兩種Ames試驗方法在蒲葵子提取物致突變試驗中靈敏度的研究

1、兩種Ames試驗方法在蒲葵子提取物致突變試驗中靈敏度的研究         【摘要】  目的通過Ames試驗與彷徨試驗對蒲葵子正丁醇提取物的致突變試驗結(jié)果，比較兩種試驗的靈敏度。方法對蒲葵子用正丁醇浸提，用Ames試驗方法（摻入法）與彷徨試驗方法，對TA100鼠傷寒沙門氏菌株進行致突變試驗。結(jié)果兩種試驗方法結(jié)果顯示，蒲葵子正丁醇提取物在5500 g/ml劑量范圍，以Ames試驗方法與彷徨試驗均檢測出陽性結(jié)果，而在0.025 g/ml 與0.5 g/ml 劑量下，彷徨試驗能檢測出陽性結(jié)果，而Ames方法未檢

2、測出陽性結(jié)果。結(jié)論在較低濃度時，彷徨試驗能檢測出Ames試驗檢測不出的陽性結(jié)果，表明彷徨試驗靈敏度較Ames試驗高。 【關鍵詞】  正丁醇提取物；Ames；彷徨試驗；靈敏度Abstract：ObjectiveTo compare the sensitivity of  the Fluctuation test and Ames test for examination of  the sudden change caused by Chinese fan-palm sub-normal butyl alcohol extraction.MethodsChinese

3、 fan-palm was extracted with the normal butyl alcohol, and Ames test and Fluctuation test were carried out to detect TA100 mouse salmonella typhimurium.ResultsThe results demonstrated that the extract in the range of 5500 g/ml，the Ames test method and the fluctuation test method detected the positiv

4、e result, and in the range of 0.0250.5 g/ml, the Fluctuation test could examine positive result, but the Ames test could  not change. ConclusionIn low concentration, the Fluctuation test can examine positive result but Ames test can not, which indicated that the Fluctuation test has higher sens

5、itivity than the Ames test.Key words：Normal butyl alcohol extraction;   Ames; Fluctuation test; Sensitivity    鼠傷寒沙門氏菌哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗），是利用一組組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株加入待測物在有或沒有微粒體活化系統(tǒng)條件下，發(fā)生回復突變的特征鑒定化學物質(zhì)的誘變活性，現(xiàn)已成為初步篩選化學物潛在致突變的首選方法。彷徨試驗也是一種細菌回復突變試驗，根據(jù)營養(yǎng)缺陷型菌株與受試化學物溫育后在缺乏相應營養(yǎng)物的培養(yǎng)液中的生長情況判斷所試化學物的誘變活

6、性，節(jié)省試驗材料(輔酶其需Ames平板摻入法用量的20%)。實驗結(jié)果表明，Ames試驗結(jié)果與動物致突變性有90%的相符率，而彷徨試驗對于弱的、具有細胞毒性和低濃度的誘變致突變物的檢測有其優(yōu)超性。因此這些方法是較好的化學物質(zhì)誘變活性評價的試驗方法。1  材料1 受試藥物蒲葵子正丁醇提取物：蒲葵子分別用95%乙醇回流提取，濃縮成浸膏后，用正丁醇反復浸提，得到提取物的濃縮部分(以下簡稱蒲葵子提取物)。2 實驗菌株鼠傷寒沙門氏菌變異株組氨酸缺陷型TA100(由美國SIGMA公司提供)，經(jīng)鑒定為合格菌株，置于平板備用。3 陽性對照物 2-氨基芴，美國SIGMA公司；疊氮鈉，美國SIGMA公司。

7、4 Ames試驗培養(yǎng)液按文獻方法1配制，彷徨試驗培養(yǎng)液按美國SIGMA公司提供方法配制，體外活化系統(tǒng)(S9混合液)按標準方法經(jīng)多氯聯(lián)苯誘導大鼠肝微粒體酶制備而成2。2 方法2.1 Ames試驗用標準平板摻入法1，在經(jīng)滅菌的45左右含頂層瓊脂2 ml的試管中，依次加入受試物、菌液各0.1 ml，S9混合液0.5 ml，充分混勻后倒在底層培養(yǎng)基平板上鋪平，37培養(yǎng)48 h，每次試驗同時設陰性，陽性對照，每個濃度設兩個平行平皿，每個受試物至少重復1次，計數(shù)平均每毫升回空菌落數(shù)。2.2 彷徨試驗（改進的Ames試驗）3取含組氨酸 (2 gm1)的培養(yǎng)液5 ml加過夜培養(yǎng)菌液0.1 m1，S9混合液0.

8、1 ml和待測物0.1 ml，搖勻分裝于50支小試管中，同時做陰性對照，37培養(yǎng)20 h，各管加入古溴甲酚紫(5 gm1)的培養(yǎng)液2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，計數(shù)變色管數(shù)。         3 結(jié)果3.1 Ames試驗凡致突變率(MR=受試物平均回變菌落數(shù)陰性對照回變菌落數(shù))大于或等于2，有劑量反應關系并有重復性的受試物為誘變陽性4，結(jié)果見表1。由表1可見蒲葵子提取物對TA100(+S9-S9)在5500 g/ml劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出誘變陽性。進一步分析見表2，可以看出隨著兩種化合物濃度的增加，致突變率均相應增高，經(jīng)統(tǒng)計

9、學處理，證明濃度與致突變率間呈直線相關，表明蒲葵子提取物有一定的誘變活性。表1  蒲葵子提取物Ames試驗結(jié)果受試物濃度（略）表2  Ames試驗陽性結(jié)果劑量-反應關系比較（略）3.2 仿徨試驗結(jié)果按公式X2=2n（t-c）2 /（t+c）（2n-t-c）(n為50支試管數(shù)，t為實驗組變色管數(shù)，c為對照組變色管數(shù))，求P值，當P0.05時，判斷為致突變陽性。由表3可以看出在Ames試驗中蒲葵子提取物在劑量為0.025，0.5 g/ml時不顯示誘變活性，在彷徨試驗中對TA100在加S9時表現(xiàn)誘變活性。而且在5500 g/ml時仍顯示陽性結(jié)果。表3  蒲葵子提取物彷徨

10、試驗結(jié)果受試物濃度（略）比較兩種試驗結(jié)果可知：在Ames試驗只有在較高濃度時呈現(xiàn)陽性反應。而彷徨試驗可以在比其低數(shù)十倍甚至數(shù)百倍濃度時呈現(xiàn)陽性結(jié)果，說明彷徨試驗的靈敏度高于Ames試驗，而且兩者可以相互補充。4 討論   Green等（1976）發(fā)明的彷徨試驗（Fluctuation test)是Ames試驗的一種改良法。它用液體培養(yǎng)基代替固體培養(yǎng)基，以觀察培養(yǎng)管濁度或pH指示劑顏色的變化代替菌落計數(shù)，用試管代替培養(yǎng)皿。通過直觀地對各試管中液體顏色變化的計數(shù)，再利用公式對組間進行2檢驗，其結(jié)果判定簡單、直觀、明確、可靠。其檢測效力已被許多研究者所證實。1978年Gateho

11、use將其改進為彷徨試驗方法，通過文獻了解到該方法與常用的篩選致突變物試驗Ames試驗（摻入法）比較，有如下的優(yōu)點：有較高的敏感性，可以檢測出誘變性較弱的致突變物，從而避免因方法靈敏性較差而造成的假陰性結(jié)果。樣品、試劑消耗量少，可同時進行數(shù)個樣品的檢測。彷徨試驗所用菌株為TA100，該菌株可用來檢測點突變和移碼突變5，該菌株在無外源性組氨酸供給的情況下不能生長繁殖，但當發(fā)生回復突變時則可在無外源性組氨酸供給的情況下生長繁殖。由于一些外源性化學物需經(jīng)體內(nèi)代謝活化才具有誘變活性或經(jīng)代謝而解毒，為了模擬哺乳動物對外源性物質(zhì)的體內(nèi)代謝活化過程，提高測試的準確性，通常在Ames試驗中添加哺乳動物肝微粒體

12、酶制劑（S9）作為外源性物質(zhì)代謝活化系統(tǒng)6。彷徨試驗能夠靈敏、迅速地檢測到基因的突變情況，是基因突變檢測的主要方法之一。   據(jù)文獻報道，應用Ames試驗平扳摻入法嚴重不足之點是被測化學物、S9液、組氨酸加進頂層后可能擴散到底層去，它們的濃度有隨時間延長而下降的趨勢，從而影響實驗結(jié)果，如要提高測試物濃度，其毒性可能威脅細菌的生存 。而彷徨試驗克服了這一缺陷，由于其自發(fā)突變率和誘發(fā)突變率均從相當數(shù)量的細胞中顯示出來，且又為液體誘變，故敏感性高于平皿試驗，對某些陽性誘變物的檢出濃度比Ames試驗低100倍。本次實驗也證明了彷徨試驗的高靈敏特點，因而適于檢測低水平及很弱的誘變劑。

13、但此法操作費時，一般可作為Ames試驗的補充方法。這兩種方法對人和動物的體液監(jiān)測，環(huán)境致突變因素的研究及流行病學調(diào)查中潛在致癌物的檢測具有十分重要的作用?！緟⒖嘉墨I】  1謝恩C·加德編著，范玉明，李毅民，張 舒，等譯.藥物安全性評價M.北京：化學工業(yè)出版社,2006：162. 2闞建全,王雅茜,陳宗道，等.甘薯活性多糖抗突變作用的體外實驗研究J.中國糧油學報,2001,16(1):23.3彭克軍,劉杰麟.戴氏蟲草多糖抗突變活性的研究J.中藥材,2008,31(1):86.4王明臣,張善鋒,毛紅麗,等.Ames實驗對葉黃素的致突變性與抗突變性研究J.癌變·畸形·突變,2006,18(1):65.5Ordaz-Pichardo C,etal.Antiamoebic and toxicity studies