不同劑量配比的實(shí)驗(yàn)性甲型肝炎戊型肝炎聯(lián)合疫苗的免疫原性研究(一)

1、不同劑量配比的實(shí)驗(yàn)性甲型肝炎戊型肝炎聯(lián)合疫苗的免疫原性研究(一)    【關(guān)鍵詞】 甲型肝炎病毒;,戊型肝炎病毒;,聯(lián)合疫苗;,劑量配比;,免疫原性Immunogenicity of experimentally combined hepatitis A and hepatitis E vaccine at different dosage ratioAbstract AIM: To eva luate the immunogenicity of experimentally combined hepatitis A and hepatitis E (c

2、HA+E) vaccine and analyze the interactions between the two antigenic components in vaccine. METHODS: Nine different dosage ratio of the cHA+E vaccine, A500+E200, A500+E100, A500+E50, A250+E200, A250+E100, A250+E50, A125+E200, A125+E100 and A125+E50 (U+mg)/L, was prepared from an inactivated hepatiti

3、s A (HA) vaccine and a hepatitis E (HE) vaccine. 120 mice were immunized with the cHA+E vaccine, HA vaccine and HE vaccine alone in different doses, respectively. Mice were bled before immunization and 2, 4, 6, 8, 10, 12 and 14 weeks post immunization. Specific antibodies against hepatitis A and E v

4、iruses were detected by ELISA and neutralization assay. RESULTS: After immunization with different dosages of cHA+E vaccine, all animals developed hepatitis A virus antibody (antiHAV) and hepatitis E virus antibody (antiHEV). AntiHAV responses increased with the concentration of the HA vaccine compo

5、nent in the cHA+E vaccine. AntiHAV neutralizing antibody titers reached 11 024 when mice were immunized with cHA+E vaccine prepared from higher dosage (500 U/mL) of the HA vaccine. The titers only reached 1512 when lower dosages (250 and 125 U/mL) of HA vaccine were applied. However, different dosag

6、es (200, 100 and 50 mg/L) of the HE vaccine component in the cHA+E vaccine developed no effects on the production of antiHAV neutralizing antibody. In addition, comparing with the single HE vaccine, the cHA+E vaccine induced higher level of antiHEV response. The antiHEV level increased with the conc

7、entration of HA vaccine component in the cHA+E vaccine. However, there was no obvious relationship between the antiHEV levels and the different dosages （200, 100 and 50 mg/L）of the HE vaccine component in the cHA+E vaccine. Immune sera elicited by the cHA+E vaccine neutralized HEV infectivity when d

8、etected by an in vitro RTnPCRbased HEV neutralization assay. CONCLUSION: In cHA+E vaccine, the HA vaccine component can increase the immunogenicity of the HE vaccine component, and the HE vaccine component plays no adverse effects on the immunogenicity of the HA vaccine component.Keywordshepatitis A

9、 virus; hepatitis E virus; combined vaccine; dosage ratio; immunogenicity摘 要 目的: 研究實(shí)驗(yàn)性甲型肝炎（甲肝）戊型肝炎（戊肝）聯(lián)合疫苗的免疫原性, 探討兩種抗原組分間的相互作用。方法: 制備9種不同劑量配比的實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗, 與單價(jià)疫苗對(duì)照一起免疫15組（共120只）小鼠, 定時(shí)采血, 以ELISA和中和試驗(yàn)檢測(cè)抗HAV和抗HEV的抗體。結(jié)果: 高劑量的HAV抗原（5×105 U/L）與不同劑量的HEV抗原（200、 100、 50 mg/L）配制的聯(lián)合疫苗, 誘導(dǎo)的抗HAV中和抗體的滴度可達(dá)11 0

10、24, 含25×104、 125×103 U/L HAV抗原的聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)的中和抗體滴度為1512, 不同劑量的HEV抗原對(duì)抗HAV中和抗體的產(chǎn)生均無明顯影響。與單價(jià)戊肝疫苗相比較, 聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)的抗HEV抗體水平均有明顯升高, 且隨聯(lián)合疫苗中HAV抗原的含量（5×105、 25×104、 125×103 U/L）的增加而升高, HEV抗原的劑量在一定范圍內(nèi)（200、 100、 50 mg/L）與抗HEV抗體產(chǎn)生無明顯關(guān)系。采用基于逆轉(zhuǎn)錄套式PCR的中和試驗(yàn)表明, 各聯(lián)合疫苗組的免疫血清均可中和HEV。結(jié)論: 實(shí)驗(yàn)性甲、 戊肝聯(lián)合疫苗內(nèi)HAV抗

11、原對(duì)HEV抗原的免疫原性具有增強(qiáng)作用, 而HEV抗原對(duì)HAV抗原的免疫原性無明顯影響。關(guān)鍵詞甲型肝炎病毒; 戊型肝炎病毒; 聯(lián)合疫苗; 劑量配比; 免疫原性2004年, 衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示, 我國(guó)戊肝的發(fā)病率有上升趨勢(shì), 甲肝的發(fā)病率基本維持在往年的水平?？刂七@兩種疾病最有效的方法, 是進(jìn)行疫苗預(yù)防接種。目前, 國(guó)內(nèi)外甲肝疫苗已上市多年, 戊肝疫苗正在研制中。隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展, 人員流動(dòng)的日益增加, 對(duì)疫苗的需求也將日益增加, 因此, 加快、 加強(qiáng)新疫苗的研制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。為了減少疫苗接種的次數(shù), 降低預(yù)防接種的成本, 提高疫苗的覆蓋率和免疫效果, 開發(fā)和應(yīng)用聯(lián)合疫苗已成為當(dāng)今疫苗

12、的發(fā)展方向1。目前研究證明, 已有多種聯(lián)合疫苗都是安全、 高效的, 并得到廣泛使用。然而, 迄今關(guān)于預(yù)防甲肝和戊肝的聯(lián)合疫苗的研制國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究在以往我們關(guān)于HEV重組蛋白誘導(dǎo)中和抗體研究工作的基礎(chǔ)上2-4, 首次采用滅活的甲肝疫苗與實(shí)驗(yàn)性戊肝疫苗進(jìn)行不同劑量配比, 制備了實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗, 并對(duì)其免疫原性、 抗原組分間的相互作用進(jìn)行了初步探討, 旨在為進(jìn)一步開發(fā)甲戊肝聯(lián)合疫苗奠定基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 材料 滅活甲肝疫苗由北京科興生物公司饋贈(zèng), 并配制成3種劑量（分別為125×103、 25×104、 5×105 U/L）; 實(shí)驗(yàn)性戊肝疫苗系用

13、大腸桿菌表達(dá)的HEV重組蛋白經(jīng)純化、 氫氧化鋁佐劑（1 g/L）吸附制成, 也配制成3種劑量(分別為50、 100、 200 mg/L)。清潔級(jí)BALB/c小鼠120只, 雌性, 68周齡, 1822 g, 購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心?？笻AV總抗體檢測(cè)試劑盒, 購自唐山怡安生物有限公司?？笻EV抗體陰性的正常人血清和抗HEV抗體陽性的患者血清, 由南京市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。1.2 方法2 結(jié)果2.1 抗HAV總抗體的檢測(cè) 競(jìng)爭(zhēng)ELISA的結(jié)果顯示, 9種不同配比的實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗接種小鼠后, A500+E200、 A500+E100、 A500+E50組小鼠, 于首次接種后4周抗HAV抗

14、體全部轉(zhuǎn)陽, 其余各聯(lián)合疫苗組小鼠于免疫后6周均可檢出抗HAV抗體。單價(jià)甲肝疫苗組中, A500組小鼠同樣于首次接種后4 周全部出現(xiàn)抗HAV抗體陽轉(zhuǎn), A250、 A125組小鼠于免疫后6 周抗HAV抗體轉(zhuǎn)陽。2.2 抗HAV中和抗體的檢測(cè) 單價(jià)滅活的甲肝疫苗A500組與聯(lián)合疫苗A500+E200、 A500+E100、 A500+E50組小鼠, 抗HAV中和抗體產(chǎn)生早、 滴度高, 末次免疫后8周抗體的滴度仍可達(dá)11 024（表1）; 而單價(jià)滅活的甲肝疫苗A250、 A125組與聯(lián)合疫苗A250+E200、 A250+E100、 A250+E50、 A125+E200、 A125+E100、

15、A125+E50免疫組的小鼠, 抗HAV中和抗體的產(chǎn)生較晚, 抗體的滴度低于單價(jià)滅活的甲肝疫苗A500組與聯(lián)合疫苗A500+E200、 A500+E100、 A500+E50組, 末次免疫后8 周抗HAV抗體的滴度為1512（表1）。以上表明, 實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)的抗HAV抗體的水平, 隨聯(lián)合疫苗內(nèi)HAV抗原劑量的增加而升高, 與單價(jià)滅活甲肝疫苗相比較無明顯差異, 提示在實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗中, 高劑量的HAV抗原有利于抗HAV中和抗體的產(chǎn)生, 而HEV抗原對(duì)HAV抗原的免疫原性無明顯影響。2.3 抗HEV抗體的產(chǎn)生 ELISA檢測(cè)表明, 9組不同劑量配比的實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗接種小鼠后

16、, A500+E200、 A500+E100、 A500+E50組小鼠的抗體產(chǎn)生早, 于首次接種4周后, 抗HEV抗體全部陽轉(zhuǎn), 而聯(lián)合疫苗組A250+E200、 A250+E100、 A250+E50、 A125+E200、 A125+E100、 A125+E50以及單價(jià)實(shí)驗(yàn)性戊肝疫苗E200、 E100、 E50組抗體的產(chǎn)生較晚, 于首次接種6 周后, 才出現(xiàn)抗HEV抗體轉(zhuǎn)陽。比較表2、 3、 4的結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)E200、 E100和E50 3組小鼠產(chǎn)生的抗HEV抗體的水平在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均無明顯區(qū)別, 而且相同劑量的滅活甲肝疫苗與不同劑量的實(shí)驗(yàn)性戊肝疫苗配比制備的實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗, 誘

17、導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗HEV抗體的水平在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中也無明顯區(qū)別。但是表2、 3、 4的結(jié)果也表明, 不同劑量配比的實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗HEV抗體的水平均高于單價(jià)實(shí)驗(yàn)性戊肝疫苗, 而且隨著聯(lián)合疫苗內(nèi)滅活甲肝疫苗含量的增加, 產(chǎn)生抗HEV抗體的水平也升高。如表2所示, A500+E200聯(lián)合疫苗組小鼠產(chǎn)生的抗HEV抗體的水平高于A250+E200聯(lián)合疫苗組（2、 14周, P0.05; 4周, P0.01）; A250+E200聯(lián)合疫苗組小鼠產(chǎn)生的抗HEV抗體的水平高于A125+E200聯(lián)合疫苗組（10、 12周, P0.05）; A125+E200聯(lián)合疫苗組小鼠產(chǎn)生的抗HEV抗體的水平高

18、于單價(jià)實(shí)驗(yàn)性戊肝疫苗組E200（8、 10周, P0.05; 6、 12、 14周, P0.01）。表3、 4的分析結(jié)果與表2相似。表明在9組實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗中, 聯(lián)合疫苗組A500+E200、 A500+E100、 A500+E50小鼠產(chǎn)生的抗HEV抗體的水平, 均高于聯(lián)合疫苗組A250+E200、 A250+E100、 A250+E50、 A125+E200、 A125+E100和A125+E50。由此可見, 在實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗中, 實(shí)驗(yàn)性戊肝疫苗的劑量在一定范圍內(nèi)與抗HEV抗體產(chǎn)生的水平無明顯關(guān)系; 而HAV抗原則能增強(qiáng)HEV抗原的免疫原性, 且隨著聯(lián)合疫苗中HAV抗原含量的增加

19、而增強(qiáng)。表1 定量滅活甲肝疫苗與不同劑量的戊肝疫苗聯(lián)合免疫后不同時(shí)間抗HAV中和抗體的產(chǎn)生（略）Tab 1 Production of antiHAV neutralizing antibodies at different time after immunization with a given HAV in combination with different doses of HEV vaccine2.4 抗HEV中和抗體的檢測(cè) 將免疫后第14周采集的各實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗組的每組8只小鼠血清分別等量混合, 并按110、 120、 140、 180 系列稀釋后, 采用基于RTnPCR的體

20、外中和試驗(yàn)檢測(cè)抗HEV中和抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 110、 120、 140的各實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗組的血清, 均可有效地中和HEV對(duì)細(xì)胞的感染。提示各種配比的實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗, 均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的抗HEV中和抗體（圖1）。表2 200 mg/L戊肝疫苗與不同劑量滅活甲肝疫苗聯(lián)合免疫小鼠誘導(dǎo)的抗HEV抗體的水平（略）Tab 2 Levels of antiHEV antibodies induced by 200 mg/L hepatitis E vaccine in combination with different doses of inactivated hepatitis A v

21、accineaP0.05, bP0.01 vs E200 group at the same time; cP0.05, dP0.01 vs A250+E200 group at the same time; eP0.05, fP0.01 vs A125+E200 group at the same time.表3 100 mg/L戊肝疫苗與不同劑量滅活甲肝疫苗聯(lián)合免疫小鼠誘導(dǎo)的抗HEV抗體的水平（略）Tab 3 Levels of antiHEV antibodies induced by 100 mg/L hepatitis E vaccine in combination with di

22、fferent doses of inactivated hepatitis A vaccineaP0.05, bP0.01 vs E100 group at the same time; cP0.05, dP0.01 vs A250+E100 group at the same time; eP0.05, fP0.01 vs A125+E100 group at the same time.表4 50 mg/L戊肝疫苗與不同劑量滅活甲肝疫苗聯(lián)合免疫小鼠誘導(dǎo)的抗HEV抗體的水平（略）Tab 4 Levels of antiHEV antibodies induced by 50 mg/L he

23、patitis E vaccine in combination with different doses of inactivated hepatitis A vaccineaP0.05, bP0.01 vs E50 group at the same time; cP0.05, dP0.01 vs A250+E50 group at the same time; eP0.05, fP0.01 vs A125+E50 group at the same time.圖1 9組實(shí)驗(yàn)性甲戊肝聯(lián)合疫苗免疫后第14周血清的體外中和作用（略）Fig 1 Neutraliztion test of serum at 14 weeks after immunization wi