禽流感病毒核酸疫苗概述及研究進(jìn)展.docx

1、禽流感病毒核酸疫苗概述及研究進(jìn)展孫德剛（山東省黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局266555）摘要：禽流感核酸疫苗作為預(yù)防和根除流感病毒感染的重安措施,已受到廣泛關(guān)注，本文簡要介紹禽流感核酸疫苗的作用機(jī)理以及現(xiàn)有禽流感核酸疫苗的研究現(xiàn)狀及影響因素。關(guān)鍵詞：核酸疫苗；免疫接種；禽流感病斗；研究進(jìn)展高致病性禽流感病毒是由正粘病毒科A型流感病毒中某些Hs和H7亞型流感病毒引起的禽類的一種以高發(fā)病率和高死亡率為特征的烈性傳染病。高致病性禽流感病毒已經(jīng)給各國的養(yǎng)禽業(yè)造成了重大損失，對于高致病性禽流感的防控許多國家都采用撲殺政策和免疫預(yù)防相結(jié)合的措施。使用出亞型禽流感病毒滅活疫苗免疫易感禽足我國防控高致病性禽流感病毒的

2、主要措施之一。而滅活疫苗免疫存在利用常規(guī)的血清學(xué)方法不能區(qū)分出免疫家禽和白然感染禽流感病毒的家禽的缺點(diǎn)，在疫情發(fā)生時會干擾血清學(xué)監(jiān)測。流感病毒的核酸疫苗免疫能夠克服上述不足，1993年Ulmer等首先利用核酸注射技術(shù)來研究流感病毒核酸疫苗，發(fā)現(xiàn)給小鼠肌肉注射編碼A型流感病毒NP的質(zhì)粒DNA后，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體反應(yīng)，可有效地保護(hù)小鼠抵抗另一亞型流感病毒的攻擊，說明它不但能抵抗同型病毒的感染，對異型病毒也有一定的預(yù)防作用，從而證明核酸注射不但能在體內(nèi)表達(dá)抗原蛋白，且可誘導(dǎo)產(chǎn)生具有顯著保護(hù)作用的免疫應(yīng)答l"d從此以后，核酸疫苗廣泛受到關(guān)注。1基因疫苗的免疫保護(hù)機(jī)理DNA免疫可以誘導(dǎo)

3、機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫I，彭金美等分別以HA、tHA、tHA+NP和tHA+NP+lFN為免疫基因構(gòu)建了4個禽流感病成的重蛆質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個重組質(zhì)粒免疫后在攻推前都沒有誘導(dǎo)產(chǎn)生可檢測的HI抗體，但是免疫后第2周免疫雞外周血中CD4和CD8T淋巴細(xì)胞的百分比含質(zhì)呈上升趨勢，免疫后第4周明顯尚于對照組。說明細(xì)胞免疫在DNA免疫中發(fā)揮了重要作用用。在合適條件下接種DNA疫苗后，質(zhì)粒DNA被導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，抗原編碼基因即在質(zhì)粒所帶強(qiáng)啟動了的作用下表達(dá)抗原蛋內(nèi)，隨后被降解成8-12其基酸的短肽，這些短肽含有不同的抗原表位，或者分別MHC-1類分子或者M(jìn)HC-D類分子結(jié)合，然后被抗原提呈細(xì)胞遞呈到細(xì)

4、胞表面，激活相應(yīng)的T細(xì)胞和B細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。盡管基因疫苗接種后在動物體內(nèi)產(chǎn)生的抗原震白量極為有限，但可誘導(dǎo)全面的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答,這與活疫苗相類似，而就目前的免疫學(xué)理論，普遍認(rèn)為等量的抗原蛋白直接免疫動物幾乎不能誘發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Wolf!等認(rèn)為接種了DNA疫苗的宿主成了一個“臨時工廠”，能制造抗原并產(chǎn)生對感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答1.1體液免疫應(yīng)答研究表明禽流感病毒感染及其疫苗免疫反應(yīng)中HI和中和抗體反應(yīng)是兩種取要的體液免疫反應(yīng)。研究表明雞體內(nèi)的H1抗體水平與病毒感染和排毒有關(guān)，抗體水平高時，能夠保護(hù)雞不發(fā)病，不排毒叫HADNA疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫是抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，較高水平

5、的HI抗體通常意味著可靠持久的保護(hù)。對相同毒株或者抗原相似的毒株的再次感染，HA抗體能夠提供完全的保護(hù)作用，對抗原漂移的變異株提供部分保護(hù)效果，而對不同亞型的毒株幾乎不能提供保護(hù)佝。姜永萍等對疫苗質(zhì)粒pCAGgoptiHA5以不同劑址和方法免疫SPF雞，免疫效果表明，pCAGGoptiHA5H有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性。不僅誘導(dǎo)了高水平的HI抗體和中和抗體，而旦中和抗體水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HI抗體水平氣1.2裙胞免疫反應(yīng)HA等能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)，使機(jī)體可以抵抗感染和疾病國。雖然每種流感病毒蛋白（包括HA）均能夠剌激機(jī)體產(chǎn)生CTL反應(yīng)，但是其主要的靶抗原是病毒內(nèi)

6、部蚩白NP。針對NP的CTL反應(yīng)的更要特點(diǎn)包括A型流感病毒多種亞型之間的交又保護(hù)反應(yīng)叫并能夠降低對抗原漂移的敏感性oH1亞型NPDNA疫苗能夠有效交又保護(hù)實(shí)驗(yàn)小鼠免受H3亞型病毒的感染W(wǎng)。由于識別來源于不同流感病毒亞型的保守內(nèi)部蚩白如NP的多肽而表現(xiàn)交又保護(hù)模式，所以CTL在抵抗A型流感病隹方面具有至關(guān)重要的作用。1.3免疫記憶DNA疫苗具有“抗原儲藏器”作用，在沒有加強(qiáng)免疫接種的情況下，能夠連續(xù)不斷的產(chǎn)生蛋白產(chǎn)物刺激免疫系統(tǒng)。Raz等皮內(nèi)接種流感病襟核貌白(NP)的DNA疫苗后，對NP的體液和CTL應(yīng)答至少維持17個月，如果在第7月二次免疫，抗體滴度可達(dá)到原來的10倍嚀。這說明基用免疫能產(chǎn)生

7、免疫記憶效應(yīng)。因此，選擇適當(dāng)時機(jī)加強(qiáng)免疫以提高免疫效果。2國內(nèi)外禽流感病毒基因疫苗的研究現(xiàn)狀目前預(yù)防禽流感病毒最主要的措施是接種全病毒疫苗。由于流感病也保護(hù)性抗原的易變性，需要每年更換疫苗株。Kodihalli等認(rèn)為HADNA疫苗能夠提供機(jī)體抵抗致死性HjN,的免疫保護(hù)，該研究同時表明：當(dāng)新病毒出現(xiàn)的時候，質(zhì)粒DNA的直接接種是可行的叫。目前禽流感病毒基因疫苗的研究主要是針對HA、NA和NP基因開展的。2.1 HADNA疫苗HADNA疫苗一直是預(yù)防新型流感病毒感染的主要研究方向，HA為流感病毒的主要保護(hù)性抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體。HADNA疫苗通過在體內(nèi)表達(dá)病卷HA蛋4抗原，能夠模擬流感病毒的自

8、然感染過程誘發(fā)機(jī)體的保護(hù)性免疫，主要是抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。姜永萍等在多株高致病力禽流感病毒H,亞型與Gs/CD/1/96(HjN,)的HA基因核昔酸序列高度同源的基礎(chǔ)上，構(gòu)建疫苗質(zhì)粒pCAGGoptiHA5oSPF雞免疫效果表明，pCACGopliIIA5具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)件。不僅誘導(dǎo)了高水平的HI抗體和中和抗體，而且中和抗體水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于H1抗體水平明。陳化蘭等構(gòu)建了K1AfriStar/Eng-Q/983/79(H7N1)HA基因真核表達(dá)質(zhì)粒，免疫雞試輪結(jié)果表明HADNA疫苗，在極小的使用劑量下即可成功誘導(dǎo)免疫保護(hù)反應(yīng),并有效阻斷同源低致病性禽流感病毒在機(jī)體內(nèi)的感染和排毒問。2.2

9、 NADNA疫苗NADNA疫苗是流感病毒非常有前景的疫苗。NA蛋白是流感病每的一個重要的外結(jié)構(gòu)蛋n,也是一個重要的抗原傳白。HA和NA為病毒毒力相美的表面糖蛋月叫，HA抗體可以抑制病毒感染1,51,而NA抗體則預(yù)防流感的發(fā)生四。Chen等在對比編瑪PR8病毒HA、NA、Ml、NP和NS1的DNA疫苗的保護(hù)效果時，發(fā)現(xiàn)HADNA免疫能誘導(dǎo)特異性IgG抗體中和病毒，阻止流感病毒感染，而NADNA誘導(dǎo)的抗體能降低病毒的復(fù)制.使病毒感染不表現(xiàn)癥狀叩。2.3 NPDNA疫茜NP為流感病毒的內(nèi)部蛋白，氛基酸序列比較保守，主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)。但是NPDNA疫苗的免疫效果不理想。Chen等發(fā)現(xiàn)流感病

10、毒A/PR/8/34(HN)的NPDNA疫苗不能對BALB/c小鼠提供免疫保護(hù)作用網(wǎng)。Robinson等也報(bào)道了足HADNA而不是NPDNA能夠保護(hù)小鼠免受致死性病毒的攻擊網(wǎng)。3核酸疫苗免疫效果的蛇響因素3.1聯(lián)合免疫對免疫效果的影響HA和NA為病毒摩力相關(guān)的表面精蛋白|l4',HA抗體可以抑制病毒感染(均，而NA抗體則預(yù)防流感的發(fā)生跆。不同質(zhì)粒DNA疫苗的聯(lián)合免疫可以提高免疫效果。Chen等利用流感病毒A/PR/8/34(H.N,)的HA、NA分別構(gòu)建真核表達(dá)載體，然后對BALB/c小砍免疫接種，比較DNA疫苗的免疫保護(hù)效果。結(jié)果表明，HADNA或者NADNA疫苗誘導(dǎo)高水平的特異性抗

11、體反應(yīng)，對致死性流感病毒的攻擊能夠提供好的免疫保護(hù)。同時還發(fā)現(xiàn)，將HADNA和NADNA同時免疫接種能夠增強(qiáng)小鼠抵抗病毒攻擊的能力網(wǎng)。3.2接種方法及劑量對基因疫苗免疫效果的影響目前疫苗常見接種途徑主要包括肌肉、皮內(nèi)、部脈、皮下、腹腔和鼻腔等多種途徑，對流感病毒DNA疫苗而言，有效的接種途徑包括電轉(zhuǎn)化、基因槍介導(dǎo)的皮內(nèi)接種和肌肉注射。Chen等比較基肉槍與肌肉注射對DNA疫苗的影響效果，結(jié)果顯示HADNA疫苗的肌肉注射BALB/c小鼠僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生低水平的血清IgG抗體效價(jià)，不能降低肺部的病毒濃度滴度皿。Chen等通過基因槍接種在BALB/c檢測多種NADNA疫苗對流感病毒攻擊的保護(hù)和交叉保護(hù)能

12、力，結(jié)果表明基因槍接神NADNA疫苗比電轉(zhuǎn)化DNA疫苗在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)方面的效果褶弱。Meric通過肌肉注射與電轉(zhuǎn)化方法對BALB/c小成免疫接種HAADNA疫苗，結(jié)果表明，lug和10ug的DNA電轉(zhuǎn)化后其細(xì)胞與抗體免疫應(yīng)答都有顯著增強(qiáng)，但對較低的劑量無此效應(yīng)四。DNA疫苗沒有傳統(tǒng)常規(guī)疫苗可能因毒力返祖或殘留毒力病毒顆粒而引發(fā)疾病的危險(xiǎn)。而且DNA疫苗制備及使用簡單，不需要冷藏，易于運(yùn)輸和儲藏。但是日的基因可能會與宿主細(xì)胞的基因組整合，如果整合的話，可能導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化，發(fā)生癌變，而最終給人類的健康帶來威脅。基因疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫力，可以用于預(yù)防病毒性疾病，但是也存在著很多的危險(xiǎn)性.仍有很多

13、問題存在。參考文獻(xiàn)1 UlmerJB,DonnellyJJ,ParkerSEtccaJ.HeterologousprotectionagainstinfluenzabyinjectionofDNAencodingaviralprotein(J).Science,1993,259:1745-17492 WolffJA.LudtkcJJ,AcsadiG,ctal.Long-termpersistenceofplasmidDNAandforeigngeneexpressioninmousemuscle(J).HumMolGenet,1992,1:363-3693 必金矢，童光志，王云峰，等.抗禽流感

14、病毒多衰位DNA疫苗的構(gòu)建及箕免疫效力研完。.生物工程學(xué)報(bào)，2003,19(5):6236274 TonegawaK,NobusawaE,NakajunaK,etal.Analysisofepitoperecognitionofarid-bodiesinducedbyDNAimmunizationagainsthemagglutininproteinofinfluenzaAvirus(J).Vaccine,2003,21:3118-31255 ChenH.YuKJiangY.etal.DNAimmunizationelicitshighHIantibodyandprotectschickenf

15、romAIVchallenge.InternationalCongressSeries,2001,1219:917*9216 KodihalliS,HaynesJR,RobinsonHL.ecal.Cross-protectionamonglethalH$N2influenzavirusesinducedbyDNAvaccinetothehemagglutinin.JVirol,1997,71(5):3391-33967 姜永萍，張洪波，李呈軍，等.H,亞型禽流感病毒DNA玻.苗質(zhì)就pCAG(；optiHA5對高致病力禽流感病毒攻去的免疫保護(hù)(J).富牧善醫(yī)學(xué)報(bào)，2005,36(11):117

16、8-11828 TamuraS,FunatoH,HirabayashiY,etal.Functionalroleofrespiratorytracthaemagglutinin-specificIgAantibodiesinprotectionagainstinfluenza(J).Vaccine,1990,8(5):479-4859 ShuLL.BeanWJ,WebsterRG.AnalysisoftheevaluationandvariationofthehununinfluenzaAvirusnucleoproteingenefrom1933to1990(J).JVirol,1993,6

17、7:23-2910 FuTM,UlmerJB,CaulfieldMJ.ecal.PrimingofcytotoxicTlymphocytesbyDNAvaccines:rcquirementforprofessionalantigenpresentingcellsandevidenceforantigentransferfrommyocytes(J).MolMed,1997,3(6):362-37111JKodihalliS.GocoH.KobasaDL.etal.DNAvaccineencodinghemagglutininprovidesprotectiveimmunityagainstH

18、$N1influenzavirusinfectioninmice(J.JVirol,1999,73:2094-209812 姜永萍，張洪波，李星軍，等.H,亞型禽流感病毒DNA我苗質(zhì)tipCAGGopti-HA5對高致嫡力念流感病奉攻去的免疫保護(hù)(J).富牧善阪學(xué)報(bào)，2005,36(11):1178-118213 陳化蘭，于康振，田國斌，等.DNA免夜誘導(dǎo)雞對禽流感病毒的免疫保護(hù)作用UJ.中國農(nóng)北科學(xué),1998,31(5):632-68114 WebsterRG.BeanWJ,GormanOT,etal.EvolutionandecologyofinfluenzaAviruses(J).Mic

19、robiolRev,1992,56(1):152-17915) TamuraS,FunatoH,HirabayashiY,etal.Funcdorulroleofrespiratorytracthaemagglutinin-specificIgAantibodiesinprotectionagainstinfluenzaQ).Vaccine,1990,8(5):479-48516 JohanssonBE,GrajowcrB,KilbourneED.Infection-permissiveimmunizationwithinfluenzavirusneuraminidasepreventsweightlossininfectedmice(J).Vaccine,1993,11(10):1037-103917 ChenZ.YoshikawaT.KadowakiS,ctal.ProtectionandantibodyresponsesindifferentstrainsofmouseimmunizedwithplasmidDNAsencodinginfluenzavirushaenug-gludnin,neuraminidaseandnucleopro