酵母菌發(fā)酵玉米皮制備菌體蛋白飼料#

1、中國科技論文在線酵母菌發(fā)酵玉米皮制備菌體蛋白飼料基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(No. 61361016)； 教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目(No. 2013151412000)；內(nèi)蒙古自治區(qū)草原英才工程項目；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校青年科技英才支持計劃項目 王雅波1，劉占英1，段申2，胡建華1，李永麗1，石雅麗1作者簡介：王雅波(1993-)，女，研究生，生物質(zhì)資源化通信聯(lián)系人：劉占英,女，教授. E-mail: liuzy19791.51.51.51.5 Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051;Inner Mongo

2、lia University of Technologe,Hohhot 010051;Inner Mongolia agricultural university, college of life science;Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051;Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051;Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院;內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院;內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)

3、生命科學(xué)學(xué)院;內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院;內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院;內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院010051;0100511594711665915947116659;內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院;內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院;798852154;liuzy1979;85993750;hhh.a2003;sorry1115;shiyali2006王雅波(1993-)，女，研究生，生物質(zhì)資源化;劉占英,女，教授;王雅波;劉占英;段申;胡建華;李永麗;石雅麗WANG Yabo;LIU Zhanying;DUAN Shen;HU Jianhua;LI Yongli;SHI

4、 Yali劉占英國家自然科學(xué)基金項目(No. 61361016)； 教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目(No. 2013151412000)；內(nèi)蒙古自治區(qū)草原英才工程項目；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校青年科技英才支持計劃項目1.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51*|*學(xué)位論文*|*史建國.基于SPCE061A型單片機的食品螺桿膨化機溫度的檢測與控制D.濟南：山東大學(xué), 2007. 2*|*期刊*|*丁聲俊. 發(fā)展玉米深加工業(yè)應(yīng)掌握適度J. 糧食與食品工業(yè), 2011, 18(4):1-4. 3*|*期刊*|*WuYV, Norton RA. Enriehmen

5、t of Protein,starch,fat,and sterol ferulates from corn fiber by finegrinding and air elassifieation J. Industrial Crops and Produets, 2001, 14(2):135-13. 4*|*期刊*|*Mendona S, Grossmann M V E, Verh R. Corn Bran as a Fibre Source in Expanded Snacks J. LWT - Food Science and Technology, 2000, 33(1):2-8.

6、5*|*期刊*|*Holguin-Acuna A. L. , Carvajal-Millan E. , Santana-Rodriguez V. , et al. Maize bran/oat flour extruded breakfast cereal: A novel source of complex polysaccharides and an antioxidant J. Food Chemistry, 2008, 111(3):654-657. 6*|*期刊*|*代養(yǎng)勇, 董海洲, 王志剛,等. 我國玉米深加工產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢J. 中國食物與營養(yǎng), 2011, 17(4):37

7、-39.7*|*期刊*|*孫付保,陳曉旭,陳曉萍等.混合菌株固態(tài)發(fā)酵玉米皮生產(chǎn)飼料蛋白J. 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2010, 29(6):916-920.8*|*期刊*|*張博潤,劉玉方,何秀萍等.發(fā)酵飼料蛋白的培養(yǎng)條件及產(chǎn)物分析J.微生物學(xué)報,1997,37(4):281-284.9*|*學(xué)位論文*|*陳曉萍. 副產(chǎn)物玉米皮固態(tài)發(fā)酵高值化的研究D. 無錫：江南大學(xué), 2009.10*|*期刊*|*王良倉.玉米皮的綜合利用J.中文信息,2013.06.11*|*期刊*|*沈兆兵,劉曉潔,劉莉等.拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052發(fā)酵玉米皮生產(chǎn)丁醇J.

8、 2014, (5):361-367.12*|*期刊*|*馮繼華, 曾靜芬, 陳茂椿, 侯正高.應(yīng)用VanSoest法和常規(guī)法測定纖維素及木質(zhì)素的比較J.西南民族學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版). 1994,(1).13*|*其他文獻*|*GB/T 20805-2006 飼料中酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）的測定.14*|*期刊*|*GB/T 6432-94 飼料中粗蛋白的測定方法.15*|*期刊*|*郭冬生,彭小蘭.蒽酮比色法和酶水解法兩種淀粉測定方法的比較研究J.湖南文理學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版).2007,(3).16*|*其他文獻*|*GB/T 6433-2006/ISO6492:1999 飼料中粗脂肪的

9、測定.17*|*期刊*|*李秀花.酸水解法測定食品中脂肪含量與索氏抽提法的比較J.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報.1999, (4). 18*|*期刊*|*張國華, 考桂蘭, 李寶棟,等. 酵母菌紫外誘變時洗滌液與離心轉(zhuǎn)速的選擇J. 畜牧與飼料科學(xué), 2008, 29(3):40-42. 19*|*專著*|*沈萍，陳向東.微生物學(xué)實驗M.4版.北京：高等教育出版社,2007. 20*|*期刊*|*Palmarola-Adrados B, Borska PC, Galbe M, Zacch G. Ethanol production from non-starch carbohydrates of wheat

10、 bran J. Bioresource Technology, 2005, 96(7):843-50.21*|*期刊*|*Javed M M, Zahoor S, Shafaat S, et al. Wheat bran as a brown gold: Nutritious value and its biotechnological applications J. African Journal of Microbiology Research, 2012, 6(4):724-733. 22*|*期刊*|*喬君毅, 亢晉, 張福元,等.黑曲霉發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)纖維素酶的研究J. 飼料研究,

11、2008(12):63-66.|1|王雅波|WANG Yabo|內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院| Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051|王雅波(1993-)，女，研究生，生物質(zhì)資源化|內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院|010051|79885215418347151305*|2|劉占英|LIU Zhanying|內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院|Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051|劉占英,女，教授|內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院|010051|liuzy1979|

1215947116659|3|段申|DUAN Shen|內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院|Inner Mongolia agricultural university, college of life science|85993750|4|胡建華|HU Jianhua|內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院|Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051|hhh.a2003|5|李永麗|LI Yongli|內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院|Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 01005

13、1|sorry1115|6|石雅麗|SHI Yali|內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院|Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051|shiyali2006|酵母菌發(fā)酵玉米皮制備菌體蛋白飼料|Preparation of protein feed from corn bran by yeast fermentation|國家自然科學(xué)基金項目(No. 61361016)； 教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目(No. 2013151412000)；內(nèi)蒙古自治區(qū)草原英才工程項目；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校青年科技英才支持計劃項目- 7 -（1. 內(nèi)

14、蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院）摘要：玉米皮作為玉米加工過程中的主要副產(chǎn)品，營養(yǎng)價值豐富，可作為既緩和資源短缺又降低工業(yè)成本的優(yōu)質(zhì)飼料來源，但目前各玉米淀粉廠對其的綜合利用不夠完全，導(dǎo)致部分資源浪費。本文旨在采用飼料國標測定法對玉米皮中纖維素類等有效成分進行測定，并以玉米皮為原材料，采用畢赤酵母菌2.3250發(fā)酵的方法降解玉米皮中的纖維素類物質(zhì)使其充分轉(zhuǎn)化為高附加值的飼料蛋白。結(jié)果表明，玉米皮中的纖維素和半纖維素含量分別為16.40% 和47.68%，蛋白質(zhì)含量為11.49%、淀粉含量為15.50%、脂肪含量為2.73% 以及木質(zhì)素含量為5.41%。另外，利用畢赤酵母

15、菌轉(zhuǎn)化玉米皮時，在無蛋白胨添加的情況下，25恒溫培養(yǎng)48h，畢赤酵母菌濃度最高，為2.31107個/mL。經(jīng)過微生物發(fā)酵，玉米皮中纖維素含量由 16.40%降到 6.22%，半纖維素含量由47.68%降到33.45%。該研究不僅對玉米皮的重要組分進行了系統(tǒng)分析，并且還為利用酵母菌發(fā)酵玉米皮生產(chǎn)高附加值的菌體蛋白飼料等后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：玉米皮；酵母；菌體蛋白飼料中圖分類號：Q815Preparation of protein feed from corn bran by yeast fermentationWANG Yabo1, LIU Zhanying1, DUAN Shen2, HU

16、 Jianhua1, LI Yongli1, SHI Yali1(1. Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051;2. Inner Mongolia agricultural university, college of life science)Abstract: Corn bran of the main by-product of the corn, which riches in nutritional value. As a high quality source of feed, corn bran is not o

17、nly to ease the shortage of feed resource, but also reduce the cost of feed industry. However the comprehensive utilization of the corn starch plant is completely inadequate, resulting in part of the waste of resources. This paper aims to determinate effective components of corn husk cellulose by th

18、e feed national standard method, and taking maize peel as raw material, degrade corn husk cellulose material to make it fully into high value-added feed protein using Pichia pastoris 2.3250 fermentation method. The experimental results showed that the contents of cellulose and hemicellulose in corn

19、bran were 16.40% and 47.68% respectively, and the protein content was 11.49%, and the starch content was 15.50%, and then the fat content was 2.73% and the lignin content was 5.41%.When using the methylotrophic yeast Pichia pastoris transformed corn skin components, in the absence of peptone added,

20、culture temperature was set to 25, and the speed was set to150 r/min, culturing for 48h, microbial feed protein concentration is the highest, and the yeast cell number is 2.31107ml-1 and the content of cellulose decreased from 16.40% to 6.22%, and the hemicellulose content decreased from 47.68% to 3

21、3.45%. The study is not only an important for group of corn bran which carried by the system analysis, but also laid the foundation for the further research on the production of high added value of bacterial protein feed by using yeast fermentation. Key words: Corn bran, yeast, bacterial protein fee

22、d 0 引言玉米是我國的主要糧食作物之一，我國現(xiàn)今擁有幾百家玉米淀粉加工廠。玉米皮是玉米淀粉加工的主要副產(chǎn)物之一，大約占玉米總質(zhì)量的12%1，但玉米皮并未得到充分利用，產(chǎn)品附加值極低，導(dǎo)致主產(chǎn)品成本增高，利潤率下降，造成市場競爭力變?nèi)跫吧鐣б娼档偷木置?，如若可以更深層次的開發(fā)利用玉米的深加工副產(chǎn)物玉米皮2，就能極大的帶動玉米加工企業(yè)的經(jīng)濟效益。近年來國內(nèi)外逐漸增多了玉米皮的研究，Wu和Norton3，在玉米皮膳食纖維中提取得到了裕醇阿魏酸酷；Mendonca4 等人發(fā)現(xiàn)玉米皮能顯著的降低點心的縱向脹率；Holguin等人用玉米皮取代燕麥制作早餐谷物5。與此同時，因飼料工業(yè)存在飼料蛋白供不應(yīng)求

23、的現(xiàn)象6，僅依靠生產(chǎn)以往使用的蛋白類飼料根本無法滿足飼料生產(chǎn)迅速發(fā)展的需求，故研究者們將研究熱點放到發(fā)展微生物飼料蛋白領(lǐng)域6，玉米皮即是該產(chǎn)業(yè)的首選原材料。孫付保等人7利用混合菌株固態(tài)發(fā)酵玉米皮生產(chǎn)飼料蛋白，張博潤等8利用白地霉Z-4、熱帶假絲酵母Z-14和木素木霉Z-203株菌混合發(fā)酵白酒糟生產(chǎn)飼料蛋白，但這些產(chǎn)纖維素酶的微生物大多數(shù)是真菌，而酵母菌與其相比更具有色、香、味和較高的蛋白質(zhì)含量，可達60%；而且其適口性好，發(fā)酵過程中耐酸能力強，適宜于低 pH 培養(yǎng)，不易污染，回收率高，這些優(yōu)點均是生產(chǎn)微生物蛋白飼料作為首選菌種的重要原因9。因此，若能利用酵母菌將玉米皮轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)飼料，則不僅解決

24、了玉米皮的利用問題，而且解決了飼料工業(yè)的問題10。同時將玉米皮做成飼料使其批量生產(chǎn)，也符合內(nèi)蒙古大量開發(fā)農(nóng)副產(chǎn)品的發(fā)展方向。玉米皮中主要成分會因玉米品種、質(zhì)量、產(chǎn)地以及生產(chǎn)淀粉工藝條件的不同而略有差異。一般含有10%20%的淀粉、30%50%的半纖維素、10%20%的纖維素以及少量的蛋白質(zhì)，幾乎不含木質(zhì)素11。1 材料與方法：1.1 實驗原料玉米皮購于內(nèi)蒙古阜豐科技有限責(zé)任公司，其他化學(xué)試劑購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。1.2 菌種實驗中用到的是畢赤酵母菌，為本實驗室前期篩選得到的最佳菌種。1.3 實驗方法1.3.1 玉米皮成分的測定1、 纖維素、半纖維素含量的測定方法：范式測定纖維含量法12

25、。2、 木質(zhì)素含量的測定：飼料中酸性洗滌木質(zhì)素的國標測定方法13。3、 粗蛋白含量的測定：飼料中粗蛋白的國標測定方法14。4、 淀粉含量的測定：測淀粉含量的國標方法酶水解法15。5、 脂肪含量的測定：測脂肪含量的國標方法索氏提取法16，以及酸水解法17。1.3.2酵母菌發(fā)酵玉米皮制備飼料蛋白1、培養(yǎng)條件對菌種濃度的影響在培養(yǎng)過程中，主要是以玉米皮為底物。 具體培養(yǎng)方法：厭氧培養(yǎng)需取24個30mL西林瓶，稱取0.6g玉米皮，加入30mL蒸餾水；好氧培養(yǎng)需取24個100mL三角瓶（提前洗凈，烘干），均稱取0.6g玉米皮，加入30mL蒸餾水，蓋膠塞，壓鋁蓋后放入1.5MPa，121壓力鍋中滅菌。在操

26、作前，需先在超凈工作臺內(nèi)殺菌30min，之后再在超凈工作臺內(nèi)接入1.5mL酵母菌液（5%接菌量），置于25，150r/min的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)菌種。每24個瓶培養(yǎng)一個時間梯度，分別為24h和48h。觀察不同培養(yǎng)時間和需氧情況對畢赤酵母菌體的影響。2、蛋白胨添加量對菌種濃度的影響 實驗過程同上述實驗方法，只將蛋白胨做不同濃度梯度，添加量分別為：0g、1g、2g和3g。3、微生物飼料中菌體濃度測定 分光光度法： 將培養(yǎng)好的菌液先置于振蕩器上振蕩5min，使菌落脫離玉米皮。再將菌液倒入離心管中，置于3000r/min的離心機內(nèi)離心5min18。然后取上清液倒入比色皿中，置于分光光度計內(nèi)，將波長調(diào)至560

27、nm進行測定，測定OD560。血球板計數(shù)法： 由于原菌液濃度太大，給計數(shù)帶來極大不便，故需預(yù)先稀釋。本次所采用的稀釋方法為：準備數(shù)個裝有9mL蒸餾水30mL西林瓶，取1mL菌液添加到一個西林瓶中，此時該西林瓶中的菌液已是被稀釋到10-1的菌液，稀釋到幾倍，就繼續(xù)上述操作幾次。起初準備每個樣稀釋到10-5，考慮到在操作過程中容易染菌，所以使用壓過蓋的西林瓶稀釋，然后再利用血球板計數(shù)的方法計數(shù)19。1.3.3乙醇產(chǎn)量的測定高效液相色譜 Water 1515；色譜柱：Aminex HPX-87H（300mm x 7.8mm id，9m）；RI示差檢測器；流動相：8mmol/lL H2SO4；進樣體積

28、：20L；流動相流速：0.5ml/min；柱溫：40。流動相配制 流動相：先用抽濾瓶抽取少量二次水，清洗抽濾瓶內(nèi)壁，將清洗后的水倒出。再用抽濾瓶抽取約1000mL二次水后，再用超聲波清洗器超聲半小時，之后將其內(nèi)的屈臣氏水加入到儀器儲液瓶中。標準樣品的配置： 乙醇標樣：乙醇2g，72%的硫酸溶液5ml，最后用二次水稀釋到1L。樣品溶液的配制 從每個培養(yǎng)好的菌液中取上清液950L和50L的10%的硫酸溶液加入到離心管中，置于4,15000r/min的冷凍離心機內(nèi)離心3min。之后取出上清液置于另一離心管中，在上述同樣的條件下再離心3min，同樣取出上清液經(jīng)0.22m水相過濾頭過濾后置于進樣瓶中，開

29、始測樣。2 結(jié)果與分析2.1 玉米皮組分的分析 通過以上實驗表明：在玉米皮中，纖維素含量約為24.80 %、半纖維素含量為47.68 %、蛋白質(zhì)含量為11.49 %、淀粉含量為15.50 %、脂肪含量為2.73% 以及木質(zhì)素含量為5.41%。這與Palmarola-Adrados等20人的研究近乎相同。表2-1 玉米皮組成組成含量（%）蛋白質(zhì)11.49淀粉15.50半纖維素47.68纖維素16.40木質(zhì)素5.41脂肪2.732.2酵母菌發(fā)酵玉米皮制備飼料蛋白2.2.1 培養(yǎng)條件對菌種濃度的影響表2-2 培養(yǎng)條件對菌體濃度的影響 培養(yǎng)時間 OD560厭氧好氧0h0.74370.00100.743

30、70.001024h1.42860.00111.34440.001248h1.65850.00041.35260.0005 經(jīng)顯微鏡直接計數(shù)法表明：厭氧條件下培養(yǎng)48h時，畢赤酵母菌體個數(shù)為2.31107個，相較于其他培養(yǎng)條件下，菌體濃度最高，見圖2-2。圖2-1 不同條件對菌種濃度的影響2.2.2 蛋白胨添加量對菌種濃度的影響表2-3 蛋白胨添加量對菌種濃度的影響蛋白胨添加量0g1g2g3gOD5601.6585+0.00041.3269+0.00051.5786+0.00031.4723+0.0005 經(jīng)顯微鏡直接計數(shù)法表明：蛋白胨添加量為0g時，畢赤酵母菌體數(shù)量為2.31107/mL 個

31、，高于其他條件下培養(yǎng)的菌體數(shù)量，見圖2-3。2.2.3 纖維素與半纖維素降解率的測定通過以上實驗結(jié)果得知，在以玉米皮為底物時，厭氧培養(yǎng)48h以后的菌液濃度明顯高于24h的菌體濃度，厭氧條件下比好氧條件菌體濃度高，所以對該條件下培養(yǎng)后的剩余培養(yǎng)基中的纖維素和半纖維素成分進行測定，得到如下結(jié)果：表2-4 纖維素和半纖維降解率組分半纖維素纖維素降解率（%）29.8437.93由計算結(jié)果可見，經(jīng)過微生物發(fā)酵，玉米皮中纖維素含量由16.40%變到6.22%，半纖維素含量由47.68%變到33.45%，這說明畢赤酵母菌使玉米皮中的纖維素和半纖維素得以降解，供己所需，這可能是由于畢赤酵母菌產(chǎn)生某種可降解纖維

32、素的酶。隨著營養(yǎng)成分的不斷增加，菌體濃度也會隨之上升，同時也印證了培養(yǎng)48h要比24h更旺盛的結(jié)論。2.2.4 乙醇產(chǎn)量的測定 經(jīng)高效液相色譜測定后，得到并無乙醇產(chǎn)生。3 討論Javed等21研究發(fā)現(xiàn)玉米皮中含有豐富的纖維類物質(zhì)，其中包括有30%50%的半纖維、10%20%纖維素以及微量的木質(zhì)素。本實驗表明，玉米皮中的纖維類物質(zhì)含量很高，其中纖維素含量16.40%，木質(zhì)素含量為5.41%，而半纖維素含量高達47.68%，淀粉含量為15.50%、蛋白質(zhì)含量為11.49%，在測量時會因原料的產(chǎn)地及種類不同略有差異。并且，畢赤酵母菌可以有效的利用玉米皮，通過顯微鏡直接計數(shù)法和分光光度法均證實：在以玉

33、米皮為底物時，厭氧培養(yǎng)48h以后的菌液濃度明顯高于24h的菌體濃度，厭氧條件下比好氧條件菌體濃度高，這一現(xiàn)象可能是由于在起初接入畢赤酵母菌時，首先會利用一部分木糖維持，以致培養(yǎng)前期酵母處于延遲期生長較緩慢，菌體數(shù)目不明顯增加，同時木糖的消耗較少9；培養(yǎng)后期酵母處于指數(shù)生長期，酵母數(shù)急劇增加，同時開始消耗玉米皮中的纖維素，這還有待后續(xù)研究探索。并且對剩余培養(yǎng)基成分進行測定，玉米皮中纖維素含量由 16.40%降到 6.22%，半纖維素含量由47.68%降到33.45%，遠高于喬君毅22研究的纖維素和半纖維素的降解率分別為29.01 %和12.90 %的水平，達到了玉米皮成分得以轉(zhuǎn)化的預(yù)期效果，在發(fā)

34、酵過程中并未產(chǎn)生任何乙醇等影響飼料生產(chǎn)的有毒物質(zhì)，符合其作為微生物飼料的基本要求。參考文獻 (References)1 史建國.基于SPCE061A型單片機的食品螺桿膨化機溫度的檢測與控制D.濟南：山東大學(xué), 2007. 2 丁聲俊. 發(fā)展玉米深加工業(yè)應(yīng)掌握適度J. 糧食與食品工業(yè), 2011, 18(4):1-4. 3 WuYV, Norton RA. Enriehment of Protein,starch,fat,and sterol ferulates from corn fiber by finegrinding and air elassifieation J. Industria

35、l Crops and Produets, 2001, 14(2):135-13. 4 Mendona S, Grossmann M V E, Verh R. Corn Bran as a Fibre Source in Expanded Snacks J. LWT - Food Science and Technology, 2000, 33(1):2-8.5 Holguin-Acuna A. L. , Carvajal-Millan E. , Santana-Rodriguez V. , et al. Maize bran/oat flour extruded breakfast cereal: A novel source of complex polysaccharides and an antioxidant J. Food Chemistry, 2008