自學(xué)自講(基因敲除)

1、基 因 敲 除技術(shù)及其應(yīng)用Your site hereContents基因敲除的步驟及方法基因敲除的步驟及方法2基因敲除的定義基因敲除的定義1基因敲除的應(yīng)用基因敲除的應(yīng)用34Your site hereSub title基因敲除的定義 基因敲除基因敲除 ( Gene knockout) 是指一種遺是指一種遺傳工程技術(shù)，針對(duì)某個(gè)序列已知但功能未知傳工程技術(shù)，針對(duì)某個(gè)序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏障，因功能喪失作用，從而使部分功能被屏障，并可進(jìn)一步對(duì)生物體造成影響，進(jìn)而推測(cè)出并可進(jìn)一步對(duì)生物體造成影響

2、，進(jìn)而推測(cè)出該基因的生物學(xué)功能。該基因的生物學(xué)功能。Your site here基因敲除的基本步驟 第一步：第一步：E S E S 細(xì)胞的獲得細(xì)胞的獲得 第二步：重組載體的構(gòu)建第二步：重組載體的構(gòu)建 第三步：重組第三步：重組DNADNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi) 第四步：目的細(xì)胞的篩選第四步：目的細(xì)胞的篩選 第五步：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的獲得第五步：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的獲得 Your site here基因敲除的方法一C r e - L o x P系統(tǒng) C r e -L o x P 系統(tǒng)屬于傳統(tǒng)的同源重組載體, 但是具有了時(shí)空調(diào)控的功能 。它由 C r e 重組酶和 L o x P位點(diǎn)兩部分組成。 C r

3、 e -L o x P 系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的不同發(fā)育階段、 不同組織類型中特異性的刪除 , 可以消除由于基因位置改變?cè)斐傻挠绊? 加強(qiáng)了對(duì)基因的控制能力, 使研究者可以更方便地有針對(duì)性地進(jìn)行目標(biāo)階段的研究工作;C r e -L o x P系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)染色體間的基因重排;但同時(shí)也可以看出該系統(tǒng)對(duì)基因的了解要求極高, 并且對(duì)基因片段的操作能力要求也很高, 基因片段的大小通常在 10 k b 以上, 這些都不利于研究工作進(jìn)行。Your site here基因敲除的方法二轉(zhuǎn)座子系統(tǒng) 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)自從 20世紀(jì) 50年代被 Mc C l i n t o c k 發(fā)現(xiàn)以來(lái), 已經(jīng)成為許多組織器官進(jìn)行基因分析

4、的工具 。在人和小鼠的基因組中, 轉(zhuǎn)座子衍生序列多達(dá)整個(gè)基因組的40 %, 這提示在發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)座子有重要作用 。 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)易于操作 , 所需時(shí)間短 , 具有高通量的特點(diǎn) ,可以攜帶多種抗性標(biāo)記 , 方便了同時(shí)進(jìn)行多基因功能研究。但其應(yīng)用范圍有限, 適用于有一段克隆到的原始基因組序列, 長(zhǎng)度在 10 15 k b , 且轉(zhuǎn)座子應(yīng)滿足以下條件 :轉(zhuǎn)座子本身應(yīng)該很短, 易于操作, 并對(duì)任何期望敲除區(qū)域有高效率;在刪除目的區(qū)域后應(yīng)留下足夠長(zhǎng)的兩臂用于同源重組。這些都限制了轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用。Your site here基因敲除的方法三基因捕獲載體系統(tǒng)基因捕獲技術(shù)是將突變基因?qū)胄∈?E S細(xì)胞從而獲得小

5、鼠基因組文庫(kù) , 進(jìn)行小鼠基因組的功能研究 , 它屬于大規(guī)模隨機(jī)敲除。典型的基因捕獲載體通常包括一個(gè)無(wú)啟動(dòng)子的報(bào)道基因, 并通過(guò)調(diào)控元件使含有小鼠基因組文庫(kù)的 E S 克隆很容易被選擇性培養(yǎng)基篩選出來(lái)。Your site here基因敲除的方法四 H i t 和 R u n 法 H i t 和 R u n 法也稱進(jìn)退策略 。它包括兩次同源重組 :第一步 ( H i t )用插入型載體進(jìn)行同源重組 , 在靶位點(diǎn)插入帶有突變的基因組序列以及帶有兩個(gè)篩選標(biāo)記 ( 如 n e o 和 t k )的載體序列 ;第二步 ( R u n )利用 t k 抗性篩選 , 富集發(fā)生去除了含有負(fù)篩選標(biāo)記基因的載體序

6、列的回復(fù)突變的克隆 。 H i t 和 R u n法的不足之處是 :無(wú)法精確控制染色體內(nèi)的同源重組 , 可能會(huì)失去攜帶突變的同源序列 , 而保留未修飾的內(nèi)源片段 ;整個(gè)過(guò)程需要采用兩種培養(yǎng)基分別進(jìn)行先后兩次篩選 ;無(wú)法同時(shí)引進(jìn)多個(gè)位點(diǎn)突變 。Your site here基因敲除的方法五 . 雙置換法 雙置換法也屬于精細(xì)突變敲除 。它首先用含有 H p r t 基因的打靶載體轉(zhuǎn)染H p r t - E S 細(xì)胞 , 通過(guò)在次黃嘌呤 、 氨喋呤和脫氧胸腺嘧啶苷培養(yǎng)基中篩選并用 P C R進(jìn)行基因組分析 , 篩選發(fā)生同源重組 、 H p r t 基因陽(yáng)性克隆 。然后用只攜帶突變同源序列的打靶載體轉(zhuǎn)染

7、上一步獲得的 H p r t +E S 細(xì)胞 。同源重組發(fā)生后 , 突變序列將 H p r t 置換出來(lái) 。 這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于 , 第一步獲得的 H p r t +E S 細(xì)胞 , 除了可用于產(chǎn)生普通的基因剔除小鼠外 , 也可以作為將不同突變引入靶基因的基礎(chǔ) 。Your site here基因敲除的研究和應(yīng)用1. 1 在人類疾病動(dòng)物模型方面的應(yīng)用1. 2 基因和蛋白功能研究方面的應(yīng)用1. 3 藥物依賴性研究方面的應(yīng)用1. 4 毒理學(xué)研究方面的應(yīng)用1. 5 免疫學(xué)方面的應(yīng)用1. 5 免疫學(xué)方面的應(yīng)用1. 6 治療措施研究方面的應(yīng)用Your site here 在人類疾病研究方面的應(yīng)用 人類幾乎

8、所有的疾病都與基因有關(guān), 基因敲除動(dòng)物模型的建立, 為研究人類疾病提供了一個(gè)嶄新方法 ,尤其是遺傳性疾病。OA1(眼球白化癥 , ocularalbinism)是一種基因紊亂遺傳性疾病 , 能引起視力嚴(yán)重下降 ,斜視 、光恐怖、眼球震顫 。 Incerti3 通過(guò)敲除法去除小鼠 OA1 基因 ,眼科檢查顯示眼球底部黑色素不足 , 臨床癥狀表現(xiàn)與人的相似 , 從而用來(lái)研究 OA1 的發(fā)病機(jī)制。Your site here在基因和蛋白功能研究方面的應(yīng)用 klotho( kl) 基因是 Matsumura 等在研究自發(fā)型高血壓時(shí)發(fā)現(xiàn)的與衰老有關(guān)的新基因 7 。 kl 基因主要在腎臟和腦表達(dá) ,其表達(dá)

9、產(chǎn)物有膜結(jié)合型和分泌型兩種蛋白異構(gòu)體形式, 二者可能分別是膜結(jié)合受體和體液調(diào)節(jié)信號(hào)蛋白 。kl 基因敲除小鼠過(guò)早出現(xiàn)和人類衰老相關(guān)的多種行為和病理生理改變, 如壽命縮短、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、性功能障礙、癡呆、白內(nèi)障、動(dòng)脈粥樣硬化 、肺氣腫 、骨質(zhì)疏松 、免疫功能降低等 8 。Your site here藥物依賴性研究方面的應(yīng)用 利用基因敲除技術(shù)可以選擇性敲除某一特定受體基因, 獲得先天缺失該受體基因的動(dòng)物, 通過(guò)比較基因缺失動(dòng)物和野生型動(dòng)物在依賴性模型上的行為差別,可以準(zhǔn)確判斷該受體所發(fā)揮的作用。阿片受體是阿片類物質(zhì)直接作用的受體, 不僅在介導(dǎo)阿片類鎮(zhèn)痛中發(fā)揮重要作用 ,而且也與精神活性藥物的依賴性有關(guān)

10、。Your site here毒理學(xué)研究方面的應(yīng)用 金屬硫蛋白( MT) 是細(xì)胞內(nèi)富含半胱氨酸巰基( SH) 的小分子蛋白, 目前認(rèn)為 MT 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鋅和銅等功能性金屬離子的體內(nèi)穩(wěn)態(tài) 、拮抗有害重金屬毒性 、捕獲自由基、抗過(guò)氧化應(yīng)激 、抗凋亡和參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等功能17 。利用MT 基因敲除小鼠還可進(jìn)一步觀察多環(huán)芳烴化合物免疫毒性機(jī)制與MT 之間的關(guān)系。另有研究選用MT 基因敲除小鼠和野生型小鼠對(duì) DMBA 的免疫毒性反應(yīng)進(jìn)行了觀察比較 , 結(jié)果發(fā)現(xiàn) DMBA 對(duì)MT 基因敲除的動(dòng)物所造成的免疫損傷比含有 MT的動(dòng)物要明顯嚴(yán)重, 提示 MT 對(duì) DMBA 的免疫毒性具有明顯的保護(hù)作用 。

11、Your site here免疫學(xué)方面的應(yīng)用 近年來(lái),在免疫學(xué)方面出現(xiàn)了幾十種免疫分子基因敲除動(dòng)物模型, 將免疫學(xué)研究特別是免疫耐受的研究推到一個(gè)新的階段 。例如: TCR 基因敲除后 ,小鼠胸腺發(fā)育不全, 脾中 B 細(xì)胞增多; 免疫球蛋白 u鏈基因被敲除后 ,B 細(xì)胞發(fā)育受阻 ; MHC I 和 II 類抗原基因敲除后, 小鼠缺乏 CD4 +、CD8 +型 T 細(xì)胞; 2 微球蛋白基因敲除后缺乏 CD4 +、CD8 +型 T 細(xì)胞 ;RAG 重組酶基因被敲除后 ,出現(xiàn)免疫球蛋白重排障礙等18 。Your site here 治療措施研究方面的應(yīng)用 載脂蛋白 E( ApoE) 基因敲除小鼠是目

12、前在動(dòng)脈粥樣硬化( AS)治療研究領(lǐng)域中應(yīng)用最多的基因工程動(dòng)物 。若干研究表明, 通過(guò)正常體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移治療, 可以延緩 ApoE 基因敲除小鼠 AS 病變的發(fā)展。內(nèi)抑素是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的有效的血管新生抑制劑,Moulton 和 Kruger 19 , 20 發(fā)現(xiàn)通過(guò)大劑量持續(xù)注射內(nèi)抑素全組蛋白能夠有效的抑制 ApoE 基因敲除鼠AS 斑塊的發(fā)展。實(shí)驗(yàn)證明, 將正常小Your site here 治療措施研究方面的應(yīng)用 鼠的骨髓移植到 ApoE 基因敲除小鼠后, 其血清中即可發(fā)現(xiàn) ApoE, 而血漿清除脂蛋白的能力明顯增強(qiáng),血清膽固醇亦達(dá)到正常水平。故認(rèn)為骨髓移植是防止飲食所致小鼠 AS 的有效措

13、施。Your site here 治療措施研究方面的應(yīng)用 人類器官移植在人類疾病治療中起舉足輕重的作用, 但有兩大問(wèn)題一直未得到解決 : 一是器官來(lái)源,目前器官來(lái)源主要是尸體 ,受到時(shí)間和運(yùn)輸?shù)葪l件的限制 ,在有些地方還涉及到宗教的問(wèn)題; 二是器官移植的免疫排斥反應(yīng)?；蚯贸齽?dòng)物模型可能會(huì)解決這兩個(gè)難題 。Kuwaki 等采用基因敲除法 ,將引起超Your site here 治療措施研究方面的應(yīng)用 急性排斥反應(yīng)的半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因敲除, 用此方法培育的動(dòng)物的器官可以移植到人體而無(wú)排斥反應(yīng)。他們已成功培育半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因敲除豬, 且已經(jīng)開展了將該基因敲除豬的心臟移植至狒狒體內(nèi)的實(shí)驗(yàn),經(jīng)移植后的狒

14、狒存活了 2 -6 個(gè)月( 均值為 78天),且均未出現(xiàn)超急性排斥反應(yīng)的表現(xiàn)。Your site here參考文獻(xiàn) 1 陳系古, 都同功.基因打靶技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的進(jìn)展 J .中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志. 1997, 7: 47-50. 2 黃冰, 黃文革, 陳系古, 等.小鼠胚胎干細(xì)胞在六種培養(yǎng)體系的培養(yǎng)觀察 J . 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2000, 8: 1-6. 3 Incerti B , Cortese K, Pizzigoni A, et al.Oa1 knock-out :newinsights on the pathogenesis of ocular albinism type 1 J

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