豬傳染性胃腸炎病毒基因工程疫苗研究進展.docx

1、吱物技木通報綜述與專論BIOTECHNOLOGYBVLLETIN豬傳染性胃腸炎病毒基因工程疫苗研究進展楊恒夏雪山李盛陶陳偉(昆明理工大學牛.命科學與技術(shù)學院，昆明650224)插要：豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎4(TGEV)引起豬的一種高度接觸性腸道疾病，可導致仔豬發(fā)生產(chǎn)童的嘔吐、腹瀉與脫水，死亡率可達100%。口腹疫苗是TGEV基因工程疫苗研允的主要方向，目前巳在蹤病毒、加藺、捋也因技物及DNA疫苗中對TGEV的S基因進行了表達，并對其口服免疫后的免疫原性進行研究?，F(xiàn)針對TGEV基因工程疫苗近年來研究的概況進行綜述，分析其優(yōu)點與不足，并對其未來的發(fā)展進行展望。關(guān)鍵詞：豬傳染牲胃腸炎病毒基

2、因工程疫苗口服免疫ResearchProgressofTransmissibleGastroenteritisVirus(TGEV)GeneticEngineeringVaccineYangHengXiaXueshanLiShcngtaoChenWei(CollegeofLifeScienceandTechnology,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650224)Abstract：Porcinetransmissiblegastroenteritisisahighlycontagious,entericdiseaseofswine

3、causedbytransmissiblegastroenteritisvirus(TGEV).Thediseaseisespeciallysevereinbabypigslessthantwoweeksold,characterizedbyvomiting,severediarrhe-a,andnearly100%mortality.NewdevelopmentsofTGEVgeneticengineeringvaccinehavefocusedonproductionanddeliveryoftheSproteinthroughoralimmunization.Atpresent,seve

4、ralsystemssuchasadenovirus,bacteria,transgenicplant,andDNAvaccinehavebeenusedtoexpresstheTGEVSproteins.Afteroralimmunization,theimmunogenicityofthesevaccineshasbeenstudied.TheresearchprogressofTGEVgeneticengineeringvaccinewerereviewedinthisarticle,itsadvantage,disadvantageandfurtherdevelopmentwereal

5、soprospected.Keywords:TransmissiblegaslroenteritisvirusGeneticengineeringvaccineOralimmunization收稿日期：2010-10-08基金項目：云南省自然科學基金項lj(2010ZC058)作者筒介：楊恒.男.博士.講師.研究方向：動物傳染病學與病毒分子生物學；E-mail：yaMheng2008.cool豬傳染性胃腸炎(transmissiblegastroenteritisofswine,TGE)是由冠狀病毒科(coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)豬傳染性胃腸炎病毒(tran

6、smissiblegastroenteritisvirus,TGEV)引起豬的一種高度接觸性腸道疾病c該病以嘔吐、嚴重腹瀉和失水為特征，各種年齡和品種的豬均易感，尤其是兩周齡以內(nèi)的仔豬感染后致死率可高達100%,該病是導致世界各養(yǎng)豬國家仔豬早期死亡的重要疫病之一。近年來，隨著TGEV流行危害的進一步加劇，我國各地不斷有從豬場分離出該病毒的報道f2_4Jo每年冬季和早春寒冷季節(jié)TGEV常呈爆發(fā)性流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。在國際動物衛(wèi)生法典中，豬傳染性胃腸炎被列入B類傳染病，是我國法定重點防控的疫病之一。1豬傳染性胃腸炎病毒的致病機理TGEV無論通過口腔還是鼻腔途徑感染，病毒都被吞咽

7、入消化道。在消化道中TGEV能抵抗低pH和蛋白酶水解而保持活性.直至與高度易感的小腸上皮細胞接觸。病毒通過分布于小腸上皮細胞表面的氨基肽酶N(porcineaminopeptidaseN,pAPN)")和大小約200kD的黏蛋白型糖蛋白(mucin-typeglycoprotein,MGP)兩種受體句，特異性侵入小腸絨毛上皮細胞并在其中大量增殖，導致上皮細胞死亡并大國脫落，小腸絨毛顯著萎縮。由于小腸內(nèi)的酶活性明顯降低，擾亂機體正常的消化和腸上皮細胞對營養(yǎng)物質(zhì)與電解質(zhì)的運輸，引起急性吸收不良綜合癥。同時，對于新生仔豬而言，小腸黏膜上皮細胞的損害，導致產(chǎn)生乳糖酶的酶類機制受阻，妨礙了糖類

8、的分解吸收，腸管內(nèi)的滲透壓增高，導致液體的滯留，甚至從機體組織中吸收液體，引起病豬失水、代謝性酸中毒，發(fā)生腹瀉和脫水。最后，仔豬由于脫水和代謝性酸中毒以及由于高血鉀而引起的心、腎功能衰竭導致死亡。2TGEV的免疫保護機制及目前主要防控措施TGEV感染后康復豬的攻毒試臆表明，腸道黏膜局部免疫應(yīng)答，尤其是針對TGEV的slgA抗體可有效中和病毒從而阻止病毒對小腸絨毛上皮細胞的感染。雖然仔豬在出生后即具備產(chǎn)生黏膜抗體免疫應(yīng)答的能力，但需較長時間才能達到成年豬抗體免疫應(yīng)答的產(chǎn)生水平。因此，試圖通過給仔豬疫苗接種，使其在出生后關(guān)鍵的頭幾天快速產(chǎn)生抗TGEV感染的主動免疫應(yīng)答希望不大。被動免疫在保護新生仔

9、豬免受TGEV感染中起著至關(guān)重要的作用，特別是母豬乳汁中的slgA抗體可有效抵抗胃腸道中蛋白酶水解，在抗TGEV感染中起著關(guān)鍵作用。妊娠母豬乳腺中產(chǎn)生slgA抗體的漿細胞來源于腸道相關(guān)淋巴組織（GALT）,它被腸道中的抗原物質(zhì)激活后進一步移行至乳腺定植，并將IgA抗體分泌至初乳和常乳中1891o因此，通過“腸-乳腺”免疫軸的激活，激發(fā)母豬乳汁中slgA抗體產(chǎn)生，是保護仔豬免受TGEV感染的一個主要途徑。目前對TGEV感染尚無有效的治療藥物，疫苗接種仍然是該病的主要防控措施。在生產(chǎn)中使用最為廣泛的疫苗為TGEV弱毒苗，在免疫方式上主要采取懷孕母豬的肌肉注射和口服免疫。肌肉注射雖可有效激發(fā)懷孕母豬

10、血清中IgG抗體的產(chǎn)生，但由于無法激活GALT,因此不能有效激發(fā)母豬乳汁中slgA抗體的產(chǎn)生，往往不能給仔豬提供有效的免疫保護。懷孕母豬口服弱毒疫苗免疫似乎是激發(fā)GALT的一個合理的方式，但效果尚不理想。其主要原因在于致弱后的病毒在小腸只能進行極為有限的增殖，導致對GALT中產(chǎn)生slgA抗體的漿細胞的抗原刺激較少，相應(yīng)乳汁中IgA抗體分泌也較少。此外，在使用弱毒疫苗時，另一個值得注意的問題是弱毒疫苗存在毒力返強和散毒的潛在危險?；谏鲜鰡栴}，進一步研究簡便、安全、能有效激活GALT的TGEV基因工程疫苗仍然十分必要。3豬傳染性胃腸炎病毒基因工程疫苗研究TGEV可編碼3種主要結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（

11、S蛋白）、膜內(nèi)在（M）蛋白和核衣殼（N）蛋白。S蛋白為高度糖基化蛋白，突出于病毒粒子囊膜表面，其上含有宿主細胞氨肽酶N（pAPN）的識別位點，在病毒感染、發(fā)揮致病性和決定宿主細胞親嗜性等方面起關(guān)鍵作用【'°-。S蛋白的N端包含了A、B、C和D4個主要的B淋巴細胞抗原決定位點，是誘導機體產(chǎn)生TGEV中和抗體的主要區(qū)域UJ5o研究表明，S蛋白N端可激發(fā)與全長S蛋戶|相當?shù)闹泻涂贵w的產(chǎn)生"6）。在TGEV的3個主要結(jié)構(gòu)蛋白中，S蛋白是唯一能誘導產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護作用的結(jié)構(gòu)蛋白，因此S基因成為TGEV基因工程疫苗研究的首選抗原基因。同時，為有效激發(fā)腸道黏膜免疫應(yīng)答，

12、口服疫苗成為TGEV基因工程疫苗研究的重點。因此，目前已在多種不同的載體系統(tǒng)中對全長或截短的S蛋白進行了表達，并對其口服免疫后的免疫原性進行了研究。3.1以病毒為載體表達S蛋白腺病毒易于培養(yǎng)純化，病毒產(chǎn)址高，在腺病毒基因組中特定區(qū)域內(nèi)插入外源DNA,不影響病毒增殖，而且還能使外源基因良好表達。口服重組腺病毒后，可誘導較強的系統(tǒng)免疫反應(yīng)與局部的黏膜免疫應(yīng)答。因此，腺病毒較早作為TGEV口服基因工程疫苗的活載體。Torress等如用人腺病毒5（AD5）為載體，構(gòu)建了系列表達S基因不同片段的更組腺病毒，將表達A-D4個主要抗原位點的重蛆朕病毒通過口鼻和腹膜途徑接種豬，可誘發(fā)豬血清中TGEV中和抗體的

13、產(chǎn)生。將免疫后的豬血清與致死劑質(zhì)的TGEV混合后口服接神乳豬，可被動地減少仔豬的腹瀉和死亡，但不能抵抗TGEV的感染。這說明重組腺病毒口鼻和腹膜途徑接種豬后產(chǎn)生的抗體效價不高，不能完全中和病毒。由于采用人腺病毒作為動物病毒載體存在安全問題，因此Tuboly等回采用豬腺病毒（PAdV-5）分別構(gòu)建了表達全KS基因和S基因5'端約2.2kb的重組豬腺病毒，從中篩選出3個重蛆腺病毒經(jīng)口接種易感豬。結(jié)果表明,重絹腺病毒同時誘發(fā)了針對TGEV和PAdV-5的特異性血清IgG抗體，且在免疫豬的小腸和肺臟中檢測到TGEV分泌型IgA抗體，但用TGEV對接種豬進行攻毒，其結(jié)果如何有待進一步研究。3.2

14、 以細菌為載體表達S蛋白隨著以腸道細菌為活載體傳遞抗原進而激發(fā)腸道粘膜免疫這一技術(shù)路線的提出，研究者也試圖在腸道菌中表達TGEV的S蛋白，進行重組活菌的口服免疫。目前研究主要集中在減毒沙門氏菌、乳酸桿菌等腸道曲上。與活病毒載體疫苗相比，其優(yōu)勢在于細菌培養(yǎng)操作簡單，成本低廉。Smerdou等將編碼TGEVS$白氨基端、按基端、中間段以及全長S蛋白的4個基因片段分別插入原核表達質(zhì)粒pYA292(asd+)中,轉(zhuǎn)化入減毒鼠傷寒沙門氏菌乂3987(asd-、cya-和crp-)中進行表達。結(jié)果表明，編碼S蛋白氨基端與全長S賀白的基因片段能在沙門氏菌中穩(wěn)定表達，且兩種重組菌在體外連續(xù)繁殖50代后仍有60

15、%和20%的重組菌能持續(xù)表達S蛋白氨基端與全長S蛋白。將表達S蛋白氨基端的重組沙門氏菌口服免疫豬后，細菌在空腸中定植的時間長達10-20d,在豬的血液和唾液中均檢測到TCEV特異抗體。Smerdou等)還將不同拷貝數(shù)的S蛋白D抗原位點與大腸桿菌熱不穩(wěn)定B毒素亞基在減毒鼠傷寒沙門氏菌X3987中進行了融合表達，將重組菌口服免疫家兔后可誘導血清中TGEVIgG抗體和腸道黏膜中TGEVslgA抗體的產(chǎn)生，但在小腸中sl-gA抗體滴度較低。除在沙門氏菌的胞質(zhì)中進行TGEVS蛋白的表達外，研究者也在沙門氏菌的菌毛上對S蛋閂的抗原位點進行表達mm。其優(yōu)勢在于表達的抗原蛋白直接位于細菌的表面.能更好地刺激免

16、疫應(yīng)答。但由于是將抗原位點嵌合在菌毛中表達，因此只能表達很短的一段抗原肽，這極大地限制了特性抗體應(yīng)答的強度。H。等*:在乳酸桿菌中成功進行了TGEVS蛋白N端約75kD的重組蛋白的分泌表達。將重組萌口服免疫小敏后，可檢測到接種的小鼠產(chǎn)生了針對TGEV的特異性血清IgG和IgA,誘導的抗體具有一定的TGEV中和活性。唐麗杰等網(wǎng)也報道，將表達TGEVS蛋白的重組乳酸乳球菌口服免疫可激發(fā)腸道黏膜產(chǎn)生抗TGEVIgA抗體c轉(zhuǎn)基因植物表達S蛋白近年來，植物基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，將病原微生物的抗原基因在農(nóng)作物中進行表達，研制可食疫苗成為當前植物基因工程研究的一個重要方向。在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中表達抗原蛋白進行

17、口服免疫具有成本低廉、免疫途徑簡單，疫苗存儲無需冷藏設(shè)備，可大范圍給藥等優(yōu)點勺。Comez等】將分別編碼TGEVS蛋白氨基端與完整S蛋白的基因片段與花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動子組成表達盒，通過基因重組將表達盒整合入擬南芥植物基因組中。結(jié)果表明，整合入植物基因組中的S蛋白得以表達。從轉(zhuǎn)基因擬南芥葉子中提取的重組蛋白免疫小融后可激發(fā)血清中TGEV抗體的產(chǎn)生，且抗體具有一定的中和活性。Gomez等又在轉(zhuǎn)基因馬鈴磬表達了TGEVS蛋白的氨基端區(qū)域(N-gS),將從馬鈴薯塊莖中提取出的重組N-gS蛋白通過腹膜內(nèi)途經(jīng)免疫小鼠，接種的小鼠產(chǎn)生了針對TGEV的特異性血清IgG,而且用表達N-gS的馬鈴

18、薯塊莖直接飼喂小鼠時，小鼠也產(chǎn)生了針對S糖蛋白特異性血清抗體。Lamphear等皿構(gòu)建了表達S基因的轉(zhuǎn)基因玉米，用該轉(zhuǎn)基因玉米種籽飼喂母豬，母豬血清、初乳和常乳中均檢測到TGEV抗體的產(chǎn)生。3.3 S基因DNA疫苗研究DNA疫苗免疫后能有效激發(fā)細胞免疫與體液免疫，具有安全可靠、便于多價苗和多聯(lián)苗研制、制備工藝簡單及存儲運輸方便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于多種疫病的疫苗研究中，并取得良好的試驗效果月前，對于TGEVS基因的DNA疫苗，已進行了初步的研究。任曉峰等以真核表達質(zhì)粒pCI為載體，構(gòu)建了含S基因主要抗原位點的DNA疫苗，肌肉注射免疫小鼠后可誘導小鼠血清中特異性TGEVIgG抗體的產(chǎn)生，顯示了良好

19、的免疫原性。近年來，以減毒細菌為載體攜帶DNA疫苗進行口服免疫被證實是激發(fā)黏膜免疫的一種理想途徑:本研究構(gòu)建了含S基因主要抗原位點的真核表達質(zhì)粒PVAX-S,進一步將其轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌SL7207中，構(gòu)建了攜帶TGEVS基因DNA疫苗的重組沙門氏菌SL7207(pVAX-S)o將重組沙門氏菌口服免疫小鼠后.結(jié)果表明，除可有效激發(fā)免疫小鼠血清中特異性TGEVIgG抗體的產(chǎn)生，也可有效激發(fā)免疫小鼠腸道中slgA抗體的產(chǎn)生4問題與展望盡管目前在TGEV基因工程疫苗研究上取得了可喜的成果，但上述幾種形式的TGEV基因工程仍存在-些不足。以腺病毒作為載體，一方面其外源基因容量較小難以克隆大片段或多個外

20、源基因的表達；另一方面由于表達蛋白大小受限，導致機體免疫系統(tǒng)對腺病毒大蛋白的強烈應(yīng)答，可能消弱外源蛋白誘導的免疫應(yīng)答反應(yīng)七在腸道細菌中表達抗原蛋白其缺陷在于細菌中表達的抗原蛋白無法進行正確的翻譯后修飾與慵基化，這極大地影響表達賀白的免疫原性；同時，重蛆細菌在體內(nèi)存活時間，赍白在細菌中的表達最、穩(wěn)定性等問題也仍需進一步研究與完善'偵。轉(zhuǎn)基因植物疫苗目前尚待解決的問題主要有兩個：一是轉(zhuǎn)基因植物中抗原蛋向表達量:普遍較低，限制了食入轉(zhuǎn)基因植物后激發(fā)的免疫應(yīng)答強度；二是轉(zhuǎn)基因植物中的抗原蛋白在通過胃腸道時容易受到降解而喪失其免疫原性以減毒沙門氏菌攜帶DNA疫苗曰服免疫，存在免疫后機體內(nèi)細菌攜帶

21、的高拷貝質(zhì)粒迅速丟失的情況，同時針對沙門氏菌載體的免疫應(yīng)答將消弱其傳遞的DNA疫苗免疫效果叫。綜上，在TGEV口服基因工程疫苗的研究中，目前選用的載體系統(tǒng)各有優(yōu)缺點，但尚沒有合適的載體系統(tǒng)能同時滿足以下3點：（1）S蛋白能大址的表達；（2）表達的S蛋白能有效進行翻譯后修飾、折疊；（3）有效避開胃腸道對表達的S蛋白的消化降解。冠狀病毒是自然界最大的單股正鏈RNA病毒，對TGEV全長cDNA克隆的拯救成功，是RNA病毒反向遺傳研究的一個重要突破。Almazan等叫在TGEV的感染性cDNA克隆的基礎(chǔ)上進行了基因置換，將來源于呼吸道嗜性的弱毒株基因組全長cDNA克隆中的S基因替換為具有腸嗜性強毒株的

22、S基因，結(jié)果所拯救的病毒是具有腸嗜性的強毒株，這表明可通過反向遺傳技術(shù)來改變TGEV的組織嗜性和毒力。Izeta等順將創(chuàng)造一個來自TGEV和呼吸道毒株嵌合的病卷用于表達S蛋白，如果能把它充分致弱，這種嵌合病毒有望成為候選TGEV疫苗C參考文獻I 斯待勞BE.主編.趙德明.張中秋，沈建忠，洋.豬病學(第8版)M.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社,2000:306-338.2j陳煥春，劉超,金梅林.等.豬傳染性當腸炎病健的分島鑒定.華中農(nóng)業(yè)大學學報.1992.1(11):82-86.3 任曉嶺,李一經(jīng)，賈永清，等.豬傳染性肖腸炎病毒國內(nèi)分離株S基因克隆及與國外株的同源性比較.中國獸醫(yī)科技,2002.32(

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