九.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

1、九大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化方法。2、學(xué)習(xí)利用感受態(tài)細(xì)胞來(lái)達(dá)到轉(zhuǎn)化的目的。二、 實(shí)驗(yàn)原理在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過(guò)細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌（受體細(xì)胞）經(jīng)理化方法處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生暫時(shí)性改變，成為能允許外源 DNA 分子進(jìn)入的細(xì)胞，稱感受態(tài)細(xì)胞。1. 概念轉(zhuǎn)化是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域

2、的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 2、受體細(xì)胞：一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R,M)，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法(如電擊法，CaCl2，RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞 。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。3、轉(zhuǎn)化方法RbCl(KCl)法， CaCl2法，電擊感受態(tài)制備等，RbCl(KCl)法制備的

3、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高，但制備較復(fù)雜，不適合實(shí)驗(yàn)室用。電擊感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高，操作簡(jiǎn)便，但需電擊儀CaCl2法簡(jiǎn)便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15的無(wú)菌甘油于-70以下保存半年，因此CaCl2法使用更為廣泛.4、感受態(tài)細(xì)胞制備CaCl2法：細(xì)胞處于 0 4 ， CaCl2 低滲溶液中，大腸桿菌細(xì)胞膨脹成球狀。轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羥基 - 鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng) 42 90 秒熱激處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收 DNA 混合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間，促使在轉(zhuǎn)化過(guò)程中獲得的新的表型，如氨芐青霉素

4、耐藥（ Amp r ）得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含 Amp 的選擇性培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)過(guò)夜，即可獲得細(xì)菌菌落。 5、提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)因素：細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度； 不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于的培養(yǎng)菌，最好從70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來(lái)控制。DH5菌株的OD600 為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5×107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的

5、濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5。試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或R.)，并用超純水配制，最好分裝，滅菌保存于干燥的冷暗處 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管、tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率；或者雜DNA的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。 三、實(shí)驗(yàn)

6、器材1）材料E. coli DH5菌株；Amp； 質(zhì)粒DNA； 需要檢測(cè)的連接產(chǎn)物2）設(shè)備 恒溫?fù)u床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，臺(tái)式高速離心機(jī)，超凈工作臺(tái)低溫冰箱，恒溫水浴鍋，制冰機(jī)，分光光度計(jì)，微量移液槍， eppendorf管等。 3）試劑0.1mol/L的CaCl2， LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基，Amp母液：氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液, -20保存?zhèn)溆?。四、操作步驟 本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH5a菌株為受體細(xì)胞，并用CaCl2處理，使其處于感受態(tài)，然后與質(zhì)粒共保溫培育，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過(guò)Amp抗性來(lái)

7、篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)入質(zhì)粒，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。 1、受體菌的培養(yǎng) 1） 從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中，37180rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜； 2） 將該菌懸液以1:100的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)12小時(shí)至OD600在0.5左右 ; 3） 無(wú)菌條件下取1ml菌液到預(yù)冷的1.5ml離心管中，4, 5000rpm離心4min； 4）重復(fù)步驟 3）3次，收集足夠的菌； 5） 徹

8、底棄上清液，在冰浴上加入1/10V（400ul）預(yù)冷的無(wú)菌CaCl2 (0.lmol/L)，輕輕吹打，使細(xì)胞懸浮，冰浴10 min；6) 4，5000 rpm離心5min，棄上清液;7) 用200l預(yù)冷的無(wú)菌CaC12 (0.lmol/L) 重新懸浮細(xì)胞，100ul分裝，冰上備用；注：如果需要保存，用160ul 預(yù)冷的無(wú)菌CaC12 (O.lmol/L)和40ul無(wú)菌的70%甘油懸浮細(xì)胞，液氮冷激10min后，-70以下保存?zhèn)溆谩?. 轉(zhuǎn)化1）取100l感受態(tài)細(xì)胞懸液，在冰浴中使其解凍，加入10l連接產(chǎn)物（或質(zhì)粒DNA）(含量不超過(guò)50ng，體積不超過(guò)10l)，輕輕搖勻，冰上30min；2）4

9、2水浴中熱擊90秒（勿搖動(dòng)），熱擊后迅速置于冰上冷卻2min；3）向管中加入400ul LB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37，70100rpm振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )；4）離心：將上述菌液 3000rpm 離心 2min后，棄上清300ul，剩下的菌液混勻；5）涂平板：將上述混勻后的菌液取80-100ul涂布于含Amp的篩選平板上，37倒置培養(yǎng)皿培養(yǎng)1216h。 注意：1、含Amp的LB固體培養(yǎng)基的配制:將滅菌的LB固體培養(yǎng)基水浴溶解后冷卻至60左右，加入Amp儲(chǔ)存液，使終濃度為100ug/ml，搖勻后倒平板；五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1恒溫培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下；l 在涂布質(zhì)粒DNA的平板上，可看到有大量的菌落生長(zhǎng)，且分布比較均勻；l 在涂布連接質(zhì)粒的平板上，可看到有2個(gè)菌落。2。對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析如下：A在含有青霉素的培養(yǎng)基上，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化比較成功，轉(zhuǎn)化子比較多。說(shuō)明其質(zhì)粒中含有抗性基因，受體生長(zhǎng)良好，所以平板上可以看到大量的菌落；B。而連接質(zhì)粒不可能做到100的連接效率，且由于連接過(guò)程中要在