低劑量顆粒溶素對(duì)單核細(xì)胞和T細(xì)胞具有趨化作用

1、低劑量顆粒溶素對(duì)單核細(xì)胞和T細(xì)胞具有趨化作用        【摘要】     目的 探討低劑量顆粒溶素（GNLY）對(duì)免疫細(xì)胞的趨化作用。方法 抽取健康人全血，分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），經(jīng)免疫磁珠法純化出單核細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD45RA+T細(xì)胞、CD4+/CD45RO+T細(xì)胞、CD8+/CD45RA+T細(xì)胞和CD8+/CD45RO+T細(xì)胞，再用96孔微孔趨化板進(jìn)行趨化反應(yīng)。結(jié)果 顆粒溶素可趨化一些T細(xì)胞系、單核細(xì)胞系，趨化指數(shù)

2、2（P<0.05），而對(duì)B細(xì)胞系的趨化指數(shù)為<2。用百日咳毒素預(yù)處理過(guò)的T細(xì)胞系、單核細(xì)胞系不再對(duì)顆粒溶素有反應(yīng)，提示顆粒溶素介導(dǎo)的趨化作用涉及G蛋白偶連受體。結(jié)論 顆粒溶素不僅是一種細(xì)胞毒性分子，而且具有化學(xué)趨化作用。顆粒溶素在10100 mol 發(fā)揮細(xì)胞毒活性而在相對(duì)較低的濃度下發(fā)揮趨化作用且此效應(yīng)涉及G蛋白偶連受體。     【關(guān)鍵詞】  顆粒溶素；免疫細(xì)胞；趨化作用        顆粒溶素（granulysin，GNLY）是脂結(jié)合蛋白中皂素樣蛋白的成員之一

3、，在機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中，與穿孔素和顆粒酶等顆粒成分，一起參與抗菌、抗病毒及殺傷腫瘤細(xì)胞等免疫應(yīng)答過(guò)程1。顆粒溶素以相對(duì)分子質(zhì)量15 000和9 000兩種形式表達(dá)于CTL和NK細(xì)胞中、相對(duì)分子質(zhì)量15 000的片段經(jīng)蛋白酶解后轉(zhuǎn)變成相對(duì)分子質(zhì)量9 000的蛋白2。研究表明重組的相對(duì)分子質(zhì)量9 000的蛋白可以誘導(dǎo)有核細(xì)胞的凋亡3。顆粒溶素的局部濃度對(duì)于其生物活性非常重要，臨床和科研中常用濃度為10100 mol，主要引起細(xì)胞毒活性和細(xì)胞凋亡。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低劑量的顆粒溶素對(duì)單核細(xì)胞系、一些T細(xì)胞系具有趨化作用，而對(duì)B細(xì)胞系沒(méi)有趨化作用。1  材料和方法11  重組顆粒溶

4、素的制備 顆粒溶素制備參見(jiàn)文獻(xiàn)4。將編碼顆粒溶素的cDNA克隆至pET28a+ vector (Novagen)并轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21中表達(dá)。經(jīng)異丙基硫代D半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)3 h 后，收集包涵體蛋白，變性后經(jīng)Ni2+柱純化重組蛋白，經(jīng)復(fù)性、透析、HPLC柱純化后得到顆粒溶素蛋白，經(jīng)檢測(cè)其內(nèi)毒素水平低于1.0 EU/g 顆粒溶素。1.2  細(xì)胞培養(yǎng) 5例T細(xì)胞系和5例單核細(xì)胞系由ATCC獲得。在含10%FBS的RPMI 1640中培養(yǎng)（含2 mmol 谷氨酰胺100 U/ml 青霉素，100 mg/L 硫酸鏈霉素）。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收集細(xì)胞，經(jīng)RPMI 1

5、640洗3次后，進(jìn)行趨化反應(yīng)分析。1.3  PBMC的分離和純化 經(jīng)FicollHypaque（聚蔗糖-泛影葡胺）密度梯度分離PBMC，用免疫磁珠法純化出單核細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD45RA+T細(xì)胞、CD4+/CD45RO+T細(xì)胞、CD8+/CD45RA+T細(xì)胞和CD8+/CD45RO+T細(xì)胞。采用FACS分析表型，將純度>90%的樣品進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。1.4  趨化反應(yīng) 用96孔微孔趨化板檢測(cè)細(xì)胞的遷移率。實(shí)驗(yàn)設(shè)實(shí)驗(yàn)組，空白組和陽(yáng)性對(duì)照組：將含1% BSA的RPMI 1640重懸細(xì)胞(1×106 cells/

6、ml)100 l 加于上層板中，將不同濃度的顆粒溶素放置于下層板中，以RPMI 1640為空白對(duì)照，以RANTES為陽(yáng)性對(duì)照。用5m聚碳酸酯濾紙膜分離上下兩層板。用含10 mg/L 纖維結(jié)合素的RPMI 1640，包被5 m 濾膜后，4 過(guò)夜。在37 孵育細(xì)胞1.5 h（單核細(xì)胞）或3 h（T細(xì)胞），收集遷移至下層的細(xì)胞，離心后取沉淀。用CyQuant GR染料進(jìn)行定量，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。趨化指數(shù)定義為檢測(cè)孔的細(xì)胞數(shù)除以陰性對(duì)照孔細(xì)胞數(shù)的值。統(tǒng)計(jì)方法用t檢驗(yàn)。趨化指數(shù)為2時(shí)，P<0.05。2  結(jié)果2.1  顆粒溶素可趨化一些T細(xì)胞系、單核細(xì)胞系，但對(duì)B細(xì)胞系沒(méi)有趨化作用&

7、#160;經(jīng)96孔微孔趨化板分析后發(fā)現(xiàn)，顆粒溶素可趨化一些T細(xì)胞系、單核細(xì)胞系，而且在顆粒溶素10 nmol 時(shí)，趨化指數(shù)達(dá)到峰值，而顆粒溶素發(fā)揮細(xì)胞毒作用的濃度在1050 mol，顆粒溶素對(duì)B細(xì)胞系的趨化指數(shù)<2。加入抗顆粒溶素抗體后，可阻斷顆粒溶素的趨化效應(yīng)，證實(shí)上述趨化作用的特異性。見(jiàn)圖1。2.2  顆粒溶素對(duì)原代細(xì)胞的趨化作用免疫磁珠法分離單核細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞，進(jìn)行趨化指數(shù)試驗(yàn)。結(jié)果表明，顆粒溶素趨化原代單核細(xì)胞（趨化指數(shù)約為4.0），可同時(shí)趨化CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞（趨化指數(shù)約為3.0），顆粒溶素在10 nmol 時(shí)，趨化活性達(dá)到峰值。

8、進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，顆粒溶素的趨化性在有無(wú)血清中無(wú)明顯差異。在CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞得到記憶細(xì)胞(CD45RO+)和天然細(xì)胞(CD45RA+)中，只有CD45RO+T細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，其余細(xì)胞沒(méi)有趨化作用。見(jiàn)圖23（并且10 nmol 為顆粒溶素趨化達(dá)到峰值時(shí)的濃度，并且P值均<0.05,趨化指數(shù)2）。2.3  百日咳毒素可抑制顆粒溶素對(duì)單核細(xì)胞和T細(xì)胞的趨化作用 為探討顆粒溶素趨化效應(yīng)途徑，采用百日咳毒素預(yù)處理細(xì)胞，進(jìn)行趨化試驗(yàn)。結(jié)果表明，顆粒溶素趨化效應(yīng)被阻斷，經(jīng)百日咳毒素預(yù)處理過(guò)的T細(xì)胞、單核細(xì)胞不再發(fā)生遷移，提示顆粒溶素趨化效應(yīng)涉及G蛋白偶連受體。3

9、60; 討論顆粒溶素（granulysin，GNLY）是人類(lèi)CTL和NK細(xì)胞釋放的新的效應(yīng)分子，具有廣譜的抗菌活性并能夠殺傷腫瘤細(xì)胞。GNLY是一個(gè)防御分子，可以導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加裂解，它殺傷病原體的能力取決于其與細(xì)胞壁的直接作用。它快速殺傷許多微生物，并且既能殺胞外菌，也能殺胞內(nèi)菌46。GNLY是在抗原激活CD8+CYLs時(shí)分泌的，因此是特異性免疫應(yīng)答的武器。顆粒溶素可趨化T細(xì)胞系、單核細(xì)胞系，趨化指數(shù)均2，并且P<0.05。顆粒溶素對(duì)B細(xì)胞沒(méi)有趨化作用，抗顆粒溶素抗體可阻斷趨化作用。在顆粒溶素作用下，只有CD45RO+T細(xì)胞發(fā)生遷移，趨化指數(shù)>2。百日咳毒素預(yù)處理的細(xì)胞對(duì)顆粒

10、溶素不再有反應(yīng)，不發(fā)生移行，此效應(yīng)途徑涉及G蛋白偶連受體。實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)了，顆粒溶素對(duì)B細(xì)胞無(wú)明顯的趨化作用（本文未給出）。本研究提示了，顆粒溶素不僅具有細(xì)胞毒作用，而且具有化學(xué)趨化作用。顆粒溶素在10100 mol 發(fā)揮細(xì)胞毒活性而在相對(duì)較低的濃度下發(fā)揮趨化作用。意義在于，在不同的濃度梯度下，顆粒溶素可作為化學(xué)趨化物趨化免疫細(xì)胞到達(dá)損傷或感染部位，進(jìn)一步擴(kuò)大了免疫效應(yīng)?？傊?，我們的研究顯示顆粒溶素在炎癥的不同階段對(duì)其起作用，包括招募炎性細(xì)胞，激活促炎癥反應(yīng)介質(zhì)的分泌；高濃度的顆粒溶素能直接殺傷細(xì)胞。然而，這些效應(yīng)在不同濃度發(fā)生；在納摩爾濃度下，顆粒溶素引起趨化現(xiàn)象且激活單核細(xì)胞產(chǎn)生許多促炎癥反應(yīng)分子；在微摩爾濃度下，顆粒溶素可溶