醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則

1、醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則一,臨床基因擴增檢驗實驗室的設(shè)計(一臨床基因擴增檢驗實驗室區(qū)域設(shè)計規(guī)劃。原則上臨床基因擴增實驗室應(yīng)當設(shè)置以下區(qū)域:試劑儲存和準備區(qū),標本制備區(qū),擴增區(qū),擴增產(chǎn)物分析區(qū)。這四個區(qū)域在物理空間上必須是完全相互獨立的,各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中,應(yīng)當始終處于完全的分割狀態(tài),不能有空氣的直接相通。根據(jù)使用儀器的功能,區(qū)域可適當合并。例如使用實時熒光PCR儀,擴增區(qū),擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并;采用標本處理,核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀,則標本制備區(qū),擴增區(qū),擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。各區(qū)的功能是: 1,試劑儲存和準備區(qū):貯存試劑的制備,試劑的分裝和擴增反應(yīng)混

2、合液的準備,以及離心管,吸頭等消耗品的貯存和準備。2,標本制備區(qū):核酸(RNA ,DNA提取,貯存及其加入至擴增反應(yīng)管。對于涉及臨床標本操作,應(yīng)符合生物安全二級實驗室防護設(shè)備,個人防護和操作規(guī)范的要求。3,擴增區(qū):cDNA合成,DNA擴增及檢測。4,擴增產(chǎn)物分析區(qū):擴增片段的進一步分析測定,如雜交,酶切電泳,變性高效液相分析,測序等。(二臨床基因擴增檢驗實驗室的空氣流向。臨床基因擴增檢驗實驗室的空氣流向可按照試劑儲存的準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)進行,防止擴增產(chǎn)物順空氣氣流進入擴增前的區(qū)域。可按照從試劑儲存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力遞減的方式進行?？赏ㄟ^安裝排風(fēng)

3、扇,負壓排風(fēng)扇裝置和其他可行的方式實現(xiàn)。(三工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標準。1,試劑存儲和準備區(qū)。(128和-20以下的冰箱。(2混勻器。(3微量加樣器(覆蓋0.21000ul。(4可移動紫外燈(近工作臺面。(5消耗品:一次性手套,耐高溫處理的離心管和加樣器吸頭。(6專用工作服和工作鞋(套。(7專用辦公用品。2,標本制備區(qū)。(128冰箱,-20或-80冰箱。(2高速離心機。(3混勻器。(4水浴箱或加熱模塊。(5微量加樣器(覆蓋0.21000ul。(6可移動紫外燈(近工作臺面。(7生物安全柜。(8消耗品:一次性手套,耐高溫處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯。(9專用工作服和工作鞋(套。(10專用辦公用品

4、。(11如需處理大分子DNA,應(yīng)當具有超聲波水浴儀。3,擴增區(qū)。(1核酸擴增儀。(2微量加樣器(覆蓋0.21000ul,(視情況定。(3可移動紫外燈(近工作臺面。(4消耗品:一次性手套,耐高溫處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯。(5專用工作服和工作鞋(套。(6專用辦公用品。4,擴增產(chǎn)物分析區(qū)。(1微量加樣器(覆蓋0.21000ul。(2可移動紫外燈(近工作臺面。(3消耗品:一次性手套,耐高溫處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯。(4專用工作服和工作鞋(套。(5專用辦公用品。上述各區(qū)域儀器設(shè)備配備為基本配備,實驗室應(yīng)當根據(jù)自己使用的擴增檢測技術(shù)或試劑的特點,對儀器設(shè)備進行必要的增減。二,臨床基因擴增檢

5、驗實驗室工作基本原則(一進入各工作區(qū)域應(yīng)當嚴格按照單一方向進行,即試劑儲存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)。(二各工作區(qū)域必須有明確的標記,不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備,物品不得混用。(三不同的工作區(qū)域使用不同的工作服(例如不同的顏色。工作人員離開各工作區(qū)域時,不得將工作服帶出。(四實驗室的清潔應(yīng)當按試劑貯存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應(yīng)當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。(五工作結(jié)束后,必須立即對工作區(qū)域進行清潔。工作區(qū)的實驗臺面應(yīng)當可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺面的紫外照射應(yīng)當方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵,因

6、此可使用可移動紫外燈(254nm波長,在工作完成后調(diào)至實驗臺上6090cm內(nèi)照射。由于擴增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對(bp,對紫外線傷害不敏感,因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間,最好是照射過夜。(六實驗室的安全工作制度或安全標準操作程序,所有操作符合實驗室生物安全通用要求(GB19489-2008。三,臨床基因擴增檢驗實驗室各區(qū)域工作注意事項(一試劑儲存和準備區(qū)。貯存試劑和用于標本制備的消耗品等材料應(yīng)當直接運送至試劑貯存和準備區(qū),不能經(jīng)過擴增檢測區(qū),試劑盒中的陽性對照品及質(zhì)控品不應(yīng)當保存在該區(qū),應(yīng)當保存在標本處理區(qū)。(二標本制備區(qū)。由于在樣本混勻,核酸純化過程中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染,可通

7、過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件,避免從臨近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染,加入待測核酸后,必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在的傳染危險性材料,必須在生物安全柜內(nèi)開蓋,并有明確的樣本處理和滅活程序。(三擴增區(qū)。為避免氣溶膠所致的污染,應(yīng)當盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。必須注意的是,所有經(jīng)過檢測的反應(yīng)管不得在此區(qū)域打開。(四擴增產(chǎn)物分析區(qū)。核酸擴增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣,如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法(放射性核素標記或飛放射性核素標記,直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳,Southern轉(zhuǎn)移,核酸測序方法,質(zhì)譜分析等。本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源,因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA 方法檢測擴增產(chǎn)物時,必須使用洗板機洗版,廢液必須收集至1mol/L HCL中,并且不能在實驗室內(nèi)傾倒,而應(yīng)當至遠