坎地沙坦對(duì)豚鼠心房肌細(xì)胞鉀通道電流的影響

1、坎地沙坦對(duì)豚鼠心房肌細(xì)胞鉀通道電流的影響 作者：周美麗柳茵劉維軍李琳張愛元康白【摘要】 目的 研究坎地沙坦對(duì)正常豚鼠心房肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)和延遲整流鉀電流(Ik)的影響，旨在為臨床上應(yīng)用坎地沙坦預(yù)防房顫發(fā)作和復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)。方法 酶解法分離豚鼠單個(gè)心房肌細(xì)胞，應(yīng)用全細(xì)胞膜片嵌技術(shù)，在不同嵌制條件下，記錄并分析坎地沙坦對(duì)豚鼠單個(gè)心房肌細(xì)胞Ik1及Ik的影響。結(jié)果 坎地沙坦對(duì)IK1無影響，但可明顯抑制Ik。結(jié)論 坎地沙坦抑制Ik，使動(dòng)作電位時(shí)程(APD)和有效不應(yīng)期(ERP)延長，改善房顫電重構(gòu)及它的現(xiàn)在已明確的抑制結(jié)構(gòu)重構(gòu)的作用共同參與房顫發(fā)作和復(fù)發(fā)預(yù)防的機(jī)制。 【關(guān)鍵詞】坎地沙坦

2、；豚鼠；心房肌細(xì)胞；鉀通道；膜片嵌技術(shù) 【Abstract】 Objective To study the efects of candesatan on delayed rectifier K+current and inward current k+current in guinea pig cardiac atrium myocytes.Methods Whole-cell patch-clamp technique was used.Results Candesatan had no effects on Ik1Ik was inhibited by candesatan(from 0

3、95004pA/pF to 045003)pA/pF,n=5,P005).Conclusion Candesatan inhibitingIk might be goodness to blocking electrical remodeling in atrial fibrillation. 【Key words】Candesatan；Guinea pigs；Cardiac atrium myocytes；Potassium channels；Patchclamp techniques 血管緊張素受體拮抗劑(ARB)誕生于上世紀(jì)九十年代，一直以來，被廣泛應(yīng)用于高血壓治療及相關(guān)靶器官的保護(hù)，目

4、前一系列臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示血管緊張素II受體拮抗劑可預(yù)防房顫的發(fā)生和復(fù)發(fā)1，2，但具體機(jī)制尚不清楚。有研究報(bào)道，血管緊張素對(duì)心肌細(xì)胞的電生理作用是通過受體影響離子通道活性而實(shí)現(xiàn)的，坎地沙坦是一種選擇性血管緊張素亞型I受體(AT1)阻斷藥，本研究采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法觀察它對(duì)延遲整流鉀通道電流(Ik)及對(duì)內(nèi)向整流鉀通道電流(IK1)的影響,探討坎地沙坦對(duì)心肌細(xì)胞電生理作用的機(jī)制，從而為坎地沙坦應(yīng)用于臨床預(yù)防房顫發(fā)生和復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 11 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成熟豚鼠，雌雄均可，體質(zhì)量200250 g，由山東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 12 藥品和試劑 EGTA、HEPES購自Am

5、resco公司，EGTA Na2-ATP、小牛血清蛋白(BSA)為Sigma產(chǎn)品，膠原酶購于invitrogen公司，實(shí)驗(yàn)藥物坎地沙坦純粉由黃海制藥廠惠贈(zèng)，其余為國產(chǎn)分離純。 13 液體組成(單位均為mmol/L) 正常臺(tái)氏液：NaCl 135，KCl 54HEPES 10，NaH2 PO4 033，MgCl2 10，CaCl2 18，葡萄糖10(用NaOH調(diào)pH至735738);無鈣臺(tái)氏液：NaCl 135，KCl 54HEPES 10，NaH2 PO4 033，MgCl2 10,葡萄糖10(用NaOH調(diào)pH至735738);記錄Ik的電極內(nèi)液：KCl 140，HEPES 5，EGTA 10

6、，Na2-ATP 20，MgCl2 10(用KOH調(diào)pH至73)；記錄Ik1的電極內(nèi)液：KCl 140，Na2ATP 20，HEPES 50，MgCl2 10，EGTA 10(用KOH調(diào)pH至73);記錄鉀電流的電極外液：NaCl 135， KCl 54，MgCl2 10,CaCl2 10，NaH2 PO4033，葡萄糖50，HEPES 50CaCl2 02(用KOH調(diào)PH至735738)。 14 豚鼠單個(gè)心房肌細(xì)胞的分離 采用Langendorff灌流酶解分離法。選健康成年豚鼠，腹腔注射3戊巴比妥鈉 1 mg/kg，并注射肝素200 U/kg，麻醉約510 min，仰臥位固定后，開胸暴露心臟

7、,把 4無鈣臺(tái)氏液滴在心臟上,以降低其氧耗。剪開心包,取出心臟,置于4無鈣臺(tái)氏液中,清洗并游離主動(dòng)脈根部，然后迅速將心臟懸掛于Langendorff裝置上用動(dòng)脈夾固定，行主動(dòng)脈逆行灌注，灌流速度為510 ml/min，依次灌無鈣臺(tái)氏液、含003膠原酶(Collagenase IISigma)的低鈣(25 mol/L)臺(tái)氏液、KB液。以無鈣臺(tái)氏液灌流57 min后，換以含牛血清白蛋白(BSA，002%)和膠原酶(II型，002 g/L)的低鈣臺(tái)氏液灌流25 min。待心臟膨松變大，呈海綿狀，心肌呈粉紅色半透明，流出液為黏條狀時(shí)，取下心臟，剪去心室，其他部分置于37的KB液中保存510 min后剪

8、成碎塊，并用粗吸管緩慢吹打使之分散成單個(gè)心房肌細(xì)胞。用200 m的微孔尼龍網(wǎng)過濾去除結(jié)締組織和未消化細(xì)胞，濾液重新置于KB液中保存，于室溫下靜止1 h并復(fù)鈣以備用。灌流系統(tǒng)保持在37，所有液體均充以純氧飽和。 在倒置顯微鏡(Nikon Diaphot 300)下可見單個(gè)心房肌細(xì)胞呈矩形和桿狀，橫紋清楚。復(fù)鈣后部分心肌細(xì)胞有自發(fā)性收縮，短時(shí)間內(nèi)攣縮成團(tuán)塊狀死亡細(xì)胞，而大部分呈靜息狀態(tài)可供做實(shí)驗(yàn)用。 15 膜片嵌全細(xì)胞記錄 將復(fù)鈣后的細(xì)胞懸液滴在灌流槽中,置于倒置顯微鏡(Olympus,LX70)工作臺(tái)上,待細(xì)胞貼壁后以電極外液灌流,選取貼壁牢固、無自主收縮、橫紋清晰及邊緣光滑透亮的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

9、三維操縱器(Narishige,日本)移動(dòng)電極,輕壓到細(xì)胞表面,負(fù)壓抽吸,形成14 G高阻封接,補(bǔ)償電容電流和電極串聯(lián)電阻后,形成全細(xì)胞記錄形式。信號(hào)經(jīng)Ag/AgCl 電極引導(dǎo),經(jīng)膜片鉗放大器(EPC-9，HEKA)放大,由計(jì)算機(jī)通過軟件經(jīng)數(shù)模和模數(shù)轉(zhuǎn)換卡進(jìn)行脈沖發(fā)放和數(shù)據(jù)采集,數(shù)據(jù)存放于硬盤并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 16 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 130軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以（xs）表示，采用自身對(duì)照t檢驗(yàn)，分析給藥前后離子電流的變化。P005無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P005為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。 2 結(jié)果 21 坎地沙坦對(duì)豚鼠心房肌細(xì)胞Ik1的影響 記錄Ik1時(shí)細(xì)胞外液加入CaCl2 02 mmol

10、/L 阻斷鈣電流。鉗制電壓-40 mV,可消除鈉電流的影響。實(shí)驗(yàn)電壓從-120mV 以10 mV 為步階躍至+50 mV,時(shí)程300 ms,頻率02 kHz。得到一系列穩(wěn)態(tài)電流,超極化時(shí)為內(nèi)向電流,電流幅值較大,去極化時(shí)該電流轉(zhuǎn)為外向,具有很強(qiáng)的內(nèi)向整流特性(圖1)?？驳厣程?01 uM)作用10 min后，超級(jí)化和去極化狀態(tài)下，IK1電流密度有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 22 坎地沙坦對(duì)豚鼠心房肌細(xì)胞Ik的影響 為了阻斷Ca2+通道，以含CaCl2的細(xì)胞外液灌流，鉗制電壓-4o mV+70 mV、階躍為10 mV，脈沖保持時(shí)間5 s，誘發(fā)出Ik，以去極化至+70 mV時(shí)的K峰值為觀察指標(biāo)?？驳?/p>

11、沙坦(01 uM)作用10 min后，Ik電流密度由用藥前(095004)pA/pF降至(045003)pA/pF(n=5，P005)，如圖2所示。 3 討論 現(xiàn)在普遍認(rèn)為，心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)是房顫發(fā)生和維持的主要機(jī)制。 31 坎地沙坦改善心房電重構(gòu) 新近研究發(fā)現(xiàn)，坎地沙坦能夠防止持續(xù)3 h心房快速起搏導(dǎo)致的犬AERP的縮短，但具體機(jī)制不明確。房顫時(shí)心房不應(yīng)期(ERP)和動(dòng)作電位時(shí)限(APD)縮短，相應(yīng)的反映了離子通道水平的變化。延遲整流鉀電流是參與心肌細(xì)胞2、3期復(fù)極的主要電流，它包括快速延遲整流鉀電流（Ikr）、緩慢延遲整流鉀電流（Iks）和超快速延遲整流鉀電流（Ikur）。而RP流鉀電

12、流2001年時(shí)，曾有人發(fā)現(xiàn)坎地沙坦對(duì)克隆的人鉀通道有不同程度的抑制作用；本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)坎地沙坦對(duì)IK1無明顯作用，但可顯著抑制Ik，推測坎地沙坦可能通過抑制Ik延長APD和ERP，影響房顫時(shí)的ERP縮短，改善心房電重構(gòu)。 32 坎地沙坦改善心房結(jié)構(gòu)重構(gòu) 當(dāng)房顫轉(zhuǎn)復(fù)為竇性心律后，心房電重構(gòu)可完全恢復(fù)，但心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)仍持續(xù)存在；房顫轉(zhuǎn)律后用坎地沙坦可預(yù)防其復(fù)發(fā)的大量臨床實(shí)驗(yàn)表明，坎地沙坦除了改善電重構(gòu)外還改善結(jié)構(gòu)重構(gòu)。Nakashima等發(fā)現(xiàn)坎地沙坦不能阻止持續(xù)超過7 d心房快速起搏犬AERP減小和不應(yīng)期頻率適應(yīng)性降低，但能夠通過抑制心房肌纖維化，防止心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，降低心房快速起搏犬AF誘發(fā)率和持續(xù)

13、時(shí)間就是個(gè)證據(jù)。房顫時(shí)，發(fā)生結(jié)構(gòu)重構(gòu)的機(jī)制可能是，在人類AT受體分為兩種亞型，AT1 和AT2受體，房顫發(fā)生時(shí)，血管緊張素增多，與血管緊張素1型受體結(jié)合后具有很強(qiáng)的促纖維化作用，引起心房的肥厚和纖維化。病理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，心房間質(zhì)纖維化是房顫患者心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)最突出的表現(xiàn)。從房顫結(jié)構(gòu)重構(gòu)的可能發(fā)生機(jī)制，筆者可推論坎地沙坦預(yù)防房顫轉(zhuǎn)復(fù)后復(fù)發(fā)的可能機(jī)制，坎地沙坦是一新型血管緊張素II受體抑制劑，特異性地作用于血管緊張紊受體AT1亞型，對(duì)AT2受體無影響，抑制AT1受體與血管緊張素II結(jié)合，從而抑制心房間質(zhì)纖維化，改善結(jié)構(gòu)重構(gòu)。 總之,阻斷心房重構(gòu)，成為房顫治療的新靶點(diǎn)。Ang和房顫關(guān)系密切，在房顫心房

14、重構(gòu)發(fā)生中的作用已逐步得到認(rèn)識(shí)。越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，坎地沙坦作為一種選擇性血管緊張素亞型I受體(AT1)阻斷藥，可抑制房顫心房重構(gòu)，預(yù)防房顫的發(fā)作和復(fù)發(fā)，它有望在以后成為房顫治療的常規(guī)藥物。 參考文獻(xiàn) 1 Kumagai K，Nakashima H，Urata H，et al.Effects of angiotensinII type l receptor antagonist on electrical and structural remodeling in atrial fibrillation J Am Coll Cardiol，2003，41(12)：2197-2204. 2 M

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