流式細(xì)胞儀操作規(guī)程sop

1、流式細(xì)胞儀操作規(guī)程目錄1：淋巴細(xì)胞亞群測定2：HLA-B27測定3：CD55CD59測定4：血小板抗體測定5：紅細(xì)胞抗體測定6：粒細(xì)胞抗體測定 7：白血病免疫分型測定8：淋巴細(xì)胞T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子IFN-/IL-4測定9：XL操作步驟淋巴細(xì)胞亞群測定(流式細(xì)胞儀) 醫(yī)院檢驗(yàn)科操作規(guī)程文件號：200 年 月 日起實(shí)施第1版(共3頁) 本規(guī)程每2年復(fù)審一次 復(fù)審日期： 年 月 日 復(fù)審人： 規(guī)程編寫者： 審 批 者： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日 文件分發(fā)部門和或個人 院檔案室保管者： 檢驗(yàn)科 主任： 檢驗(yàn)科 實(shí)驗(yàn)室： 淋巴細(xì)胞亞群測定(CD系列)方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼

2、庫爾特)原理： 雙/三色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，從而得到淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)。淋巴細(xì)胞表面抗原分布如下：T淋巴細(xì)胞：CD3+；B淋巴細(xì)胞：CD5+，CDl9+；輔助性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD8+；NK細(xì)胞：CD3-CDl6+56+等。根據(jù)淋巴細(xì)胞膜上CD分子表達(dá)的不同，流式細(xì)胞儀可以分辨出淋巴細(xì)胞及其各種不同的亞群，利用計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算出淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)。標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹采血。 采集部位 靜脈

3、采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量至少1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。 3樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應(yīng)分離單個核 細(xì)胞。 4溶血樣本不能用。試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫爾特成分 1：單克隆抗體 液體 1ML 28 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫

4、5：熒光微球 液體 10ML 2-8 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 1)按照要求，分別向已編好號的試管中加入20 ul單克隆抗體和同型對照2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管

5、關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個樣品測定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5)上機(jī)測樣（可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣）報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)（和絕對值）操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 靈敏度 5001000個熒光素分子 參考值(百分?jǐn)?shù)（絕對值）) CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567) 臨床意義1.T、B淋巴細(xì)胞亞群是重要的免疫狀態(tài)檢測指標(biāo)，在腫瘤、免疫缺陷、病毒感染，自

6、身免疫性疾病、創(chuàng)傷、急性感染、多臟器功能衰竭、器官移植等具有臨床診斷、病情判斷、治療等價(jià)值。臨床常用ThTs比值來判斷病人的免疫狀況。ThTs比值升高：表示免疫功能亢進(jìn)：見于自身免疫性疾病，如SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性溶血性貧血、重癥肌無力以及HBsAg+乙肝等。ThTs比值減低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、腫瘤病人、慢活肝和活動性肝硬化、再生障礙性貧血、粒細(xì)胞減少患者。2：NK細(xì)胞主要破壞各種腫瘤細(xì)胞和感染某些病毒、細(xì)菌的細(xì)胞，所以在抗腫瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性減低主要見于各種惡性腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、應(yīng)用免疫抑制劑，疲勞綜合征病人等，NK活性隨年齡增長而

7、減退。NK細(xì)胞也參與第二型超敏反應(yīng)和移植物抗宿反應(yīng)，白介素-2治療后；外周血NK細(xì)胞增加。方案（Protocol） HLA-B27測定(流式細(xì)胞儀) 醫(yī)院檢驗(yàn)科操作規(guī)程文件號：200 年 月 日起實(shí)施第1版(共3頁) 本規(guī)程每2年復(fù)審一次 復(fù)審日期： 年 月 日 復(fù)審人： 規(guī)程編寫者： 審 批 者： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日 文件分發(fā)部門和或個人 院檔案室保管者： 檢驗(yàn)科 主任： 檢驗(yàn)科 實(shí)驗(yàn)室： HLA-B27測定方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 雙色直接免疫熒光法。將HLA-B27-FITC/B7-PE單克隆抗體加入到全血中，與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗體結(jié)合，經(jīng)

8、過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，測定HLA-B7陰性而HLA-B27陽性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度和所占的百分比。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹采血。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量至少1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。 3樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應(yīng)分離單個核 細(xì)胞。 4溶血樣本不能用。試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫爾特成分 1：單

9、克隆抗體 液體 1ML 28 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光微球 液體 10ML 2-8 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 1)按照要求，分別向已編好號的試管中加入20 ul單克隆抗體和同型對照(IgG2a-FITCIg

10、G1-PE)2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個樣品測定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5)洗、離心、上機(jī)測樣（備注： 測B27一定要至少洗一遍方可上機(jī)檢測）報(bào)告結(jié)果 報(bào)告陰陽性操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 靈敏度 5001000個熒光素分子 參考值 陽性：HLA-B27陽性而HLA-B7陰

11、性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度在8.0以上。 臨床意義HLA復(fù)合體位于第6號染色體的短臂上，該區(qū)DNA片段長度約3000-4000KB，占人體整個基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I類基因中B位點(diǎn)上的一個等位基因，與多種疾病具有相關(guān)性，尤其是強(qiáng)直性脊柱炎。方案（Protocol） CD55/CD59測定(流式細(xì)胞儀) 醫(yī)院檢驗(yàn)科操作規(guī)程文件號：200 年 月 日起實(shí)施第1版(共3頁) 本規(guī)程每2年復(fù)審一次 復(fù)審日期： 年 月 日 復(fù)審人： 規(guī)程編寫者： 審 批 者： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日 文件分發(fā)部門和或個人 院檔案室保管者： 檢驗(yàn)科 主任： 檢驗(yàn)科 實(shí)驗(yàn)室： CD55/CD59測定方法 流

12、式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 雙色直接免疫熒光法。近年的研究表明，紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜上CD55和CD59分子的表達(dá)量和缺乏表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量對PNH診斷和鑒別有重要意義。血細(xì)胞(紅細(xì)胞和白細(xì)胞)通過膜上的抗原分子與熒光素標(biāo)記的CD55或CD59的多克隆抗體結(jié)合。用流式細(xì)胞儀檢測CD55或CD59表達(dá)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹采血。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量至少1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。 3溶血樣本不能用。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫

13、爾特成分 1：單克隆抗體 液體 1ML 28 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光微球 液體 10ML 2-8 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備:(一)白細(xì)胞CD55CD59檢測1準(zhǔn)備2支流式細(xì)胞儀專用管，分別標(biāo)記。分別向二管中

14、加入樣品100ul。2溶血：a. OptiLyse C(按說明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個樣品測定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）3離心后分別加入CD55/CD59 10ul和相應(yīng)的同型對照10ul。避光20-30分鐘。4洗滌離心 5上機(jī)測樣(二)紅細(xì)胞CD55CD59檢測 1準(zhǔn)備2支流式細(xì)胞儀專用管，分別標(biāo)記 2分別加入CD55CD59 10ul和相應(yīng)的同型對照10ul。 3向二管中加入1：200稀釋的樣品100ul（可

15、根據(jù)紅細(xì)胞的數(shù)量調(diào)整），避光20-30分鐘。 4洗滌離心。5混勻、上機(jī)測樣。 報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 靈敏度 5001000個熒光素分子 參考值 CD55>97% CD59>97% PNH的臨界值：RBC CD59>95% WBC CD59>90% PNH的診斷值：RBC CD59>91% 大部分>80% 中性粒細(xì)胞CD59>84% 臨床意義用于AA和PNH的診斷和分型診斷。PNH時(shí)CD55和CD59明顯減低和缺如。方案（Protocol） 血小板膜表面抗體測定(流式細(xì)胞儀) 醫(yī)院檢驗(yàn)科操作規(guī)程文件號：200

16、年 月 日起實(shí)施第1版(共2頁) 本規(guī)程每2年復(fù)審一次 復(fù)審日期： 年 月 日 復(fù)審人： 規(guī)程編寫者： 審 批 者： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日 文件分發(fā)部門和或個人 院檔案室保管者： 檢驗(yàn)科 主任： 檢驗(yàn)科 實(shí)驗(yàn)室： 血小板膜表面抗體測定方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 直接免疫熒光法。FITC標(biāo)記的各型多克隆抗體，加到經(jīng)離心富集的血小板中，與血小板膜上的相應(yīng)的IgG-Fc片段結(jié)合，經(jīng)過洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹采血。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求

17、1樣本量至少1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)完成，冷凍的標(biāo)本或已固定的標(biāo)本不能用。 3樣本血小板計(jì)數(shù)應(yīng)在150-450×109/L之間。若>450×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<150×109/L，應(yīng)多采集進(jìn)行富集達(dá)到流式檢測的細(xì)胞數(shù)。 4溶血樣本不能用。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 聯(lián)科成分 1：單克隆抗體 液體 1ML 28 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光微球 液體

18、 10ML 2-8 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 富集血小板法：1）800r/min*15min,取上清，2）加45ml鞘液，2000r/min*3min,棄上清，重復(fù)一次。3)分別向已編好號的試管中加入10 ul單克隆抗體和同型對照(IgG-FITC)4)分別向試管中加入準(zhǔn)備好的10u1含血小板的PBS（血小板的量約為106）（血小板若在正常范圍，稀釋到原量直接取10u1。）。5)

19、混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘6)洗或不洗，上機(jī)測樣全血法：1）加45ml鞘液，1500r/min*15min,棄上清，后同上3）6）報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 靈敏度 5001000個熒光素分子 參考值 IgA<2.98% IgG<3.04% IgM<3.0% IgD<2.91% 臨床意義為免疫性血小板減少性紫癜(ITP)診斷、治療、預(yù)后估計(jì)的重要指標(biāo)，在ITP、膠原性疾病時(shí)升高。方案（Protocol） 紅細(xì)胞抗體測定(流式細(xì)胞儀) 醫(yī)院檢驗(yàn)科操作規(guī)程文件號：200 年 月 日起實(shí)施第1版(共2頁) 本規(guī)程每2年復(fù)審一次 復(fù)

20、審日期： 年 月 日 復(fù)審人： 規(guī)程編寫者： 審 批 者： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日 文件分發(fā)部門和或個人 院檔案室保管者： 檢驗(yàn)科 主任： 檢驗(yàn)科 實(shí)驗(yàn)室： 紅細(xì)胞膜蛋白結(jié)構(gòu)測定（紅細(xì)胞抗體）方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 直接免疫熒光法。FITC標(biāo)記的各型多克隆抗體，加到全血中，與紅細(xì)胞膜上的相應(yīng)的IgG-Fc片段結(jié)合，經(jīng)過洗滌(和固定)等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹采血。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量至少1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的

21、標(biāo)本不能用。 3溶血樣本不能用。試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 聯(lián)科成分 1：單克隆抗體 液體 1ML 28 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光微球 液體 10ML 2-8 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 1)按照要求，分別向已

22、編好號的試管中加入10 ul單克隆抗體和同型對照(IgG-FITC)2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血（1：200稀釋后）。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)上機(jī)測樣報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 靈敏度 5001000個熒光素分子 參考值 IgA<2.78% IgG<2.98% IgM<2.52% IgD<2.88% 臨床意義自身溶血性貧血的分型診斷方案（Protocol） 粒細(xì)胞抗體測定(流式細(xì)胞儀) 醫(yī)院檢驗(yàn)科操作規(guī)程文件號：200 年 月 日起實(shí)施第1版(共2頁) 本規(guī)程每2年復(fù)審一次 復(fù)審日期： 年 月 日 復(fù)

23、審人： 規(guī)程編寫者： 審 批 者： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日 文件分發(fā)部門和或個人 院檔案室保管者： 檢驗(yàn)科 主任： 檢驗(yàn)科 實(shí)驗(yàn)室： 粒細(xì)胞抗體測定方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 直接免疫熒光法。FITC標(biāo)記的各型多克隆抗體，加到經(jīng)溶血處理后的樣本中，與粒系胞膜上的相應(yīng)的IgG-Fc片段結(jié)合，經(jīng)過洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹采血。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量至少1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。 3 樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)

24、在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L，樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應(yīng)分離單個核細(xì)胞。 4溶血樣本不能用。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 聯(lián)科成分 1：單克隆抗體 液體 1ML 28 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光微球 液體 10ML 2-8 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于

25、2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 1) 溶血：a. OptiLyse C(按說明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個樣品測定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）2)分別向已編好號的試管中加入10 ul單克隆抗體和同型對照(IgG-FITC)2)分別向試管中加入經(jīng)溶血處理得樣本100u1。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘，洗

26、滌離心4)上機(jī)測樣報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 靈敏度 5001000個熒光素分子 參考值 IgA<2.68% IgG<2.66% IgM<2.49% IgD<3.4% 臨床意義白細(xì)胞減少癥的分型診斷，大多數(shù)白細(xì)胞減少癥患者抗體為陽性方案（Protocol） 白血病免疫分型測定(流式細(xì)胞儀) 醫(yī)院檢驗(yàn)科操作規(guī)程文件號：200 年 月 日起實(shí)施第1版(共3頁) 本規(guī)程每2年復(fù)審一次 復(fù)審日期： 年 月 日 復(fù)審人： 規(guī)程編寫者： 審 批 者： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日 文件分發(fā)部門和或個人 院檔案室保管者： 檢驗(yàn)科 主任： 檢驗(yàn)科 實(shí)驗(yàn)室

27、： 白血病免疫分型測定方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 三色直接免疫熒光法。正常血細(xì)胞的分化成熟過程中，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿有抗原的表達(dá)與血細(xì)胞的分化發(fā)育階段密切相關(guān)，因此這些抗原的表達(dá)與否可作為鑒別細(xì)胞和其分化階段的基礎(chǔ)。利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體對血液或骨髓進(jìn)行染色，通過FCM對白血病細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞漿抗原進(jìn)行分析，由此了解所測白血病細(xì)胞的系列屬性及其分化程度。三色染色在白血病免疫分型中較為常用。根據(jù)分型需要，選擇相應(yīng)抗原的標(biāo)記抗體，一般FITC標(biāo)記抗體和PE標(biāo)記抗體搭配為一組，再加PC5標(biāo)記抗原CD45單克隆抗體，共三種抗體加入一管標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)

28、備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)，腰穿采骨髓。 采集部位 腰穿采骨髓抗凝劑 肝素抗凝 要求 1樣本量至少3ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本或已固定的標(biāo)本不能用。 3樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應(yīng)分離單個核 細(xì)胞。4溶血樣本不能用。試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫爾特成分 1：單克隆抗體 液體 1ML 28 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室

29、溫 3：IntraPrep Permeabilization Reagent 成分1（固定劑） 液體 5ml 室溫 成分2（透膜劑） 液體 5ml 室溫4：鞘液 液體 20L 室溫 5：清洗液 液體 5L 室溫 6：熒光微球 液體 10ML 2-8 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作-樣本制備： 細(xì)胞膜表面抗原1首先準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲加入的抗體。2首先每管中加入5ul CD45-

30、PC5抗體。3然后，按管上的標(biāo)記，加入相應(yīng)抗體各10ul(注意：必須是FITC和PE標(biāo)記的抗體搭配)4各管中加入標(biāo)本(骨髓或外周血)30100u1(根據(jù)細(xì)胞的多少決定)，振蕩混勻，室溫避光2030分鐘。5溶血：a. OptiLyse C(按說明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個樣品測定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）細(xì)胞漿和核抗原1準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲加入的抗體，其中一管是同型對照。2首先每管中加入標(biāo)本(骨髓或外周血)

31、100ul(根據(jù)細(xì)胞的多少決定)，5ulCD45-PC5抗體。室溫避光20分鐘。3每管中加入固定液100ul，劇烈振蕩混勻，室溫避光15分鐘。4各管中加入PBS4ml。5300g離心5分鐘后，棄去上清液，振蕩混勻。(1500r/min*5min)6各管中加入透膜劑100ul，輕輕混勻，室溫避光5分鐘。 7加抗體，陰性對照管中加入10ul，其余各管加入相應(yīng)抗體各10ul，室溫避光15分鐘。8各管中加入4mlPBS，振蕩混勻。9300g離心5分鐘后，棄去上清液。10各管中加入PBS500ul，振蕩混勻。11上機(jī)測樣報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 靈敏度 50010

32、00個熒光素分子 參考值 CD34+<5% MPO+<5% 粒系<20% 淋系<30%臨床意義用于血液病的診斷和分型診斷方案（Protocol）T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子IFN-/IL-4檢測(流式細(xì)胞儀) 醫(yī)院檢驗(yàn)科操作規(guī)程文件號：200 年 月 日起實(shí)施第1版(共3頁) 本規(guī)程每2年復(fù)審一次 復(fù)審日期： 年 月 日 復(fù)審人： 規(guī)程編寫者： 審 批 者： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日 文件分發(fā)部門和或個人 院檔案室保管者： 檢驗(yàn)科 主任： 檢驗(yàn)科 實(shí)驗(yàn)室： T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子IFN-/IL-4檢測方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 直接免疫熒光

33、法。肝素鈉抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培養(yǎng)(輔助性T細(xì)胞通過細(xì)胞因子IFN-、IL-4的產(chǎn)生分為Thl、Th2兩個亞群。淋巴細(xì)胞活化以后才分泌細(xì)胞因子，且迅速分泌到細(xì)胞外。因此，利用刺激劑PMA+Ionomycin體外激活淋巴細(xì)胞，然后用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑Monensin阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，使細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)滯留到一定的量)，然后進(jìn)行細(xì)胞膜表面抗原和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，使用流式細(xì)胞儀對CD4+細(xì)胞內(nèi)的IFN-和IL-4進(jìn)行測定。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹采血。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1

34、樣本量至少1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。 3樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應(yīng)分離單個核 細(xì)胞。 4溶血樣本不能用。試劑 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系(自配) 成分：刺激素PMA、離子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 選白美國SIGMA公司。 單克隆抗體 CD4PC5、IL-4-PE、IFN-FITC選自美國BeckmanCoulter公司。 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 細(xì)胞培養(yǎng)與染色 取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5單抗，室溫避光孵育30分鐘，RPMIl640洗滌