人胎盤(pán)與臍動(dòng)、靜脈血造血干祖細(xì)胞歸巢相關(guān)黏附分子表達(dá)的研究

1、人胎盤(pán)與臍動(dòng)、靜脈血造血干/祖細(xì)胞歸巢相關(guān)黏附分子表達(dá)的研究    作者：蘇蕊，陳代雄，方寧，陳琦，龔芳澤    【摘要】 為了評(píng)價(jià)人胎盤(pán)組織造血干/祖細(xì)胞（hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC）的歸巢能力，采用機(jī)械法制備人胎盤(pán)組織單個(gè)細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞術(shù)分析胎盤(pán)組織及臍動(dòng)、靜脈血有核細(xì)胞中CD34 細(xì)胞及其亞群的含量，檢測(cè)三者來(lái)源的CD34 細(xì)胞表面歸巢相關(guān)黏附分子CD44、CD11a、CD62L、CD49d、CD49e和CD54的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，胎盤(pán)組織CD34

2、細(xì)胞及CD34 CD38-細(xì)胞百分率明顯高于臍動(dòng)、靜脈血；臍動(dòng)脈與臍靜脈血中HSPC百分率沒(méi)有明顯差異。胎盤(pán)來(lái)源CD34 細(xì)胞高度表達(dá)黏附分子CD11a、CD49d、CD44、CD49e及CD54，其中表達(dá)CD49e及CD54水平明顯高于臍動(dòng)、靜脈血CD34 細(xì)胞。胎盤(pán)來(lái)源的CD34 CD62L 細(xì)胞百分率為(64.58±15.52)%，低于臍靜脈血來(lái)源的表達(dá)。結(jié)論：人胎盤(pán)富含HSPC。胎盤(pán)來(lái)源的CD34 細(xì)胞多數(shù)黏附分子的表達(dá)水平近似或高于臍血，提示胎盤(pán)HSPC的歸巢能力有可能強(qiáng)于臍帶血。    【關(guān)鍵詞】 胎盤(pán) Expressions of

3、 Homing-Related Adhesion Molecules in Hemato-poietic Stem/Progenitor Cells Derived from Human Placenta，Umbilical Cord Arterial and Venous Blood Abstract The aim of this study was to evaluate the homing capabilities of hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) derived from human placenta tissues (P

4、T). Single cell suspension of human PT was prepared by mechanical method. The expression levels of homing-related adhesion molecules (HRAM) including CD11a，CD49d，CD44，CD49e，CD62L and CD54 on CD34 cells and the percentages of CD34 cells and their subpopulations in nucleated cells (NC) from fresh huma

5、n PT，umbilical cord arterial blood (UCAB) and umbilical cord venous blood(UCVB) were detected by using flow cytometry. The results showed that the percentage of CD34 cells and CD34 CD38- cells in placenta were higher than those in UCAB and UCVB. There were no significant difference in percentage of

6、HSPC between UCAB and UCVB. Placenta-derived CD34 cells strongly expressed CD11a，CD49d，CD44，CD49e and CD54，among which expression levels of CD49e and CD54 on placenta-derived CD34 cells were significantly higher than those on UCAB and UCVB-derived CD34 cells. While the percentage of CD34 CD62L cells

7、 in placenta was only lower than that in UCVB. It is concluded that human placenta is rich in HSPC. Moreover，the expression levels of most HRAM in CD34 cells from PT are higher than those from UCAB and UCVB or are close to them. It suggested that HSPCs derived from PT might have stronger homing capa

8、bilities than those from UCB. Key words placenta; umbilical cord artery; umbilical cord vein; hematopoietic stem/progenitor cell; adhesion molecule; homing    自發(fā)現(xiàn)臍帶血富含造血干/祖細(xì)胞（hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC）以來(lái)，臍血HSPC的移植已成為治療骨髓造血功能衰竭、惡性血液病、重癥免疫缺陷、某些遺傳病等疾病的重要手段1-4。但是，單份臍血所含

9、的HSPC數(shù)量難以使一個(gè)成人獲得造血干細(xì)胞重建。因此，尋找富含HSPC的新資源是非常必要的，國(guó)內(nèi)已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)組織中含有比臍帶血更豐富的HSPC5。作為HSPC的成 功移植，除要有足夠數(shù)量的HSPC外，還要求HSPC能及時(shí)、高效地歸巢至骨髓造血微環(huán)境“龕”，這對(duì)HSPC的植活與造血重建具有決定意義6。HSPC表面黏附分子的正常表達(dá)是干細(xì)胞移植時(shí)HSPC實(shí)現(xiàn)歸巢及成功植入的關(guān)鍵。本研究中，我們利用了胎兒胎盤(pán)血循環(huán)的特點(diǎn)，即臍動(dòng)脈血是由胎兒流到胎盤(pán)，而臍靜脈血?jiǎng)t是由胎盤(pán)流回胎兒，分別測(cè)定臍動(dòng)、靜脈血及胎盤(pán)組織中HSPC的含量及三者CD34 細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，初步探討了胎盤(pán)HSPC的歸巢能力

10、，以期為人胎盤(pán)HSPC最終應(yīng)用于臨床移植提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法 主要試劑 熒光標(biāo)記的CD分子系列單克隆抗體，anti-human CD34 Cy-chrome購(gòu)自美國(guó)PharMingen公司。FITC標(biāo)記的CD38單克隆抗體、CD49d單克隆抗體和CD54單克隆抗體及PE標(biāo)記的CD11a單克隆抗體均購(gòu)自晶美公司，PE標(biāo)記的CD62L及CD44單克隆抗體購(gòu)自Biolegend公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD49e單克隆抗體購(gòu)自SBA公司。IMDM培養(yǎng)液為Sigma公司產(chǎn)品。 胎盤(pán)和臍帶血標(biāo)本 經(jīng)知情同意后，無(wú)菌采集足月分娩胎兒的胎盤(pán)和臍動(dòng)、靜脈血標(biāo)本6份，乙肝表面抗原（HBsAg）均為陰性。

11、新生兒娩出后，在距胎兒臍部最近端結(jié)扎兩處，從中間剪斷臍帶。胎盤(pán)殘存于子宮內(nèi)，并將距胎盤(pán)最近端臍帶夾閉以防止血液流出。碘伏充分消毒臍帶，用注射器分別穿刺臍動(dòng)脈和臍靜脈，收集臍帶靜脈血及動(dòng)脈血各約5 ml于收集管內(nèi)，同時(shí)收集胎盤(pán)。臍動(dòng)、靜脈血分別用肝素抗凝（終濃度均為20 U/ml），4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 胎盤(pán)細(xì)胞的制備 用Hanks液沖洗除去血塊，剪碎胎盤(pán)組織，并反復(fù)沖洗，盡量除去血液。將組織塊浸泡于IMDM培養(yǎng)液，采用搓網(wǎng)法分離細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，用320目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，115×g離心3分鐘，收集細(xì)胞沉淀，懸浮于IMDM培養(yǎng)液中，臺(tái)盼藍(lán)染色示細(xì)胞活力>95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為1

12、15;107/ml。 多色熒光染色 分臍動(dòng)、靜脈血組和胎盤(pán)細(xì)胞懸液組，每組樣品100 l均分別與以下熒光標(biāo)記的CD分子抗體組合進(jìn)行染色。用小鼠IgG作同型對(duì)照。 CD34PECy5 20 l，CD38FITC 10 l； CD34PECy5 20 l，CD49dFITC 10 l和CD11aPE 10 l； CD34PECy5 20 l，CD49eFITC 10 l和CD44PE 20 l； CD34PECy5 20 l，CD54FITC 10 l，CD62LPE 20 l。充分混勻，室溫避光靜置20分鐘。每管加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫靜置10分鐘，180×g離心5分鐘，棄

13、上清，重新懸浮細(xì)胞。每管加入2 ml含1 g/L NaN3的PBS，混勻，180×g 1%的多聚甲醛，混勻，2-8避光放置，逐一上機(jī)分析。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志    應(yīng)用流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，Becton Dickinson）對(duì)熒光染色的胎盤(pán)細(xì)胞和臍動(dòng)、靜脈血樣品進(jìn)行HSPC含量及表面黏附分子表達(dá)檢測(cè)。樣品的采集和分析采用Cell Quest軟件，根據(jù)淋巴和單核細(xì)胞的大小設(shè)定CD34細(xì)胞門(mén)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以x±SD表示。若方差齊性，則采用方差分析；若方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)

14、。 結(jié)果 CD34 細(xì)胞及其亞群的含量 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，臍動(dòng)脈血和臍靜脈血之間HPSC含量無(wú)顯著性差別，胎盤(pán)組織和臍動(dòng)脈、靜脈血中CD34 細(xì)胞百分率分別為（2.99±0.55）%、（1.46±0.39）%及（1.53±0.33）%，CD34 CD38-細(xì)胞百分率在胎盤(pán)組織為(1.40±0.53)%，顯著高于臍動(dòng)脈、靜脈血（0.08±0.04，0.21±0.20)。這說(shuō)明胎盤(pán)組織中含有比臍帶血更豐富的HSPC（表1）。Table 1. Comparison in proportional distribution of hematopo

15、ietic stem/progenitor cells in nucleated cells from placenta tissues，umbilical cord arterial and venous blood（略） 臍動(dòng)脈、靜脈血和胎盤(pán)組織中CD34 細(xì)胞表達(dá)黏附分子的百分率從表2可以看出，CD11a、CD49d和CD44在臍動(dòng)脈、靜脈血及胎盤(pán)組織來(lái)源的CD34 細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)率，但三者之間均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。胎盤(pán)組織CD34 細(xì)胞表達(dá)CD49e和CD54分子百分率分別為(85.36±2.68)%和(72.44±11.58)%，顯著高于臍動(dòng)脈

16、(27.18±11.00 )%和(22.89±13.58)%及臍靜脈血CD34 細(xì)胞表達(dá)(34.15±11.61) %和(28.39±13.38)%，三者之間均有非常顯著差異（P<0.001，附圖）。臍動(dòng)脈、靜脈血和胎盤(pán)來(lái)源的CD34 細(xì)胞中CD62L表達(dá)率分別為(76.46± 9.88)%、(81.62±10.02)%和(64.58±15.52)%，與臍靜脈血相比，胎盤(pán)CD34 表達(dá)CD62L偏低（P<0.05，附圖）。 6種黏附分子在臍動(dòng)脈、靜脈血CD34 細(xì)胞的表達(dá)率均無(wú)顯著差異（P>0.05）。Ta

17、ble 2. Expression of homing-related adhesion molecules on CD34 cells from placenta tissue，umbilical cord arterial and venous blood (略)    討論 自Takahashi7發(fā)現(xiàn)小鼠胎盤(pán)絨毛膜具有造血功能后，曾鳳華等8采用免疫組織化學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)妊娠6-42周的人胎盤(pán)絨毛膜間質(zhì)存在CD34 細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，在足月妊娠分娩胎兒的胎盤(pán)組織中，CD34 細(xì)胞及CD34 CD38-細(xì)胞含量均明顯高于臍動(dòng)脈、靜脈血中的含量。據(jù)此我

18、們認(rèn)為，胎盤(pán)組織中含有比臍血更豐富HSPC，而且是更為“早期”的CD34 CD38-造血干細(xì)胞。這似乎支持陳代雄等8早先提出的臍帶血HSPC來(lái)源于胎盤(pán)的觀點(diǎn)，人胎盤(pán)在胎兒發(fā)育期具有重要的造血功能。    本研究未發(fā)現(xiàn)臍動(dòng)脈、靜脈血中HSPC含量的差別，這與曾鳳華等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。這可能與實(shí)驗(yàn)方法和分析不同有關(guān)。目前普遍采用的方法是不分離單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cell，MNC），而用全血進(jìn)行直接免疫熒光標(biāo)記9。本實(shí)驗(yàn)采用直接對(duì)臍動(dòng)脈、靜脈全血進(jìn)行抗體標(biāo)記，進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。另一方面，在進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，為了使得到的數(shù)

19、據(jù)更為準(zhǔn)確，在分析結(jié)果時(shí)一般對(duì)目標(biāo)細(xì)胞都要設(shè)門(mén)（gate）。而曾鳳華等人在文獻(xiàn)中并沒(méi)有提到設(shè)CD34細(xì)胞門(mén)，這顯然會(huì)影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，值得提出的是，HSPC的遷移包括2個(gè)階段，即HSPC的歸巢和HSPC的遷出。為了尋求更適宜的造血微環(huán)境，骨髓中部分HSPC遷出骨髓。因此，臍靜脈和臍動(dòng)脈血中HSPC含量沒(méi)有差別是極有可能的。    HSPC歸巢是指HSPC經(jīng)外周血循環(huán)輸入供體后，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的分子間相互作用、介導(dǎo)，特異性地定位于骨髓微環(huán)境合適的“龕”位。體外抗體阻斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CD49d、CD11a和CD44在造血細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分間的黏附

20、中起重要作用，而且CD11a參與了HSPC的植入，當(dāng)CD11a被抗體中和之后，HSPC明顯降低了植入水平10。因此，CD11a、CD49d及CD44分子在3種來(lái)源的CD34 細(xì)胞的高表達(dá)有利于HSPC的黏附與植入。    胎盤(pán)來(lái)源CD34 細(xì)胞高表達(dá)CD49e和CD54，其CD34 CD49e 細(xì)胞及CD34 CD54 細(xì)胞百分率明顯高于臍動(dòng)脈、靜脈血（P<0.001）。Peled等10研究發(fā)現(xiàn)，臍血CD34 /CXCR4 細(xì)胞在基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）的誘導(dǎo)下，穿過(guò)骨髓基質(zhì)細(xì)胞

21、的定向遷移依賴(lài)CD49d和CD49e的共同作用，當(dāng)這2個(gè)分子被各自抗體中和后，CD34 細(xì)胞在非肥胖性糖尿病重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠（nonobese diabetic-severce combined immunodeficient mice，NOD/SCID）體內(nèi)的植入過(guò)程被阻斷。另外，CD54與CD11a這1對(duì)分子可能與黏附和穿過(guò)內(nèi)皮有關(guān)，當(dāng)CD54與CD11a之間的相互作用被阻斷后，CD34 細(xì)胞與基質(zhì)的黏附被部分破壞。    胎盤(pán)組織CD34 細(xì)胞表達(dá)CD62L的細(xì)胞百分率明顯低于臍靜脈血CD34 細(xì)胞表達(dá)。研究表明，CD62L參與了移植后CD34

22、 細(xì)胞的歸巢過(guò)程，CD62L與祖細(xì)胞上的CD34結(jié)合后，上調(diào)HSPC上白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（leukocyte function-associated antigen-1，LFA-1）的親和性，而后者在細(xì)胞穿越細(xì)胞內(nèi)皮過(guò)程中起重要作用11。Watanabe等12還發(fā)現(xiàn)，在自體干細(xì)胞移植中，輸注CD34 CD62L 細(xì)胞的數(shù)量與患者體內(nèi)中性粒細(xì)胞和血小板恢復(fù)到正常水平所需時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。但L-選擇蛋白基因敲除的小鼠未發(fā)生造血障礙13，用抗L-選擇蛋白單克隆抗體處理對(duì)動(dòng)物與細(xì)胞也無(wú)任何影響。CD62在長(zhǎng)期培養(yǎng)始動(dòng)細(xì)胞（long-term culture initiating-cell，LTC-IC

23、）表面表達(dá)較低，而在相對(duì)分化成熟的造血祖細(xì)胞表達(dá)則較高14，這進(jìn)一步證實(shí)了胎盤(pán)比臍帶血含有更豐富的較原始HSPC的結(jié)論。    我們所測(cè)的臍動(dòng)脈、靜脈血中CD34 細(xì)胞表面的6個(gè)黏附分子的表達(dá)百分率與文獻(xiàn)報(bào)道一致15，這表明用先進(jìn)的三色或四色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSPC表面黏附分子表達(dá)具有明顯價(jià)值，值得今后試用。陳代雄等5及本觀察都證實(shí)了胎盤(pán)組織CD34 CD38-細(xì)胞含量高于臍帶血，Kollet等16通過(guò)觀察移植后小鼠造血干細(xì)胞表型的表達(dá)及二次移植后體內(nèi)多系造血的重建，證實(shí)CD34 CD38-細(xì)胞亞群為更早期的造血干細(xì)胞，歸巢能力較高，這些研究結(jié)果支持了我們

24、提出的，胎盤(pán)HSPC可能具有比臍血更強(qiáng)歸巢能力的推測(cè)。    HSPC是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要多種因子的共同作用，本研究結(jié)果顯示，在胎盤(pán)CD34 細(xì)胞與臍動(dòng)脈、靜脈血CD34 細(xì)胞都具有CD11a、CD44及CD49d 3個(gè)分子的高表達(dá)率的前提下，胎盤(pán)CD34 細(xì)胞高度表達(dá)CD49e及CD54分子，均顯著高于臍血，這也許能提示胎盤(pán)HSPC比臍血有更強(qiáng)的歸巢能力，值得通過(guò)功能學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步研究。    【參考文獻(xiàn)】 1Knudtzon S. In vitro growth of granulocyte colonies

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