酵液產(chǎn)酸率（%）6.20.126.50.176.80.237.10.217.40.18圖1. 由表1.圖1.可以看出，黑曲霉在進行檸檬酸發(fā)酵時，只有發(fā)酵液初始PH為6.8 時，產(chǎn)酸率最高。如果發(fā)酵液初始PH調(diào)節(jié)過高或者過低時，都會對最后的產(chǎn)酸率有影響。究其原因主要是，PH6.8與糖化酶的活性最高PH值基本一致，如果起始PH低于糖化酶的作用最適范圍，會使得發(fā)酵原料得不到充分利用，進而影響最終產(chǎn)酸率。反之如果發(fā)酵液初始PH過高，則黑曲霉菌絲球會出現(xiàn)老化現(xiàn)象，提前進入衰老期，如果初始發(fā)酵

19、PH值更高還會引起菌體自溶。所以，發(fā)酵液初始最適PH值為6.8。4.2不同接種量的檸檬酸產(chǎn)率 檸檬酸發(fā)酵接種量多少，直接影響著檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)酸量的多少。發(fā)酵初始接種菌絲球數(shù)量如果太少，則在發(fā)酵過程中，發(fā)酵動力不夠，影響糖酸轉(zhuǎn)化率。如果接入的菌絲球量太多，則菌絲球成球效果不理想，會使發(fā)酵液濃度增大，影響溶氧使產(chǎn)率下降。所以研究發(fā)酵接種量對檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)酸的影響較大，不同接種量對檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)酸的影響見表2、圖2。表2.不同接種量的檸檬酸產(chǎn)率接種量（ml）發(fā)酵液產(chǎn)酸率（%）60.1480.19100.25120.22140.18圖2.由表2.圖2可見，黑曲霉發(fā)酵檸檬酸時，接種量在10%以下，這時產(chǎn)酸量會

20、隨接種量的提高而增加，但是如果發(fā)酵接種量超過10%以上還繼續(xù)增加接種量，產(chǎn)酸反而會隨著發(fā)酵接種量的增加而降低。所以在試驗中控制發(fā)酵接種量在10%左右即可以達到較好的發(fā)酵結(jié)果。4.3不同溫度的產(chǎn)檸檬酸率由于酶活受溫度的影響也十分明顯，所以合適的發(fā)酵溫度對產(chǎn)物的積累十分重要。在檸檬酸發(fā)酵過程中，如果發(fā)酵溫度過低則糖化酶的活性低，難以完成對原料的轉(zhuǎn)化，使菌體生長緩慢。但是如果發(fā)酵溫度過高，容易引起菌體老化過快發(fā)酵后勁不足、雜酸如草酸的積累過多等現(xiàn)象。不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵產(chǎn)酸的結(jié)果見表3、圖3.表3.不同溫度的產(chǎn)檸檬酸率溫度（）發(fā)酵液產(chǎn)酸率（%）300.13320.15340.20360.12380.1

21、0圖3.由表3.圖3.可以看出，發(fā)酵溫度對黑曲霉產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵影響較大。溫度低于 34時，產(chǎn)酸率會隨溫度的升高有所提高。而當(dāng)發(fā)酵溫度高于34以后，高溫導(dǎo)致呼吸作用加強從而致使菌體形成過量，造成菌體過早進入衰老期，影響糖酸轉(zhuǎn)化率。所以綜合考慮菌體生長、產(chǎn)酸率等各個方面，黑曲霉的發(fā)酵溫度應(yīng)控制在34為宜。4.4不同發(fā)酵液有效體積的產(chǎn)檸檬酸率 不同的發(fā)酵液有效體積對黑曲霉菌體的生長和發(fā)育有很大的影響，從黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸的過程分析如果發(fā)酵液有效體積過小會因營養(yǎng)成分不夠影響菌體生長和發(fā)育，如果發(fā)酵液的有效體積過大會影響溶解氧也會影響黑曲霉的產(chǎn)酸率。表4.不同有效體積的產(chǎn)檸檬酸率發(fā)酵液有效體積（ml）發(fā)酵

22、液產(chǎn)酸率（%）500.28750.251000.201250.171500.10圖4. 由表4.圖4.看出，發(fā)酵液有效體積對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸呈反比，有效體積越大，產(chǎn)檸檬酸率越低。當(dāng)發(fā)酵液有效體積在50ml的時候，黑曲霉產(chǎn)檸檬酸最多。其根本原因可能是裝料的體積越多，發(fā)酵瓶內(nèi)的體積較小，不利于菌種的發(fā)酵，導(dǎo)致產(chǎn)酸率較低。但考慮到節(jié)省成本，所以最終確定發(fā)酵液的有效體積最優(yōu)的是100ml。4.5不同溶氧的產(chǎn)檸檬酸率黑曲霉是好氧菌,它的溶氧水平是其合成代謝的關(guān)鍵。在搖瓶發(fā)酵階段,影響溶氧水平的主要因素就是搖瓶的轉(zhuǎn)速。不同的發(fā)酵液的溶氧量對檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響，見表5、圖5.表5.同溶氧的產(chǎn)檸檬酸率轉(zhuǎn)速

23、（r/min）發(fā)酵液產(chǎn)酸率（%）1500.102000.142500.193000.233500.25圖5.由表5.圖5.結(jié)果可知,搖床轉(zhuǎn)速在350r/min的時候黑曲霉產(chǎn)檸檬酸最多。由于常規(guī)搖床轉(zhuǎn)速受到一定的限制,如果再提高轉(zhuǎn)速,瓶內(nèi)震動的過于劇烈,可能產(chǎn)生意外,不宜再提高速,所以在設(shè)備條件有限的情況下300r/min是一個比較理想的攪拌速度,發(fā)酵菌可以最大程度獲得溶氧。黑曲霉是好氧菌,它的溶氧水平是其合成代謝的關(guān)鍵。在搖瓶發(fā)酵階段,影響溶氧水平的主要因素就是搖瓶的轉(zhuǎn)速。4.6正交實驗及結(jié)果在上述單因素實驗的基礎(chǔ)上，可知溫度和溶氧對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸過程有很大的影響，所以我們決定以溫度和溶氧

24、進行了正交試驗。我們需特別要求在發(fā)酵過程中控制好發(fā)酵溫度，其次是控制好溶氧。優(yōu)化的工藝條件為34和300r/min，最終檸檬酸的產(chǎn)量為0.23%，說明該條件為最佳的發(fā)酵工藝條件。5.結(jié)論與展望5.1結(jié)論 本文以玉米粉為原料對黑曲霉檸檬酸發(fā)酵過程進行了研究,不僅對發(fā)酵過程有了更深入的認識,而且取得了良好的優(yōu)化結(jié)果。 實驗分別從考察溫度、PH、接種量、溶氧、發(fā)酵液有效體積與產(chǎn)酸之間的相關(guān)特性對黑曲霉發(fā)酵過程有了初步的了解,通過對各個參數(shù)的相關(guān)性進行分析,確定了對黑曲霉發(fā)酵過程的控制策略,即在250ml錐形瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)溫度控制在34；PH控制在6.8、攪拌速度控制在350r/min、接種量控制在10%、發(fā)酵液有效體積控制在50ml，黑曲霉產(chǎn)檸檬酸產(chǎn)率最高。5.2展望 提高代謝產(chǎn)物積累的方法不勝枚取,但無外乎兩方面,首先是菌種改良,特別是隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,比如轉(zhuǎn)基因技術(shù),它在提升菌種品種方面可以菌種有質(zhì)的飛躍,但是我國檸檬酸生產(chǎn)企業(yè)比較分散,規(guī)模有大有小,科研實力參差不齊,和西方一些國際檸檬酸生產(chǎn)巨頭相比還有較大差距,但這并不代表傳統(tǒng)的分離純化已經(jīng)失去了地位,相反,分離純化目前仍然是大部分企業(yè)的基礎(chǔ)性工作,無可替代,因為菌種經(jīng)過幾代培養(yǎng)后,各項性能都會衰退,所以必須對已經(jīng)退化的菌株進行淘汰,保持優(yōu)良菌種,而且本實驗已經(jīng)證明菌種分離純化仍然可以顯著提高檸檬酸產(chǎn)量,這是最經(jīng)濟,最