高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用HPLCMS實驗含思考題

1、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）的各種模式探索一、實驗?zāi)康?、了解LC-MS的主要構(gòu)造和基本原理；2、學(xué)習(xí)LC-MS的基本操作方法；3、掌握LC-MS的六種操作模式的特點及應(yīng)用。二、實驗原理1、液質(zhì)基本原理及模式介紹液相色譜-質(zhì)譜法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）將應(yīng)用范圍極廣的分離方法液相色譜法與靈敏、專屬、能提供分子量和結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜法結(jié)合起來，必然成為一種重要的現(xiàn)代分離分析技術(shù)。但是，LC是液相分離技術(shù)，而MS是在真空條件下工作的方法，因而難以相互匹配。LC-MS經(jīng)過了約30年的發(fā)展，直至采用了大氣壓離子化技術(shù)（Atmos

2、pheric pressure ionization，API）之后，才發(fā)展成為可常規(guī)應(yīng)用的重要分離分析方法?，F(xiàn)在，在生物、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)和環(huán)境等各個領(lǐng)域中均得到了廣泛的應(yīng)用，在組合化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的研究工作中，LC-MS已經(jīng)成為最重要研究方法之一。質(zhì)譜儀作為整套儀器中最重要的部分，其常規(guī)分析模式有全掃描模式（Scan）、選擇離子監(jiān)測模式（SIM）。（一）全掃描模式方式（Scan）：最常用的掃描方式之一，掃描的質(zhì)量范圍覆蓋被測化合物的分子離子和碎片離子的質(zhì)量，得到的是化合物的全譜，可以用來進(jìn)行譜庫檢索，一般用于未知化合物的定性分析。實例：（Q1 = 100-259m/z）（二）選擇離

3、子監(jiān)測模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是連續(xù)掃描某一質(zhì)量范圍，而是跳躍式地掃描某幾個選定的質(zhì)量，得到的不是化合物的全譜。主要用于目標(biāo)化合物檢測和復(fù)雜混合物中雜質(zhì)的定量分析。實例：（Q1 = 259m/z）本實驗采用三重四極桿質(zhì)譜儀（Q1：質(zhì)量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3：質(zhì)量分析器），由于多了Q2、Q3的存在，在分析測試的模式上又多了四種選擇：（三）子離子掃描模式（Product Scan）：第一個質(zhì)量分析器固定掃描電壓，選擇某一質(zhì)量離子（母離子）進(jìn)入碰撞室，發(fā)生碰撞解離產(chǎn)生碎片離子，第二個質(zhì)量分析器進(jìn)行全掃描，得到的所有碎片離子都是由選定的母離子產(chǎn)生的子

4、離子，沒有其它的干擾。主要用于化合物結(jié)構(gòu)分析。實例：（Q1 = 259m/z；Q3 = 100-259m/z）（四）母離子掃描模式（Precursor Scan）：第一個質(zhì)量分析器掃描電壓選擇母離子（如分子離子），進(jìn)入碰撞室碰裂后，第二個質(zhì)量分析器固定掃描電壓，只選擇某一特征離子質(zhì)量，該特征離子是由所選擇的母離子產(chǎn)生的，由此得到所有能產(chǎn)生該子離子的母離子譜。主要用于同系物的分析。實例：（Q1 = 100-300m/z；Q3 = 259m/z）（五）中性丟失掃描模式（Neutral Loss）：第一個質(zhì)量分析器掃描所有離子，所有離子進(jìn)入碰撞室碎裂后，第二個質(zhì)量分析器以與第一個質(zhì)量分析器相差固定質(zhì)

5、量聯(lián)動掃描，檢測丟失該固定質(zhì)量中性碎片（如質(zhì)量數(shù)15、18、45）的離子對，得到中性碎片譜。主要用于中性碎片的分析。實例：（Q1 = 100-300m/z；Q3 = 82-282m/z）（六）多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）：第一個質(zhì)量分析器選擇一個（或多個）特征離子，經(jīng)過碰撞解離，到達(dá)第二個質(zhì)量分析器再進(jìn)行選擇離子檢測，只有符合特定條件的離子才能被檢測到，因為是兩次選擇，比單四極質(zhì)量分析器的SIM方式選擇性、排除干擾能力、專屬性更強，信噪比更高。主要用于定量分析。實例：（Q1 = 259m/z；Q3 = 138m/z）2、實驗內(nèi)容簡介鄰苯二甲酸酯(簡稱PAEs)是一類重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，常被用作

6、塑料的增塑劑，也可用作農(nóng)藥載體。近年來，隨著工業(yè)生產(chǎn)和塑料制品的廣泛使用，鄰苯二甲酸酯不斷進(jìn)入環(huán)境，普遍存在于土壤、底泥、大氣、水體和生物體等環(huán)境樣品中，成為環(huán)境中無所不在的污染物。據(jù)報道，鄰苯二甲酸酯類具有較弱的環(huán)境雌激素成分，具有影響生物體內(nèi)分泌和導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖的作用。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是指能改變機體內(nèi)分泌功能，并對機體、后代或（亞）種群產(chǎn)生有害效應(yīng)的環(huán)境物質(zhì)。由于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對人和動物有種種不良影響，對環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究已成為國際關(guān)注的焦點。我國也正在逐漸重視有關(guān)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究。三、儀器與試劑1、儀器液相系統(tǒng)：Varian Pro Star；自動進(jìn)樣器：Varian 410

7、自動進(jìn)樣器；質(zhì)譜儀：Varian 310 LC-MS/MS三重四極桿質(zhì)譜儀（ESI離子源）；色譜柱：Varian Inertsil 3 ODS-3（150mm×2mm，3m）。2、試劑甲醇：HPLC色譜純；超純水：Millipore Express超純水系統(tǒng)制備；標(biāo)準(zhǔn)溶液：用甲醇配制鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1ppm）。四、實驗步驟1、條件設(shè)置色譜條件：流動相（90%甲醇+10%水）；流速（0.2ml/min）；掃描時間（7min）；離子源模式：電噴霧電離（ESI），正離子模式；掃描條件：Detector：10

8、00V；Needle：5000V；Shield：600V；Spray Chamber Temperature：50；Nebulizing Gas Pressure：55psi；Drying Gas Pressure：18psi，Drying Gas Temperature ()：250，Capilary Voltage 30(V)，Coll.Energy 30(v)；質(zhì)量分析器：三重四極桿；進(jìn)樣體積：10ul。2、實驗測定按實驗操作規(guī)程完成儀器開機、參數(shù)設(shè)置及測定。根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)，設(shè)置m/z，選擇各種掃描模式（全掃描、選擇離子掃描、子離子掃描、母離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測模式）進(jìn)行測定。3、數(shù)據(jù)處

9、理表1 待測物質(zhì)的母離子和主要子離子DMPDEPDBP母離子（m/z）195.1223.1279.1子離子（m/z）163.1149.1149.1（一）全掃描模式方式（Scan）：（二）選擇離子監(jiān)測模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：（三）子離子掃描模式（Product Scan）：（四）母離子掃描模式（Precursor Scan）：（五）多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）：4、思考題1、各掃描模式中m/z分別如何設(shè)定？（一）全掃描模式方式（Scan）：100-300m/z;（二）選擇離子監(jiān)測模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：279m/z;

10、（三）子離子掃描模式（Product Scan）：Q1=279m/z,Q2=100-279m/z;（四）母離子掃描模式（Precursor Scan）：Q1=149-300m/z ,Q2=149m/z;（五）多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）：Q1=279m/z,Q2=149m/z;2、比較各模式的測定結(jié)果，討論各模式在測定中的作用。（一）全掃描模式方式（Scan）：掃描的質(zhì)量范圍覆蓋被測化合物的分子離子和碎片離子的質(zhì)量，得到的是化合物的全譜，一般用于未知化合物的定性分析。（二）選擇離子監(jiān)測模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：跳躍式地掃描某幾個選定的質(zhì)量，得到的不是化合物的全譜。主要用于目標(biāo)化合物檢測和復(fù)雜混合物中雜質(zhì)的定量分析。（三）子離子掃描模式（Product Scan）： 對碰撞解離產(chǎn)生碎片離子，第二個質(zhì)量分析器進(jìn)行全掃描，得到的所有碎片離子都是由選定的母離子產(chǎn)生的子離子，沒有其它的干擾。主要用于化合物結(jié)構(gòu)分析。（四）母離子掃描模式（Precursor Scan）： 第一個質(zhì)量分析器根據(jù)某一特征離子質(zhì)量掃描電壓，確定該特征離子是由哪種所選擇的母離子產(chǎn)生的，由此得到所有能產(chǎn)生該子離子的母離子譜。主要用于同系物的分析。（五）多反應(yīng)監(jiān)測