單細(xì)胞全基因組測序_圖文

1、單細(xì)胞全基因組測序單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)是在單細(xì)胞水平對全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測序的一項(xiàng)新技術(shù)。其原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,獲得高覆蓋率的完整的基因組后進(jìn)行高通量測序用于揭示細(xì)胞群體差異和細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系。從方法學(xué)角度來看,獲得高覆蓋率高保真性的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物是準(zhǔn)確全面的測序結(jié)果的保障。多重置換擴(kuò)增(multiple displacement amplification,MDA利用隨機(jī)引物和等溫?cái)U(kuò)增可以獲得高保真的DNA大片段,但該方法的主要缺陷在于非平衡的基因組覆蓋率、擴(kuò)增偏倚、嵌合序列及非特異擴(kuò)增等1。盡管各種改進(jìn)的策略正在逐步減少這些缺陷,高覆蓋率、高保真性及高特異性

2、的擴(kuò)增仍然是亟待解決的問題。另外,還有科研人員利用DOP-PCR進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(whole-genome amplification,WGA及DNA測序?qū)蝹€(gè)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行了拷貝數(shù)變異的分析,進(jìn)而推斷出細(xì)胞的群體結(jié)構(gòu)和腫瘤的進(jìn)化過程。但是由于該方法的基因覆蓋率較低,而且不能在單個(gè)核苷酸的分辨率上評價(jià)單個(gè)腫瘤細(xì)胞的遺傳學(xué)特征,故并不能檢測在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的單個(gè)核苷酸的改變。2012年,哈佛大學(xué)謝曉亮院士在Science發(fā)表了單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增新技術(shù)MALBAC(Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles,簡稱M

3、ALBAC,即多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)23。不同于以往的非線性或指數(shù)型擴(kuò)增方法,MALBAC技術(shù)利用特殊引物,使得擴(kuò)增子的結(jié)尾互補(bǔ)而成環(huán),從而很大程度上防止了DNA的指數(shù)性擴(kuò)增,從而解決了基因組擴(kuò)增對微量初始模板過大的擴(kuò)增偏倚,并使基因組測序的模板需求量從µg級降至單細(xì)胞水平。MALBAC技術(shù)原理如下: 圖1:MALBAC技術(shù)原理MALBAC Primers having a 27-nt common sequence followed by eight random nucleotides are annealed to the genomic DNA template. Stra

4、nd-displacement synthesis generates partial amplicons, which are subsequently denatured from the template at 94°C. Priming to new positions on the genomic DNA template generates more partial amplicons, which increases coverage of the genome with a resulting reduction in amplification bias. Prim

5、ing nad extension on the partial amplicons yield complete amplicons having the MALBAC primer sequence at 5 end and its complementary sequence at the 3 end. Denaturation at 94°C regenerates the original template and a now larger and more diverse pool of partial amplicoms. Full amplicons form loo

6、ps, which may be resistant to subsequent amplification and hybirdization. Full amplicons are generated for eight cycles and the exponentially amplified by about 14-21 cycles using primers complementary to the common region of the MALBAC primers.常見的全基因組擴(kuò)增方法(whole-genome amplification,WGA比較如下:表1:常見WGA

7、方法比較WGA方法MALBAC MDA DOP-PCR PEP最低DNA模板量0.5pg,單細(xì)胞或單染色體1000pg 1000pg 1000pg基因組覆蓋度90%270%40%50%Allele dropout概率<10%高達(dá)50%適宜的下游應(yīng)用二代測序,芯片檢測,qPCR,CNV分析,SNP分析,常規(guī)PCR常規(guī)PCR,二代測序常規(guī)PCR 常規(guī)PCR不適宜的下游應(yīng)用無CNV分析CNV分析,二代測序,芯片檢測,qPCR CNV分析,二代測序,芯片檢測,qPCR通過比較我們發(fā)現(xiàn),MALBAC技術(shù)具有如下優(yōu)勢:1降低PCR擴(kuò)增偏倚,使得單細(xì)胞中93%的基因組能夠被測序。這種方法使得檢測單細(xì)胞

8、中較小的DNA序列變異變得更容易,因此能夠發(fā)現(xiàn)個(gè)別細(xì)胞之間的遺傳差異。這樣的差異可以幫助解釋癌癥惡化的機(jī)制,生殖細(xì)胞形成機(jī)制,甚至是個(gè)別神經(jīng)元的差異機(jī)制。2靈敏度高:單細(xì)胞、單染色體或0.5pg的基因組DNA即可進(jìn)行擴(kuò)增。3擴(kuò)增均勻性顯著優(yōu)于其它技術(shù),測序數(shù)據(jù)可進(jìn)行CNV分析,用于21三體等染色體變異檢測。4擴(kuò)增產(chǎn)物用途廣泛:可用于二代測序、微陣列、qPCR、基因克隆。目前,MALBAC技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成功應(yīng)用于人類單精子、植入前產(chǎn)前篩查的囊胚和極體、早期發(fā)育胚胎、腫瘤細(xì)胞、刑偵現(xiàn)場痕量物證和部分微生物。參考文獻(xiàn)1 Yilmaz S, Singh AK. Single cell genome se

9、quencing. Curr Opin Biotechnol 2012; 23(3: 437-43.2 Zong CZ, Lu SJ,Chapman AR,Xie XS. Genome-Wide Detection of Single Nucleotide and CopyNumberVariations of a Single Human Cell. Science 2012;338(6114:1622-6.3 Lu SJ, Zong CZ, Xie XS, et al. Probing Meiotic Recombination and Aneuploidy of Single Sperm Cells by WholeGenome Sequencing using MALBAC. Science 2012;338(6114:1627-30.4 Balogh M K. Application of whole genome amplification for forensic analysis. Elsevier 2006; 1288:725-727.5 Pinard R, de Winter A, Sarkis G J, et al.