微生物限度檢查辦法驗(yàn)證方法

1、精心整理微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案1. 目的：為確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查，包括細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)和控 制菌檢查，特制定本驗(yàn)證方案，通過(guò)比較試驗(yàn)菌的恢復(fù)生長(zhǎng)結(jié)果，來(lái)評(píng)價(jià)整個(gè)檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確 性、有效性和重現(xiàn)性，以確認(rèn)供試品在該實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)抑菌活性或其抑菌活性可忽略不計(jì)，所 采用的方法適用于該品種的微生物限度檢查。驗(yàn)證過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行，若因特殊原因確需變更時(shí)，應(yīng)填寫驗(yàn)證方案 修改申請(qǐng)并報(bào)驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組批準(zhǔn)2. 范圍：本驗(yàn)證方案適用于微生物限度檢查方法的驗(yàn)證。I、/Lx-j/ y £/3. 規(guī)范性引用文件：根據(jù)中國(guó)藥典2010年版二部附錄幻J微生物限度

2、檢查法的要求，由于某些供試品具有抗菌活性，在建立微生物檢查方法或產(chǎn)品的組分發(fā)生改變或原檢查法的檢驗(yàn)條件發(fā)生改變 時(shí)，可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須對(duì)供試品的抑菌活性及測(cè)定方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。4. 驗(yàn)證實(shí)施：441試驗(yàn)前的準(zhǔn)備：441.1 試驗(yàn)用具的準(zhǔn)備：將試驗(yàn)需用的試管、刻度吸管、薄膜過(guò)濾器、濾膜(孔徑0.22um、直徑50mrh、平皿、空三角瓶、稱量紙等，用牛皮紙包扎好后，放于濕熱滅菌器中，在 121C，滅菌30 min,在3天內(nèi)使用。4.4.1.2 試驗(yàn)用培養(yǎng)基的制備：取適用性檢查合格的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、4-

3、甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG等脫水培養(yǎng)基，按照相應(yīng)的配制說(shuō)明，用純化水配制、分裝后，在2小時(shí)內(nèi)，放于濕熱滅菌器中，在121C，滅菌15 min,在3周內(nèi)使用。4.4.1.3試驗(yàn)用稀釋劑/緩沖液、沖洗液的制備：取在有效期內(nèi)的試劑，按照相應(yīng)的配制方法， 配制pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液、0.05% (ml/ml )聚山梨酯80的 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液等，用純化水配制，加熱使溶，過(guò)濾，分裝，在121C，滅菌15 min,在3周內(nèi)使用。442 試驗(yàn)菌的制備和稀釋：442.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證用菌液：4.44.44.44.4.2.2控制菌檢查方法驗(yàn)證用菌液

4、：4.44.4.2.2.2取上述均勻培養(yǎng)物（菌懸液），用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液對(duì)倍稀釋，制成每 1ml含菌10100cfu的試驗(yàn)菌液。4.44.4.3供試液的制備：4.4.3.1 根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。4.4.3.2，取供試品養(yǎng)胃舒軟膠囊5g，加至含溶化的（溫度不超過(guò) 45C） 5g司盤80、3g單 硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無(wú)菌混合物的燒杯中，用無(wú)菌玻璃攪拌成團(tuán)后，慢慢加入 45C pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為 1： 20的供試 液。pI4.44.4.4.1 驗(yàn)證試驗(yàn)分4組，照微生物限度檢查法操

5、作，分別用 3個(gè)不同批號(hào)樣品進(jìn)行3 次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算供試品組和對(duì)照試驗(yàn)組的菌回收率。4.4.4.2試驗(yàn)組：4.4.4.2.1 平皿法：分1： 20的供試液1ml和試驗(yàn)菌液（含菌50100CFU 1ml，注入同一 直徑90mm勺滅菌平皿中，每株試驗(yàn)菌平行制備 2個(gè)平皿。4.44.444441平皿法：取1: 20供試液1ml,注入直徑90mnt勺滅菌平皿中，每種培養(yǎng)基平行制備2個(gè)平皿。4.4444.5稀釋劑對(duì)照組：若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心等特殊處理時(shí)，需增加 稀釋劑對(duì)照組，以考察供試液制備過(guò)程中微生物受影響的程度。4.44.44.4.4.6傾注培養(yǎng)基：在菌液組各平皿中分別

6、傾注1520ml溫度不超過(guò)45C的溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，其中，金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、大腸埃希菌用營(yíng)養(yǎng)瓊 脂培養(yǎng)基, 白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固。4.4.4.7培養(yǎng)觀察：用于細(xì)菌計(jì)數(shù)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，倒置于3035C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時(shí)；用于霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，倒置于2328C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72小時(shí)。逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。4.4.4.8菌落計(jì)數(shù)：將平板置菌落計(jì)數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察并記錄結(jié)果。4.4.4.9計(jì)算回收率"也如廠心# 試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-

7、供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)X 100%、 X J稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)稀釋劑對(duì)照組回收率=X10°%4.4.4.10結(jié)果判定：在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的回收率應(yīng)均不低于70%。試i驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，則照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的 菌回收率低于70%，則應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、中和法等方法或聯(lián) 合使用上述方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。4.4.4.11細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果:第一次：樣品名稱試驗(yàn)日期規(guī)格樣品批號(hào)生產(chǎn)商類別供試液的制備 及處理保溫振搖法 研缽法 勻漿儀檔min水溶性供試品：

8、供試品g（ml），加稀釋劑ml,制成1:供試液；取供試液ml,沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。非水溶性供試品：供試品g（ml），加乳化劑（名稱；批號(hào)）g（ml），加稀釋劑ml，制成1:供試液；取供試液ml,沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。其它：。技術(shù)方法細(xì)菌計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基名稱營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基配制批號(hào)培養(yǎng)溫度沢、V.;嚴(yán)培養(yǎng)起止時(shí)間菌種名稱菌大腸埃布 菌金黃色 葡萄球枯草芽 抱桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種編號(hào) z 1 ,菌懸液批號(hào)1一 - 菌液稀釋倍數(shù) / 1 ? .1 ,試驗(yàn)組 （cfu）12平均菌液組（cfu）i二12平均稀釋劑對(duì)照組 （cfu）12平均供試品對(duì)照組（cfu）

9、12平均試驗(yàn)組回收率（）稀釋劑對(duì)照組回收（）結(jié)論檢查人/日期復(fù)核人/日期精心整理第二次：樣品名稱試驗(yàn)日期規(guī)格樣品批號(hào)生產(chǎn)商類別供試液的制備 及處理保溫振搖法 研缽法 勻漿儀檔min水溶性供試品：供試品g（ml），加稀釋劑ml,制成1:供試液；取供試液ml,沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。非水溶性供試品：供試品 g（ml），加乳化劑（名稱；批號(hào) ）g（ml），加稀釋劑ml，制成1:供試液；取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。其它：。技術(shù)方法細(xì)菌計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基名稱營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基配制批號(hào)培養(yǎng)溫度r1培養(yǎng)起止時(shí)間菌種名稱菌大腸埃布 菌金黃色 葡萄球枯草芽 抱桿菌白色念珠

10、菌黑曲霉菌種編號(hào)菌懸液批號(hào)菌液稀釋倍數(shù)試驗(yàn)組（cfu12II-平均菌液組 （cfu）12平均稀釋劑對(duì)照組 （cfu）12平均供試品對(duì)照組（cfu）12平均試驗(yàn)組回收率（）稀釋劑對(duì)照組回收（）結(jié)論檢查人/日期復(fù)核人/日期第三次:樣品名稱試驗(yàn)日期規(guī)格樣品批號(hào)生產(chǎn)商類別供試液的制備 及處理保溫振搖法 研缽法 勻 水溶性供試品：供試品g（1：供試液；取供試液漿儀檔mninl，制成次，每膜;批供試ml），加稀釋劑mml，沖洗次數(shù)沖洗量ml。非水溶性供試品：供試品g（ml），加乳化劑（名稱 號(hào)）g（ml），加稀釋劑ml，制成1:液；取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。其它：。技術(shù)方法細(xì)菌計(jì)數(shù)霉菌和酵

11、母菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基名稱營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基配制批號(hào)培養(yǎng)溫度培養(yǎng)起止時(shí)間菌種名稱菌大腸埃布 菌金黃色 葡萄球枯草芽 抱桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種編號(hào)l_r；、*菌懸液批號(hào)i1菌液稀釋倍數(shù)試驗(yàn)組 （cfu）12平均菌液組 （cfu）12平均稀釋劑對(duì)照組 （cfu）12精心整理平均供試品對(duì)照組 （cfu ）12平均試驗(yàn)組回收率（）稀釋劑對(duì)照組回收（）結(jié)論檢查人/日期復(fù)核人/日期'T445控制菌檢查方法驗(yàn)證方法：4.4.5.1 根據(jù)各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌，選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株，驗(yàn)證大腸菌群檢查法時(shí)，采用大腸埃希菌作為驗(yàn)證菌株。驗(yàn)證試驗(yàn)分3組，分別用3個(gè)不同批號(hào)樣品或同一

12、批號(hào)樣品進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)。J I I-; I/445.2試驗(yàn)組：4.4.5.2.1 平皿法：取1： 10的供試液10ml （相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2和1ml試驗(yàn) 菌液（含菌10100CFU加入同一增菌培養(yǎng)基中，按相應(yīng)控制菌的檢查方法進(jìn)行檢查。4.44.4.5.3 陽(yáng)性對(duì)照：取1ml試驗(yàn)菌液（含菌10100CFU，加入增菌培養(yǎng)基中，按相應(yīng)控 制菌的檢查方法進(jìn)行檢查。4.4.5.4 陰性對(duì)照：取10ml稀釋劑或緩沖液替代供試液，加入增菌培養(yǎng)基中，按相應(yīng)控制I I菌的檢查方法進(jìn)行檢查。'i r4.4.5.5結(jié)果判定：在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌，陰性菌對(duì)照

13、組應(yīng) 無(wú)菌生長(zhǎng)。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查； 若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、中和法等方法或 聯(lián)合使用上述方法消除供試品的抑菌活性，建立新的方法，并重新驗(yàn)證。4.4.5.6控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果：第一次：控制菌名稱樣品名稱試驗(yàn)日期規(guī)格樣品批號(hào)生產(chǎn)商類別供試液的制備 及處理保溫振搖法研缽法 勻漿儀檔min水溶性供試品：供試品g(ml)，加稀釋劑ml,制成1:供試液；取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑(名稱；批號(hào) )g(ml)，加稀釋劑ml，制成1：供試液；取供

14、試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。其它：。培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)起止時(shí)間菌落生長(zhǎng)情況' 叮-1試驗(yàn)組陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照：. L結(jié)論檢查人/日期復(fù)核人/日期第二次:控制菌名稱樣品名稱1試驗(yàn)日期規(guī)格樣品批號(hào)生產(chǎn)商類別1 1供試液的制備 及處理保溫振搖法研缽法 勻漿儀檔min水溶性供試品：供試品g(ml)，加稀釋劑ml，制成1:供試液：取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑(名稱；批號(hào) )g(ml)，加稀釋劑ml，制成1：供試液：取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。其它：。培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)起止時(shí)間菌落生長(zhǎng)情況試驗(yàn)組陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照

15、結(jié)論檢查人/日期復(fù)核人/日期第三次:控制菌名稱樣品名稱試驗(yàn)日期規(guī)格樣品批號(hào)生產(chǎn)商類別供試液的制備 及處理保溫振搖法研缽法 勻漿儀檔min水溶性供試品：供試品g(ml)，加稀釋劑ml，制成1:供試液；取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑(名稱；批號(hào) )g(ml)，加稀釋劑ml，制成1：供試液；取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。其它：。培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)起止時(shí)間菌落生長(zhǎng)情況試驗(yàn)組陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照結(jié)論匚F、J,-,r”檢查人/日期復(fù)核人/日期446驗(yàn)證結(jié)論：根據(jù)上述驗(yàn)證結(jié)果，總結(jié)出該品種的微生物限度檢查方法如下：5. 驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)與建議你5.1驗(yàn)證結(jié)果評(píng)估與結(jié)論：按照驗(yàn)證方案的要求實(shí)施驗(yàn)證，并將驗(yàn)證過(guò)程記錄在驗(yàn)證報(bào)告中。對(duì)微生物限度檢查方法驗(yàn)證的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)驗(yàn)證的結(jié)果進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，并建議日常監(jiān)控的項(xiàng)目和周期。5.2驗(yàn)證會(huì)審 驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組對(duì)驗(yàn)證實(shí)施的過(guò)程及結(jié)果進(jìn)行