大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及成纖維細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)探究

1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及成纖維細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)探究 摘要目的：進(jìn)行大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）與成纖維細(xì)胞（FBs）細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，尋找出重要的差異蛋白質(zhì)。方法：采用二維電泳的方法（2DE）分別分離兩種細(xì)胞的蛋白質(zhì)，用PDQuest軟件分析蛋白表達(dá)差異，并采用質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進(jìn)行鑒定。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)了MSCs和FBs之間存在差異表達(dá)的15種蛋白質(zhì)，其中4種蛋白質(zhì)差異顯著且與細(xì)胞功能密切相關(guān)，即SM22-、鳥嘌呤脫氨基酶（Guanine deaminase，GD）、膜聯(lián)蛋白（Annexin A5）、過氧化物岐化酶-2（superoxide dismutase 2，SOD-2

2、）。MSCs 的SM22-和Annexin A5的表達(dá)分別比FBs低26倍和8倍，而MSCs的GD和SOD-2表達(dá)分別比FBs高16倍和21倍。結(jié)論：與大鼠FBs相比，MSCs存在更多防止細(xì)胞損傷相關(guān)的蛋白質(zhì)和更少的與細(xì)胞衰老過程密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，具有高分化潛能，更適合于作為組織工程種子細(xì)胞。 關(guān)鍵詞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成纖維細(xì)胞；蛋白質(zhì)組學(xué) 中圖分類號Q831文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1008-6455（2008）07-1021-05 Comparative proteomic analysis of mouse mesenchymal stem cells and skin-derived fib

3、roblasts SUN Yang1,ZHAO Liang2,WEI Xu-feng2,YI Wei2,GUO Shu-zhong1 （Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi,China） Abstract:ObjectiveTo analysis and to compare the proteomic differences between mesenchymal stem cells(MSCs) and fibroblas

4、ts(FBs), and to discover the key different proteins.MethodsSeparate the protein of cells by 2 dimension electrophoresis（2DE）, analysis the differences of protein expression with PDQues, and identify with MALDI-TOF-MS. ResultsDiscover fifteen different types of proteins, four of which associate with

5、different functions of MSCs and FBs. Those are SM22-alpha, Guanine deaminase(GD), Annexin A5 and superoxide dismutase 2 (SOD-2). the expression of SM22-and Annexin A5 in MSCs is separately 26 folds and 8 folds lower than in FBs, but MSCs express GD and SOD2 16 folds and 21 folds higher than FBs.Conc

6、lusionCompared with FBs, MSCs express more kinds of proteins that can prevent the damage of themselves, while have fewer proteins associated with aging in expression. Plus pluripotent differentiation potential, they are better seed cells for tissue engineer. Key words: mesenchymal stem cells; fibrob

7、lasts; proteome 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）與成纖維細(xì)胞（FBs）都可作為組織工程種子細(xì)胞，兩者都具備分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力，且MSCs可在一定條件下誘導(dǎo)分化為FBs。然而，MSCs具備生長和分化的能力，F(xiàn)Bs卻不具備分化潛能。本研究從蛋白質(zhì)組水平比較MSCs與FBs蛋白表達(dá)的差異，試圖找到使MSCs具備分化潛能的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，深入了解導(dǎo)致MSCs與 FBs不同功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步深入研究和改建 MSCs成為具有完全功能的組織工程種子細(xì)胞打下基礎(chǔ)。 1材料和方法 1.1 試劑、儀器及動物 1.1.1 試劑： DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；雙抗(青霉素、鏈霉素)

8、、EDTA鈉、肝素鈉、Percol1分離液均購自Sigma公司；胎牛血清(FBS)購自四季青公司；CD34，CD29，CD45和FITC標(biāo)記的二抗均購自美國SantaCruz公司；溶液均由Milli-Q水配制而成；其它試劑均為分析純。 1.1.2 儀器：二維電泳系統(tǒng)及PDQuest凝膠分析軟件購自美國Bio-Rad公司；Powerlook 2100XL凝膠圖像掃描儀購自美國UMAX公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)購自德國。 1.1.3 動物：SD大鼠子鼠，雄性，年齡 1617天，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。 1.2 方法 1.2.1 大鼠MSCs的分離與培養(yǎng)

9、：選用雄性SD大鼠子鼠，用體積分?jǐn)?shù)為3.5的水合氯醛腹腔注射麻醉。分離出四肢骨，用DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔。將沖洗獲得的溶液以300g/min的速度離心5min。棄上清液，再用培養(yǎng)基重懸沉淀，加入到梯度Percoll液中，以900g/min的速度離心20min。吸取交界面處云霧狀層，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10FBS的DMEM培養(yǎng)基重新懸浮，以300g/min的速度離心5min，棄上清液，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)接種，培養(yǎng)。2448h后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細(xì)胞。56天消化分瓶傳代培養(yǎng)。 1.2.2 大鼠FBs的分離與培養(yǎng)：處死大鼠，用75酒精浸泡35min，切取2cm×3cm大小背部皮膚2塊，用PBS緩

10、沖液清洗23次。然后將其切成長約1cm寬0.30.5cm左右的皮條。用濃度為2.4U/mlDSP酶在37消化11.5h左右，撕去表皮層，將真皮層剪成約1mm3的碎塊，移入5ml膠原酶，在37培養(yǎng)箱中消化11.5h，每20min左右振蕩，消化到組織塊散開為止。加培養(yǎng)液稀釋膠原酶，用吸管吹打，再用100目的鋼網(wǎng)過濾，祛除剩余的組織塊。收集細(xì)胞懸液，以300g/min的速度離心9min，細(xì)胞記數(shù)，以2×105/ml的細(xì)胞量接種，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 1.2.3 MSCs表面抗原的鑒定：用2.5g/L 胰蛋白酶消化后收獲第3代細(xì)胞，其分別與抗CD29，CD34，CD45的單克隆抗體飽和溶液在室

11、溫下反應(yīng)30min，然后用PBS洗滌2次，再與FITC標(biāo)記的二抗避光作用15min。最后用PBS洗滌并重懸于PBS中，對MSCs表面抗原進(jìn)行流式分析。 1.2.4 蛋白分離及圖像分析：消化分離出細(xì)胞，在4以3 000r/min的速度離心10min，棄去上清液，加入預(yù)冷的PBS洗滌3次。在裂解液中重懸細(xì)胞，在冰浴冷卻下超聲破碎細(xì)胞。分別加入脫氧核糖核酸酶200ml和核糖核酸酶50mL，于4放置15min，以12 000r/min的速度離心30min。收集上清液，用Bradford法測定蛋白含量，在-80中保存蛋白樣品。采用2DE方法分離細(xì)胞蛋白提取物。 1.2.5 質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索：對蛋白點(diǎn)

12、膠內(nèi)酶切，提取多肽混合物。用MALDI-TOF-MS法(Voyager-DE)檢測蛋白多肽。采用moverz軟件對多肽質(zhì)譜進(jìn)行校正，通過peakErazor軟件去除各種污染，如胰酶自降解峰以及角蛋白污染峰等。采用不同的檢索引擎(Aldente, Profound, MS-Fit)對兩種不同的數(shù)據(jù)庫(NCBInr和Swiss-Prot)蛋白進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索1。 2結(jié)果 2.1 MSCs和FBs形態(tài)觀察：MSCs和FBs形態(tài)相似，均呈梭形貼壁生長（圖1）。 2.2流式細(xì)胞儀對大鼠MSCs表面抗原鑒定結(jié)果：大鼠MSCs表面抗原 CD29呈陽性，而CD34和CD45呈陰性，表明實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為MSCs，并且

13、在增殖過程中能夠保持其特征?？膳懦煅杉?xì)胞的污染（圖2）。 2.3 特征蛋白的鑒定：采用pH=310的IPG膠條分離MSCs和FBs蛋白提取液，結(jié)果見圖3。PDQuest軟件分析MSCs和FBs蛋白點(diǎn)變化情況。結(jié)果表明：MSCs與FBs表達(dá)的蛋白質(zhì)譜很相似，但仍存在差異。MSCs具有的而FBs不具有的蛋白點(diǎn)有3個，MSCs多而FBs少的蛋白點(diǎn)有5個，MSCs少而FBs多的蛋白點(diǎn)5個，MSCs沒有而FBs有的蛋白點(diǎn)有2個。這些蛋白點(diǎn)將作為質(zhì)譜分析的對象進(jìn)行膠內(nèi)酶解及質(zhì)譜分析，成功地鑒定出4個有意義的蛋白點(diǎn)，即SM22-a、GD、Annexin A5、SOD-2。MSCs 的SM22-和Anne

14、xin A5的表達(dá)分別比FBs低26倍和8倍，而MSCs的GD和SOD-2表達(dá)分別比FBs高16倍和21倍。4個蛋白點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜如圖4所示。 3討論 FBs曾作為組織工程種子細(xì)胞，但其功能存在缺陷。MSCs是一種多能干細(xì)胞，具有自我增殖和多向分化的潛能，目前認(rèn)為其作為組織工程種子細(xì)胞有很好的應(yīng)用前景。在一定條件下，MSCs可誘導(dǎo)分化為FBs，但MSCs與FBs的蛋白組學(xué)功能差別的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，尚未見深入研究報道。本試驗(yàn)對大鼠MSCs和FBs研究發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞形態(tài)相似，均呈梭形，并均貼壁生長。MSCs表面抗原CD29為陽性，CD34和CD45為陰性。本研究進(jìn)一步對兩種細(xì)胞進(jìn)行蛋白分離和蛋白

15、組學(xué)比較研究，發(fā)現(xiàn)MSCs與FBs表達(dá)的蛋白質(zhì)譜很相似，但仍存在差異。MSCs具有的而FBs不具有的蛋白點(diǎn)有3個，MSCs多而FBs少的蛋白點(diǎn)有5個，MSCs少而FBs多的蛋白點(diǎn)5個，MSCs沒有而FBs有的蛋白點(diǎn)有2個。將這些蛋白點(diǎn)作為質(zhì)譜分析的對象進(jìn)行膠內(nèi)酶解及質(zhì)譜分析，成功地鑒定出4個有意義的蛋白點(diǎn)，即SM22-a、GD、Annexin A5、SOD-2。細(xì)胞蛋白表達(dá)上的差異，導(dǎo)致了兩種細(xì)胞具有不同的功能，通過蛋白質(zhì)組的鑒定，我們發(fā)現(xiàn)以上四種主要差異的蛋白質(zhì)均與MSCs保持高度增殖和分化能力有關(guān)。 SM22-a可在多種間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)2，與細(xì)胞的衰老有關(guān)，分化程度越高的細(xì)胞表達(dá)SM22-a

16、越多3。蛋白質(zhì)組的研究結(jié)果顯示MSCs與FBs相比SM22-a表達(dá)少，說明MSCs分化程度較低，是更年輕的細(xì)胞，具備高分化潛能。GD是核苷酸代謝的關(guān)鍵酶，催化水解的脫氨基作用，使鳥嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤4-5。GD在細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮重要作用6。蛋白質(zhì)組的結(jié)果顯示MSCs表達(dá)的GD比FBs表達(dá)多，證實(shí)了MSCs是未成熟細(xì)胞，仍含有較多的促進(jìn)細(xì)胞成熟的酶功能活躍，催化細(xì)胞的成熟。 Annexin A5是與細(xì)胞衰老過程密切相關(guān)的蛋白，在細(xì)胞凋亡的過程中，Annexin A5相互結(jié)合7。蛋白質(zhì)組的結(jié)果顯示MSCs表達(dá)的Annexin A5比FBs少，提示MSCs是比FBs更年輕的細(xì)胞。SOD-2是一種抗氧

17、化劑，可以提高多種酶mRNA的水平，SOD-2水平的提高可以防止細(xì)胞的損傷8。蛋白質(zhì)組的結(jié)果顯示MSCs表達(dá)的SOD-2水平高于FBs，提示MSCs處于較幼稚的階段，機(jī)體對其產(chǎn)生了良好的保護(hù)機(jī)制9。 綜上所述，MSCs和FBs蛋白表達(dá)譜相似，故具有相似的生物學(xué)功能，均可作為組織工程種子細(xì)胞。但兩者蛋白表達(dá)仍存在不同，導(dǎo)致了兩者功能的差別。本研究第一次從蛋白水平闡述了MSCs和FBs不同功能與蛋白表達(dá)差異的關(guān)系，找到了4種有意義的差異蛋白質(zhì)，可以更深入的理解MSCs具備高分化潛能而FBs不具備的原因，為選擇更適合的組織工程種子細(xì)胞提供了更多的理論依據(jù)，并由此推斷MSCs作為組織工程種子細(xì)胞具有更

18、廣泛應(yīng)用的前景。 參考文獻(xiàn) 1邱 俊, 周繼紅,張 波, 等. 胎兔皮膚無瘢痕愈合相關(guān)蛋白的篩選與初步分析J.中國美容醫(yī)學(xué), 2007, 16(1):11-14. 2Lawson D, Harrison M, Shapland C. Fibroblast transgelin and smooth muscle SM22alpha are the same protein, the expression of which is down-regulated in many cell linesJ. Cell Motil Cytoskeleton, 1997,38(3):250-257. 3Th

19、weatt R, Lumpkin CK Jr, Goldstein S. A novel gene encoding a smooth muscle protein is overexpressed in senescent human fibroblastsJ. Biochem Biophys Res Commun, 1992,187(1):1-7. 4Chang YJ, Huang CH, Hu CY, et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of Bacillus subtilis guanine deaminaseJ. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2004,60(Pt 6):1152-1154. 5Giese RD, Snyder FF. cDNA sequence of five mouse guanine deaminase (Gda) alleles and mapping to mouse chromosome 19J. Genome, 2002,45(2):276