禽用減毒沙門菌活載體疫苗的研究進(jìn)展.docx

1、文缺綜述國用腿雷涉門扇活裁伽哽苗的研拜迅展*II朱麟'，王紅寧2（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川雅安625014；2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川大學(xué)動(dòng)物疾病防控生物工程研究中心，四川成都610064）疫苗主要通過激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)來達(dá)到防治疾病的目的。目前，疫苗主要有滅活疫苗、減毒疫苗及基因工程疫苗等。基因工程疫苗包括基因缺失苗、基因重組苗等。活載體疫苗是將胞內(nèi)感染性的細(xì)菌直接用來運(yùn)載目的基因進(jìn)入體內(nèi)，而產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。目前沙門菌的預(yù)防與治療通常使用藥物"但沙門疫苗研究正退速發(fā)展，如減毒沙門萌活載體疫苗則是將減毒后的沙門菌作為載體，運(yùn)載編碼抗原的基因進(jìn)入體內(nèi)，激發(fā)

2、免疫反應(yīng)。很多實(shí)驗(yàn)證明，減毒菌能對與活載體相關(guān)細(xì)菌產(chǎn)生免疫保護(hù)力，又能對插入基因相關(guān)疾病產(chǎn)生保護(hù)力，有效激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，同時(shí)不會對該細(xì)菌的生存與繁殖產(chǎn)生影響3氣減毒沙門菌可侵入到宿主的Peyer集結(jié)、腸淋巴結(jié)、肝、脾等組織細(xì)胞，表達(dá)異源抗原，不僅激發(fā)出宿主針對沙門菌本身的免疫反應(yīng)，而且激發(fā)出針對其所攜帶抗原的各種免疫反應(yīng)，包括局部體液免疫、全身體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，尤其是CTL作用，而減毒沙門曲本身可以起到免疫佐劑的作用。由于已減毒，最終可被宿主清除。減毒沙門菌作為載體運(yùn)送目的基因進(jìn)入體內(nèi)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。在這一過程中既能保證載體疫苗的安全性，又能以誘導(dǎo)保

3、護(hù)性免疫應(yīng)答的方式表達(dá)外源抗原。減毒沙門菌活載體疫苗可以攜帶較大的基因片段，易于構(gòu)建多價(jià)疫苗，具有聯(lián)合免疫和免疫佐劑的作用，所表達(dá)的靶抗原不需要提純，能激起持久的系統(tǒng)和黏膜免疫反應(yīng)，同時(shí)，還具有誘導(dǎo)作用位點(diǎn)比較明確、制備簡單、安全性好、批最生產(chǎn)成本低、接種簡單方便等優(yōu)點(diǎn)，2成為疫苗領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來有實(shí)驗(yàn)表明，減毒沙門菌可將克隆有異源抗原基因的真核表達(dá)質(zhì)粒攜帶并釋放入宿主深部淋巴細(xì)胞，使異源抗原基因在淋巴細(xì)胞的真核環(huán)境中進(jìn)行表達(dá)。因此，減毒沙門菌既可作為針對同源抗原的活疫苗，也可作為誘導(dǎo)針對其他病原微生物產(chǎn)生保護(hù)性反應(yīng)的載體。減毒沙門菌載體的構(gòu)建策略是使致病基因缺失，然后將外源基因整合到沙

4、門菌染色體的特定部位，這樣沙門菌就可以穩(wěn)定表達(dá)外源基因。異源抗原的表達(dá)目前主要采用帶抗性的質(zhì)粒載體進(jìn)行表達(dá)、利用染色體整合系統(tǒng)或構(gòu)建平衡致死系統(tǒng)3種方法。沙門菌減毒株多為生物合成途徑缺陷或調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng)缺陷的突變株，如aro、phoP或bQ突變株。這些菌株可以模擬自然感染但不引發(fā)疾病，并有很好的耐受性和免疫原性,這就有助于我們構(gòu)建減毒沙門菌活載體疫苗，呈遞外源抗原，預(yù)防各種病原體引起的疾病氣1國內(nèi)外研究進(jìn)展隨著分子生物學(xué)的應(yīng)用和對沙門菌致病機(jī)制的進(jìn)一步了解，人們能夠識別病原體在宿主體內(nèi)生存和致病的一些必需基因，這些基因的缺損在遺傳上是穩(wěn)定的，因此可以通過基因工程的手段使沙門菌達(dá)到的效果。1987

5、年Curtiss等構(gòu)建了cya.crp雙基因突變株，因該菌缺失基因，不能合成cAMP受體蛋白，乂缺失cya基因，亦不能從宿主體內(nèi)攝取cAMP以供己用，所以它在宿主體內(nèi)返強(qiáng)的可能性很小。Curtiss研究組在1994年發(fā)展了一種asd/asd-平衡致死體系。該系統(tǒng)沙門萌染色體上md基因的缺失突變由質(zhì)粒載體攜帶的以#來彌補(bǔ)。已將5上引入其他如aroycya、crp減毒株中用來表達(dá)肺炎球菌表面蛋白A(PspA)并有保護(hù)作用。wd基因編碼天冬氨酸B2半醛脫氫酶，突變后細(xì)菌的生長需要二氛基庚二酸(DAP)以合成細(xì)胞壁，而動(dòng)物組織中沒有DAP,所以這種平衡致死體系保證細(xì)菌進(jìn)入宿主后能穩(wěn)定高效表達(dá)外源抗原o

6、Cuniss等1996年基因編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，該酶催化對氨基苯甲酸和2,4-二羥基苯甲酸鹽的分支酸途徑的中間反應(yīng)，產(chǎn)生芳香族氨基酸皿。當(dāng)耐。A基因缺失，該菌在無此合成途徑的哺乳動(dòng)物體內(nèi)，無法獲得這些化合物，生長受到限制從而被減毒。Fagan等于1997年用鼠傷寒桿萌SL3261(q”A)減毒株表達(dá)豬肺炎支原體抗原(NrdF)蛋白回。McSorley等在1997年研究認(rèn)為nirB啟動(dòng)子比osmC啟動(dòng)子效率高。利用這兩類體內(nèi)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以穩(wěn)定地在體內(nèi)表達(dá)外源抗原。Guo等在1997年通過質(zhì)譜儀研究發(fā)現(xiàn),PhoP/PhoQ蛋白也調(diào)節(jié)脂多糖(LPS)成分之一類脂A的結(jié)構(gòu)修飾，

7、從而改變LPS刺激的宿主細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)皿。HeithofF等在200()年發(fā)現(xiàn)pAoP基因可激活多種基因表達(dá)，而phoP蛋白或pAoP調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物可在GATC位點(diǎn)封閉dm的甲基化，還有人認(rèn)為phoP基因調(diào)節(jié)的一個(gè)基因可能編碼細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中存活所必須的種分泌蛋白,phoP基因的突變會減弱鼠傷寒沙門菌在巨噬細(xì)胞中的存活力，Ty800、X4632、ZJ111都是缺失phoP/phoQ基因的突變株14oBumann等在2000年的研究中發(fā)現(xiàn)htrA突變株增強(qiáng)了對氧化應(yīng)激的敏感性，從而削弱了它在宿主組織中生長的能力:。小鼠免疫實(shí)驗(yàn)證明限定型htrA突變是極好的口服疫苗。在對人有副作用的減毒株CV

8、D908中引入htrA突變后，減毒株安全且保持免疫原性。Basso等于20(X)年篩選了傷寒桿菌細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)啟動(dòng)子Pial、Pia2,構(gòu)建了一系列表達(dá)載體在這些啟動(dòng)子控制下，重組沙門菌侵入真核細(xì)胞后條件性表達(dá)外源抗原。該系統(tǒng)已在Henle407細(xì)胞中表達(dá)百口咳毒素S1亞單位重組抗原得以驗(yàn)證。梁雪芽等2002年研究表明，基因編碼DNA腺苜酸甲基化酶，此酶調(diào)肯的基因在其啟動(dòng)子或上游調(diào)節(jié)序列中都含有GATC位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的甲基化可以控制RNA聚合酶和調(diào)節(jié)蛋白的相互作用S。此外,如基因還調(diào)節(jié)其他毒力相關(guān)基因的表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)亮氛酸(leucine,Leu)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白和菌毛基因DNA序列的結(jié)合來控制菌毛

9、的表達(dá)。2003年張輝等將小d基因連接到相關(guān)質(zhì)粒上導(dǎo)入asd突變株中，構(gòu)成載體-宿主平衡致死系統(tǒng)，既保證了質(zhì)粒的穩(wěn)定又提供了細(xì)菌細(xì)胞壁合成所需的DAP,此系統(tǒng)因不含耐藥基因被廣泛的應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)中響。目前國內(nèi)外學(xué)者對減毒沙門菌活載體疫苗應(yīng)用方面的研究也越來越多。Hassan等于1996年研制出的MeganVacI疫苗就可以在食品安全控制方面加以應(yīng)用，該疫苗是cya和erp基因突變的鼠傷寒沙門菌。家禽口服免疫M(jìn)eganVacI疫苗后，可以特異性地降低沙門菌感染。用MeganVac1疫苗接種雞，產(chǎn)生了特異性針對B群和D群沙門菌的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著降低了野生型菌株在雞體內(nèi)的重新定殖，而且還可以

10、對其他血清型沙門菌感染產(chǎn)生交又保護(hù)。種雞群接種MeganVacI疫苗后，可產(chǎn)生持久的、具有保護(hù)性的母源抗體，這大大降低了沙門曲污染雞蛋的可能性。Jain等在2001年研究發(fā)現(xiàn)沙門菌載體可以用于腫瘤的基因治療，如表達(dá)IL-2,或用于運(yùn)送抗腫痛治療藥物，如抗腫瘤前體藥物轉(zhuǎn)化酶用。由于沙門菌具有對實(shí)體瘤的自然趨向性，根據(jù)這一特性，利用鼠傷寒沙門菌VNP20009可運(yùn)送藥物蛋白到腫瘤部位，臨床研究表明，腫瘤細(xì)胞在原位被選擇性殺死。鼠傷寒沙門菌VNP20009是pwl(負(fù)責(zé)嗦吟生物合成)和眥B(負(fù)責(zé)LPS生物合成)基因缺失株，因而毒力大為降低，其對小鼠的毒力較野生型菌株大約下降了10000倍。杜愛芳等在

11、2004年將雞柔嫩艾美耳球蟲5401基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-5401,高壓電轉(zhuǎn)化到ds和phoP基因雙突變的減毒鼠傷寒沙門菌(ZJ111株)中，構(gòu)建重組菌株，將其直接轉(zhuǎn)染Ver。細(xì)胞，證明了減毒沙門菌能將外源基因呈遞給Vero細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。通過雞體內(nèi)試驗(yàn)和體外培養(yǎng)表明，利用減毒沙門菌為載體傳遞DNA疫苗具有良好的安全性和穩(wěn)定性。張曉明等在2005年利用場/A基因突變的沙門菌能破壞含沙門菌囊泡（SCV）的特性，利用P22噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將Sg基因的突變轉(zhuǎn)入疫苗株SL7207,成功地構(gòu)建了沙門菌SL7207Sifh突變株。該突變株可以突破SCV的束縛而進(jìn)入細(xì)胞液，并有望成為理想的沙門菌疫苗

12、載體。張小榮等于2006年根據(jù)GenBank中已發(fā)表的H5亞型禽流感病毒HA基因序列，設(shè)計(jì)一對引物，通過RT-PCR擴(kuò)增鵝源H5亞型高致病力禽流感病毒HA基因，測序確認(rèn)后，將其克隆入其核表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染P815細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)，HA基因在細(xì)胞內(nèi)得到了瞬時(shí)表達(dá)。進(jìn)一步將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門菌X4550得到運(yùn)送DNA疫苗的重組沙門菌，免疫BALB/c小鼠，不僅可以檢測到HA特異性的血清抗體應(yīng)答，而且還能抵抗穩(wěn)定表達(dá)H5亞型禽流感病毒HA基因的P815肥大細(xì)胞瘤的攻擊，說明該運(yùn)送DNA疫苗的減毒沙門菌系統(tǒng)在體內(nèi)能夠成功釋放所攜帶的質(zhì)粒，并且能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。潘

13、志明等根據(jù)GenBank中發(fā)表的新城疫病毒融合蛋白（F）基因序列，設(shè)計(jì)一對引物，通過RT-PCR擴(kuò)增出鵝源新城疫病毒分離株JS-5F基因，測序確認(rèn)后，將其克隆入真核表達(dá)載體pVAXl,將pVAXl-F轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門菌X4550,獲得運(yùn)送DNA疫苗的重組沙門菌X4550（pVAXl-F）。免疫CD1小鼠，可以檢測到特異性針對NDVF蛋白的血清抗體應(yīng)答，表明該運(yùn)送DNA疫苗的減毒沙門菌系統(tǒng)在體內(nèi)能夠成功釋放所攜帶的質(zhì)粒，并能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答李龍等用長距離RT-PCR擴(kuò)增了傳染性法囊病病毒ZJ2000株多聚蛋白基因，定向克隆入真核表達(dá)載體pCI,電轉(zhuǎn)化dam-pho?'雙突變的減毒

14、鼠傷寒沙門菌ZJ111株，并直接轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)可從Vero細(xì)胞中檢測到陽性信號.SDS-PAGE和West-blotting均可檢測到41ku的蛋白條帶。結(jié)果表明減毒沙門菌可將外源基因?qū)隫ero細(xì)胞，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，具有免疫反應(yīng)性。Sadoff等將伯瘧原蟲環(huán)子抱子蛋白基因克隆到含有入噬菌體啟動(dòng)子的質(zhì)粒pMG27NSTerm上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pMGB2,轉(zhuǎn)化aroA突變的鼠傷寒沙門菌WR4017株，灌胃接種BALB/c小鼠，灌胃接種的小鼠沒有測到特異性抗體，但是小鼠獲得抵抗子抱子攻擊的能力，可見灌胃接種的小鼠雖無體液介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，但有細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。隨

15、后的體內(nèi)淋巴細(xì)胞去除試驗(yàn)和體外CTL作用測試顯示，上述的保護(hù)作用與MHCI限制的CD&CTL作用有關(guān)。目前國內(nèi)外學(xué)者已相繼研制了肺炎鏈球菌、宋內(nèi)志賀菌、結(jié)核分支桿菌、霍亂孤菌、百日咳桿菌、鼠疫耶爾森菌、牛布魯菌、破傷風(fēng)梭菌、沙眼衣原體和豬肺炎支原體、甲乙丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、偽狂犬病病毒、流感病毒、血吸蟲、瘧原蟲以及腫瘤等疾病的重組減毒沙門菌疫苗。這些疫苗都能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答焦紅梅等根據(jù)GenBank公開序列設(shè)計(jì)一對引物，通過RT-PCR擴(kuò)增出小鼠肝炎病毒的全長S1基因，并將其插入真和表達(dá)質(zhì)粒pVAXl中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXl-

16、Sl,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，采用間接免疫熒光檢測出S1蛋白的外源表達(dá)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙門菌SL7207中，接種小鼠，結(jié)果顯示重組萌對小鼠有良好的安全性，并能檢測到針對S1蛋白的特異性血清抗體:&。2存在問題應(yīng)用活載體疫苗也存在一定的局限性：第一，重組表型的穩(wěn)定性，采用細(xì)菌菌株作為異源抗原的疫苗載體，質(zhì)粒的應(yīng)用常常引起重組表型的不穩(wěn)定性，載體的競爭力、可重復(fù)性和效力都得不到保證。另外，在非限制狀態(tài)下菌株的傳遞存在抗生素抗性標(biāo)志。第二，先存的免疫力，如果已對載體菌株有免疫力，則將顯著削弱所誘導(dǎo)的對異源抗原的免疫應(yīng)答。第三，宿主遺傳因素，宿主遺傳因素可以調(diào)控由活菌載體本身

17、或其表達(dá)的疫苗抗原刺激的免疫應(yīng)答。3展望減毒沙門菌不僅可以預(yù)防沙門菌的感染，而且還可以作為異源抗原的載體，構(gòu)建表達(dá)其他病原體保護(hù)性抗原的活疫苗，通過口服和黏膜免疫獲得相應(yīng)局部免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。這種活載體疫苗不僅使用方便，而且成本低廉，尤其適用于規(guī)?；B(yǎng)殖的群體免疫，在疫苗制備過程中避免向環(huán)境散毒的危險(xiǎn)。但其存在的一些局限性仍有待我們進(jìn)一步研究創(chuàng)新，為制備有效的疫苗提供理論基礎(chǔ)，參考文獻(xiàn)：1李郁，巍建忠.李超.等.同時(shí)感染雛格群的兩種血清型沙門做的鑒定及約敏試驗(yàn)J.中國家禽，2008,30(4):45-46.2馮翠蘭，馮國金，龍建勇，等.中草藥消毒劑消推效果的初步研究UL中國家禽.2

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