微生物限度檢驗方法驗證方案

1、第6頁共6頁微生物限度檢驗方法驗證方案1適用范圍本方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。2. 目的通過驗證確認所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測定。3. 職責項目責任人：負責驗證方案的起草及具體實施。驗證管理員：負責驗證工作的組織、協(xié)調及管理。QA現場監(jiān)控員：負責驗證實施過程中的監(jiān)督檢查，取樣，確保結果的可靠性。QC負責人：負責驗證方案中檢驗方法的審核及按照規(guī)定的取樣計劃對標準檢驗操作程序的準 確執(zhí)行，負責組織實施。QC檢驗員：負責驗證方案的起草與參與實施，并對所測數據準確性負責。質量部經理：負責驗證方案及報告的審核和批準。4. 內容4.1. 概述通過驗證以確認所采用的方法適合

2、于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定；確認所采用的方 法適合于該藥品的控制菌的檢查。根據樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件，按制定的方法進 行試驗，根據驗證結果判斷是否符合驗證標準。若符合，按驗證的方法和條件進行藥品的微 生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗方法和檢驗條件，再進行驗證，直至驗證結果 符合設立的驗證標準。4.2細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證當建立藥品的微生物限度檢查時，應進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所采 用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定。.驗證試驗可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數同時進行。4.2.1. 驗證用菌株及菌種要求大腸埃希菌【CMCC( B

3、) 44102】、金黃色葡萄球菌【CMCC( B) 26003】、枯草芽抱桿菌【CMCC (B) 63501】、黑曲霉【CMCC (F) 98003】、白色念珠菌【CMCC (F) 98001】。 大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽抱桿菌為產芽抱桿菌， 前述菌株作為細菌計數驗證用菌株；黑曲霉為霉菌，白色念珠菌為酵母菌，作為霉菌及酵母 菌計數驗證用菌株。驗證實驗所用的菌株傳代次數不得超過 5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為 0代)， 并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。4.2.2驗證菌菌液制備4.2.2.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱

4、桿菌菌液制備：接種大腸埃希菌、金色葡萄 球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至 10ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，3537°C培養(yǎng)1824小時。 取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-610-7,制成 每1ml含菌數50100cfu的菌懸液。422.2. 白色念珠菌菌液制備：接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，23 28C培養(yǎng)2448小時；取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法， 稀釋至10-610-7，制成每1ml含菌數50100cfu的菌懸液。4.2.2.3. 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培

5、養(yǎng)基中， 2328C培養(yǎng)57 天,加入 35ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫，吸至無菌試管內，取 1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液 9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-410-6,制成每1ml含抱子數50100cfu的抱子懸液。4.2.3. 供試液的制備4.2.3.1無抑菌活性的供試品供試液的制備稀釋劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1: 10）。 固體、半固體、粘稠性供試品供試品：稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻后，作為供試液（1: 10）。4.2.3.2具有抑菌活性的供試品供試

6、液的制備當供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下：培養(yǎng)基稀釋法：取供試液2ml，每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿；或取 供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿，傾注15ml的培養(yǎng)基，測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數， 混勻，凝固，培養(yǎng)。每1ml供試液所注的平皿生長的菌數之和即為 1ml的菌落數。計算每1ml 供試液的平均菌落數，按平皿法計數規(guī)則報告菌數；控制菌檢查時可加大增菌液的用量。離心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000轉/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500 轉/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補至原量

7、。薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌落數。中和法：選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當的對氨基苯甲酸，含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸 80 （3%）或卵磷 脂（3%）,鹵素中加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活 性后測定。4.2.4. 菌液組 測定所加的試驗菌數。采用平皿法，取試驗用的 1ml菌液（約50100cfu） 分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。4.2.5試驗組4.2.5.1. 平皿法：取試驗可能用的最低稀

8、釋級 1ml供試液和50100cfu試驗菌，分別注入平皿 中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。4252培養(yǎng)基稀釋法（平皿法）：取試驗可能用的最低稀釋級1ml供試液分別注入N個平皿中，每個平皿再注入50100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平 行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。4.2.5.3薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的 沖洗液中加入50100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數。至少要一張膜。4.2.54離心沉淀集菌法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，如供試液含許多藥渣， 先

9、以500轉/分鐘離心35分鐘，取全部上清液，再以3000轉/分離心20分鐘，取下面1ml 液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計數。4.2.6.供試品對照組取規(guī)定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數（方法和試驗組相同）。4.2.7稀釋劑對照組若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時，應增加稀釋劑對照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌，使最終濃度為每1ml供試液含50100cfu，按試驗組的供試液制備方法和計數方法計數。4.2.8 .回收率計算4.2.8.1. 試驗組回收率計算試驗組的菌回收率一供試品對照組平均菌落數試驗組的菌回收率二X 1

10、00%菌液組的平均菌落數4.2.8.2. 稀釋劑對照組回收率計算稀釋劑對照組平均菌落數試驗組的菌回收率二X 100%菌液組的平均菌落數計數方法驗證至少應進行3次獨立平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。4.2.8.結果判斷在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率)70%。若試驗組的菌回收率(試驗組的平均菌落數減去供試品對 照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率)70%。照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜

11、過濾法、中和法等方法或聯合使用這些 方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證，使試驗組菌回收率大于70% o43控制菌檢驗方法驗證當建立藥品的微生物限度檢查時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合 于該藥品的的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結果 時，檢驗方法應進行重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。4.3.1.驗證用菌株大腸埃希菌(Esherichia coli)【CMCC(B) 44102】、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus 【CMCC(B)26003】、乙型付傷寒沙門菌 (Salmonella paratyph

12、i B)【CMCC(B) 50094】、銅綠假 單胞菌(Pseudomonas aeruginoSa【CMCC (B) 10104 】驗證實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0代)，并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。4.32菌液制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng) 肉湯培養(yǎng)基中，3537T培養(yǎng)1824小時；分別取培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液，采 用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5107，制成每1ml含菌數10100cfu的菌懸液。4.3.3. 陰性菌對照組設立陰性菌對照組是為了驗證

13、該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗 證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照 菌不得檢出。4.3.4試驗組4.3.4.1常規(guī)法大腸埃希菌 取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照 加入大腸埃希菌10100cfu,陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10100cfu，3537 C培養(yǎng)18 24小時，取此培養(yǎng)物按微生物限度檢查 SOP大腸埃希菌項下規(guī)定檢查。大腸菌群 取含適量(不少于10ml)的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入含供試品1g 或1ml、

14、0.1g或0.1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽性菌對照加入大腸埃希菌 10100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10100cfu，3537 C培養(yǎng)1824小時，按微 生物限度檢查SOP大腸菌群項下規(guī)定檢查。沙門菌 取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于 200ml）的營養(yǎng)肉湯培 養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加入沙門菌10100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10100cfu，3537C培養(yǎng)1824小時。按微生物限度檢查SOP沙門 菌項下規(guī)定檢查。銅綠假單胞菌取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性

15、菌對照加入銅綠假單胞菌10100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌 10100cfu，3537C培養(yǎng) 1824小時。按微生物限度檢查 SOP沙門菌項下規(guī)定檢查。金黃色葡萄球菌取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌10100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌 10100cfu，3537C 培養(yǎng)1824小時。按微生物限度檢查 SOP金黃色葡萄球菌項下規(guī)定檢查。4342培養(yǎng)基稀釋法 供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由 1: 100放大到1: 300、1: 500或1: 1000，由于容器體積限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用于抑菌作用

16、不強 的樣品。4.343.薄膜過濾法采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。4.3.4.4. 離心沉淀集菌法取規(guī)定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉/分鐘離心35分鐘，取全部上清液，再以3000轉/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并將適量的稀釋劑洗 滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中，培養(yǎng)，本法適用于中度抑菌作用的樣品。4.3.4.5. 中和法在供試品溶液中加入相應的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應對微生物無毒性，與抑菌成分結合后的產物應對微生物亦無毒性，或有毒性但不影響待 檢菌的檢出。4.3.5. 結果判斷至少應進行3次獨立平行試驗。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌， 照該供試液制備方法和控制菌