生物通WesternBlot技術(shù)專(zhuān)輯之PAGE膠電泳和轉(zhuǎn)膜

1、PAGE倒膠的儀器我們?cè)谇懊?WesternBlot儀器之選已經(jīng)介紹過(guò)了，除了順手的工具能防止漏膠，PAG既膠的試劑和配方比例對(duì)電泳結(jié)果的質(zhì)量當(dāng)然有決定性的影響，這個(gè)配 膠的比例，在?分子克隆?上有詳細(xì)的論述，相信大家都不難查到。容易無(wú)視的問(wèn)題主要在 于過(guò)硫酸銨AF一定要新鮮一一最好用小指管配AP 寫(xiě)日期保存在-20度，超過(guò)2周的AP扔掉算了，或者已經(jīng)反復(fù)翻開(kāi)使用屢次的AP都別用，小氣病發(fā)作的后果往往是得不償失膠凝不好多半是這里疏忽或者混合不勻，因?yàn)橄鄬?duì)配膠的其他組分，AP算最活潑分子如果還有諸如漏加某組分或者配比錯(cuò)誤或者 Buffer 搞錯(cuò)，那絕對(duì)是你自己找罵， 不值得同情。水要用去離子的純

2、水，MilliQ 級(jí)更好。Cambrex原來(lái)的FMC有商品化的丙烯酰胺母液，很貴，也很好一一配出的膠對(duì)200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE膠，條帶清晰漂亮， 可惜一直沒(méi)有搞清楚配方的奧秘； 但是數(shù)十倍于丙烯酰胺粉劑的價(jià)格令人卻步， 不過(guò)，對(duì)接觸丙烯酰胺粉塵嚴(yán)重過(guò)敏的人可以選擇這個(gè)。 更加豪華的選擇是已經(jīng)凝好的預(yù)制 膠，各種配方各種比例各種梳孔大小多少任君選擇，翻開(kāi)即用，當(dāng)然更直接方便，更吸引人的是結(jié)果漂亮，分辨率高，特別是重復(fù)性好，條帶真正是 "razor sharp" ??！平時(shí)都能用這 么豪華的東西心情當(dāng)然超爽啊， 實(shí)驗(yàn)緊湊又輕松， 效率也更高??！ 如果實(shí)驗(yàn)都能這

3、么“好馬 配好鞍， 想必更容易出結(jié)果， 也就更容易拿經(jīng)費(fèi)吧！ 什么時(shí)候我們的實(shí)驗(yàn)才能實(shí)現(xiàn)這種良 性循環(huán)啊！ Invitrogen 旗下的Norvex和Cambrex原來(lái)的FMC PAGE嘟是首選預(yù)制膠。 可 是在“社會(huì)主義初級(jí)階段這種奢侈品平時(shí)流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen 公司推出了新的優(yōu)惠活動(dòng)，買(mǎi) 3盒NuPAGE預(yù)制膠就送電泳儀或者電轉(zhuǎn)移，面對(duì)這種誘惑，你難道 就沒(méi)有一點(diǎn)非份之想的沖動(dòng)？上樣電泳 ：上樣前蛋白樣品最好離心， 上樣量不宜過(guò)多，以免看結(jié)果時(shí)， 每個(gè)條帶都彎彎地 “笑你貪多嚼不爛哦。其他的操作，按照說(shuō)明控制電流，不要過(guò)多重復(fù)使用電泳Buffer別小氣，重復(fù)使用會(huì)降

4、低緩沖能力的，好似根本不會(huì)出問(wèn)題了。當(dāng)預(yù)染的Marker 告訴你，你要分辨的蛋白已經(jīng)到達(dá)最正確分辨區(qū)一一別離膠的2/3處，0K電泳結(jié)束了。電泳結(jié)果檢查 ：如果要做 Western Blot ，是否需要先檢查電泳結(jié)果呢？能先看看結(jié)果如何 再進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)膜當(dāng)然最好?？捡R斯亮藍(lán)使用簡(jiǎn)便快速，可以分辨1ug左右的條帶，是最經(jīng) 濟(jì)通用的蛋白PAGE膠電泳染色方法。銀染操作復(fù)雜一些但分辨率高很多，可以分辨2-5 ng蛋白?？墒怯捎诳捡R斯亮藍(lán)染色或者銀染經(jīng)過(guò)固定不可逆結(jié)合，會(huì)干擾后面的 Western Blot實(shí)驗(yàn)，很多人會(huì)選擇省略掉這一步一一同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉(zhuǎn)膜，一般也可以說(shuō)明問(wèn)題。如果想

5、在轉(zhuǎn)膜前看看電泳結(jié)果，你需要用SYPROTangerine 這種金色熒光蛋白染料靈敏度很高一一檢測(cè) 4ng-8ng蛋白，接近銀染，但使用非常簡(jiǎn)單，最重要的是由于 不用酸堿或者有機(jī)溶劑固定， 不干擾蛋白活性，特別適合 Western轉(zhuǎn)膜前的染色，或者非變 性膠的活性蛋白的檢測(cè)比方染色后還需要在膠上進(jìn)行活性檢測(cè)等等?？上YPROTangerine價(jià)格挺貴的，500ul 5000x要2000元，即使很節(jié)約的用只夠大概100屢次呢。所以最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的方法是：麗春紅S,直接染色轉(zhuǎn)移膜，檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果，充分脫色后不干擾Western結(jié)果。麗春紅的檢測(cè)靈敏度和考馬斯亮藍(lán)差不多。轉(zhuǎn)膜：經(jīng)過(guò)PAGE電泳別離后的蛋

6、白質(zhì)樣品需要經(jīng)過(guò)“轉(zhuǎn)膜步驟一一從PAGE交轉(zhuǎn)移到膜上固定，才能用各種方法進(jìn)行Western Blot的檢測(cè)和顯色，而且為了防止沒(méi)有電場(chǎng)的情況下已經(jīng)別離的蛋白條帶擴(kuò)散，轉(zhuǎn)移要盡快進(jìn)行轉(zhuǎn)膜的首要是選膜。在轉(zhuǎn)移膜上顯色其實(shí)就像是畫(huà)家在畫(huà)布上作畫(huà)一樣，不光要有好的畫(huà)筆和顏料，適合的畫(huà)布也是相當(dāng)之重要。WesternBlotti ng 亦是如此，沒(méi)有選擇好適宜的轉(zhuǎn)移膜是無(wú)法做出漂亮的結(jié)果的。因此，選擇適合 的轉(zhuǎn)移膜，要讓轉(zhuǎn)移“膜高一尺，幫襯而不是阻礙到我們的實(shí)驗(yàn)。Western Blot印跡常用的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素膜 Nitrocellulose Blott ingMembranes NQ 和 PV

7、DFM Polyvinylidene-Fluoride，此外也有用尼龍膜、DEA筍維素膜做蛋白印跡。具體哪種膜適合于哪些實(shí)驗(yàn)?zāi)?？選擇的根據(jù)主要有：a.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量，以及膜的孔徑也就是攔截蛋白的大?。籦.不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好；c.如果后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比方要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來(lái)挑選不同的轉(zhuǎn)移膜，就像國(guó)畫(huà)要選擇宣紙，油畫(huà)要挑亞麻布或薄棉扣布一樣。首先來(lái)比擬下這幾種膜的特點(diǎn)在下與蛋白質(zhì)的結(jié)合材料質(zhì)地干的NC膜易脆軟而結(jié)實(shí)機(jī)械強(qiáng)度咼溶劑耐受性無(wú)無(wú)有操作程序緩沖液潤(rùn)濕，防止氣泡緩沖液潤(rùn)濕使用前1

8、00%甲醇潤(rùn)濕檢測(cè)方式常規(guī)染色，可用放射性和非放射性檢測(cè)不能用陰離子染料常規(guī)染色，比擬于NC膜，可用考馬斯亮藍(lán)染色，可用于 ECL檢 測(cè)，快速免疫檢測(cè)。適用范圍0.45um 一般蛋白0.2um 一分子量小于20kD蛋白0.1um 一分子量小于 7kD蛋白低濃度小分子蛋 白、酸性蛋白、 糖蛋白和蛋白多 糖主要用在核 酸檢測(cè)中糖蛋白檢測(cè)和蛋白質(zhì)測(cè)序價(jià)格價(jià)格較廉價(jià)廉價(jià)較貴1. 硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜是蛋白印跡最廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對(duì)蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合能力，而且適用于各種顯色方法，包括同位素，化學(xué)發(fā)光Luminol類(lèi)、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很簡(jiǎn)便，比方不需要甲醛預(yù)處

9、理，只要在無(wú)離子水面浸 潤(rùn)排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；比方NC膜很容易封閉，也不需要特別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在適宜的條件下可以穩(wěn)定保存很長(zhǎng)時(shí)間，Schleicher & Schull公司的一個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，轉(zhuǎn)移到NC膜上的幾種蛋白4度條件下保存5年依然保持免疫識(shí)別特性，依然可以得到清晰可信的Western Blot結(jié)果。不過(guò)要注意的是純的硝纖膜在比擬脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要屢次重復(fù)清洗的用途一一因?yàn)榻?jīng)不起屢次“折磨。選擇硝纖膜時(shí)要注意的是選擇適宜的孔徑，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話(huà)建議選擇0.2u

10、m的，如果小于7KD的話(huà)最好選擇 0.1um的膜。另外還要注意選擇純的NC膜一一混有含醋酸纖維CM的NC膜結(jié)合力會(huì)有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上結(jié)合的蛋白會(huì)因?yàn)橐恍┤ノ蹌┒淮?，因此在封閉時(shí)最好使用較溫和的 Tween20,而且濃度不要超過(guò) 0.3% 據(jù)說(shuō)0.05%效果最好。硝纖膜最為大家熟悉和認(rèn)可的品牌就是Schleicher & Schull；Millipore ； PALL，另外羅氏、 Invitrogen 、 GEAmersham、 Santa Cruz 等公司都有提供各式的硝纖膜估計(jì)OEM的可能性比擬大，不過(guò)有時(shí)挺奇怪的，OEM勺有時(shí)比生產(chǎn)廠(chǎng)家賣(mài)的還廉價(jià)。Schlei

11、cher & Schull 的名字拗口那大概需要舌頭在口腔里經(jīng)過(guò)假設(shè)干次不同弧度和不同 速度的上下往返精確運(yùn)動(dòng)再配適宜當(dāng)?shù)耐職獠拍茏x得準(zhǔn)確優(yōu)雅，不過(guò)作為第一個(gè)提供硝纖膜的廠(chǎng)家依然廣為人知，其N(xiāo)C膜分為純NC膜和強(qiáng)化NC膜兩種：Protran nitrocellulosemembrane和 Optitran nitrocellulosemembrane 前者 Protran 直是 Schleicher & Schull自豪的產(chǎn)品，這種"100% Pure Nitrocellulose Membra nes。一般而言，NC膜越純，其蛋白結(jié)合能力就越高，所以要增加WB的靈敏

12、度和分辨率，提高所使用膜的純度是個(gè)可以考慮的選擇。如果 NC膜攙雜一些醋化纖維素一一這在前面已經(jīng)提到，會(huì)影響蛋白質(zhì)結(jié)合。而 Protran 在制作過(guò)程中去除了各種雜質(zhì)，保證了其純度，從而增加了蛋白結(jié)合能力。除了這 一點(diǎn)以外， Protran 還有低背景、多孔徑選擇 0.45, 0.2, 0.1um 和保存時(shí)間長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)證 明膜上蛋白識(shí)別時(shí)間可長(zhǎng)達(dá) 5 年！真是“路遙知馬力的典范 等優(yōu)點(diǎn)。 但是 Protran 由于 是純NC膜，比擬脆，機(jī)械耐受力欠佳，需要小心操作，如果擔(dān)憂(yōu)自己“粗手粗腳，那么 就可以考慮一下 Optitran 或者 Pall 公司的以耐受力著稱(chēng)的 BioTrace NT Nitr

13、ocellulose Transfer Membrane 。Optitran 是在一層超薄聚酯支撐膜的兩面均勻鋪上100%純的硝酸纖維素， 結(jié)果外表看起來(lái)和純硝纖膜完全一樣，保持了NC膜各種優(yōu)點(diǎn)，只是內(nèi)部多了一層中性支持物，大大增強(qiáng)這種強(qiáng)化NC膜的柔韌度和機(jī)械耐受力，不容易卷曲，方便操作，特別是重復(fù)標(biāo)記和洗 脫的實(shí)驗(yàn)。不過(guò)有的使用過(guò)的人反響不如純NC膜結(jié)合能力強(qiáng)。NC膜除了一般的Discs、Rolls和Sheets以外，像Invitrogen 、Bio-Rad公司還有一種方便顧客使用的“ sandwich 三明 治形，十分有趣。說(shuō)它有趣是因?yàn)榭紤]周到，利于高通量操作，但其實(shí)也就是將濾紙和NC膜

14、紙?zhí)壮蔀V紙一NC膜一濾紙的層迭形式，預(yù)先切割裝訂好，方便使用。不過(guò)，卷膜肯定是 最實(shí)惠的選擇， 只不過(guò)要自己動(dòng)手裁剪切記， 必須帶手套操作。 不知道為什么在國(guó)外硝 纖膜會(huì)被當(dāng)作危險(xiǎn)品來(lái)運(yùn)輸還要加收運(yùn)費(fèi)，所以貨期蠻長(zhǎng)的，所以還是卷膜好，一卷用n年如果非要給這個(gè) n 加個(gè)期限，那就是 至少可以用到等我畢業(yè)之后。2. PVDF 膜剛開(kāi)始做WB勺人也許會(huì)有這種疑問(wèn)：為什么實(shí)驗(yàn)室的老師或者師兄師姐們?cè)诮?我們做WB勺時(shí)候，如果是用 PVDF膜做，總是小心翼翼的剪，節(jié)省著用，甚至一些邊邊角角 也舍不得丟掉呢？其實(shí)，這不僅是因?yàn)镻VDF膜比擬貴，還由于PVDF膜是做WB勺“殺手锏。聚偏二氟乙烯PVDF膜作為

15、基質(zhì)的轉(zhuǎn)印膜由Millipore 公司在1985年首先推出。與硝酸纖維素膜相比，PVDF膜在蛋白質(zhì)截留能力，機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)相容性上都更優(yōu)越的性能Pluskal,et al.,1986。市售硝酸纖維素膜的典型結(jié)合量是80-100卩g/cm2,而PVDF膜結(jié)合量是100-200卩g/cm2 而結(jié)合強(qiáng)度 PVDF比硝纖膜強(qiáng)6倍！。在艾滋病毒HIV血 清學(xué)檢驗(yàn)中直接比擬 PVDF和硝酸纖維素膜，PVDF膜具有更好的截留總 HIV抗原能力并提高 抗體檢測(cè)糖基化被膜抗原的性能。但是PVDF膜最大的優(yōu)點(diǎn)不僅于此：更好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)耐受性使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測(cè)中成為理想選擇；而且單個(gè)凝膠的

16、泳道 復(fù)本可用于多種目的，如考馬斯亮藍(lán)染色后切出條帶并進(jìn)行N-末端測(cè)序、蛋白消化/肽別離/內(nèi)部測(cè)序和免疫檢測(cè)Kurien,et al.,2003。特別是需要做N端蛋白測(cè)序，在相當(dāng)“嚴(yán)酷 的清洗條件下，當(dāng)尼龍或者硝纖膜已經(jīng)降解的情況下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白測(cè)序的唯一選擇。此外，個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，一些強(qiáng)疏水蛋白用 PVDF膜效果會(huì)更好一些。PVDF膜適用的檢測(cè)方法也不少，化學(xué)發(fā)光、常規(guī)顯色、同位素和標(biāo)準(zhǔn)染色都一 樣OK但不適合熒光。PVDF膜特別注意的是需要 100%甲醇預(yù)處理不超過(guò) 15秒再用緩 沖液平衡，才能用，而且適用過(guò)程中萬(wàn)一干了也要同樣程序再處理不過(guò)要真出現(xiàn)這

17、種問(wèn)題也是自己欠扁，誰(shuí)要你不小心呢，轉(zhuǎn)膜前處理也就罷了，轉(zhuǎn)膜后再這樣處理可能會(huì)影響后繼的抗體識(shí)別呢。PVDF膜同樣分0.45um和0.2um的，后者孔徑小，對(duì)小分子蛋白有較好的 攔截吸附，背景可能會(huì)比前者稍高。PVDF膜常見(jiàn)的有以下幾個(gè)品牌公司產(chǎn)品名孔徑適用范圍參考價(jià)格MilliporeImmobilo nTran sfer0.45um$212Membra nes0.2umBio-RadImmu n-Blot PVDF Membra neChemilu min esce nt,colorimetricwester nblots,amino-term inalsequenee and total

18、 aminoacid compositi onPiercePVDF Membra ne0.45umWestern,Souther n,0.2umNorther n, and dot blotsPall LifeBioTracePVDF Tran sfer0.45umNucleic acidand protein$149ScienceMembra netran sfers.Proteinr_iseque ncingIn vitroge nPVDF Membra ne0.45umProteinseque ncing,¥ 1625.80.2umimmuno blott ingWhatma

19、nWestra n Clear Sig nal PVDF0.45umWester n blotsMembra ne作為PVDF膜的鼻祖，Millipore 公司的PVDF膜Immobilon系列分為Immobilon-P(0.45um) , -PSQ(0.2um), -FL(用于熒光顯色)和 BlottingSandwiches for High Troughput四種。Immobilon-P膜孔徑均一，具有極強(qiáng)的吸附能力，染色性能好、抗溶劑能力強(qiáng)和信噪比高，有助于提高檢測(cè)靈敏度，而且開(kāi)放的孔結(jié)構(gòu)容易接近被吸附的蛋白質(zhì)，并有助于去除背景上沒(méi)有吸附的探針，可以說(shuō)是免疫印跡檢測(cè)理想的印跡膜。Imm

20、obilon-PSQ轉(zhuǎn)印膜是印跡小分子蛋白質(zhì)(<20KDa)的理想選擇優(yōu)良的蛋白質(zhì)吸附性能，滲漏少。內(nèi)外表面積較 大，可供蛋白質(zhì)吸附從而提高蛋白質(zhì)測(cè)序的得率。由于不含污染性支撐物或外表活性劑，Immobilon-PSQ層析譜上的背景峰值極小。Immobilon-FL也是Millipore 值得驕傲的產(chǎn)品，因?yàn)檫@是第一個(gè)專(zhuān)門(mén)為熒光顯色優(yōu)化的轉(zhuǎn)移膜。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，這種膜在Kodak成像系統(tǒng)可以顯示僅7ng的蛋白，聽(tīng)起來(lái)不錯(cuò)吧，有興趣可以試一試。這幾種膜除了一般的PVDF膜的優(yōu)點(diǎn)之外，最大特點(diǎn)就是一個(gè)字快。按照 Millipore的操作手冊(cè)，Immobilon可以在保證質(zhì)量的前提下縮短 WE時(shí)

21、間到2個(gè)小時(shí)一一主要是縮短封閉和洗脫時(shí)間。這可真是個(gè)好消 息，因?yàn)樽谀莾旱?WB吉果多浪費(fèi)時(shí)間?。】s短這個(gè)費(fèi)時(shí)而枯燥的過(guò)程，早出結(jié)果，可以 提高實(shí)驗(yàn)效率，利于我們分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮下步對(duì)策嘛。卷膜經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，裁剪剩下的邊角料還可以用來(lái)做點(diǎn)雜交，而預(yù)裁剪的即用膜更適合高通量等等“用金錢(qián)換時(shí)間的實(shí)驗(yàn)。再次強(qiáng)調(diào)的是，疏水 PVDF膜在用前必須經(jīng)過(guò) 50%或以上體積比的甲醇或者乙醇溶液處理幾分 鐘，待膜變成半透明后用MilliQ 水或者純水漂洗一下，轉(zhuǎn)入電泳緩沖液平衡才能用。Invitrogen公司的PVDF膜也有大家風(fēng)范：膜是與兩張預(yù)裁的濾紙同時(shí)提供，方便使用；雖然一般而言 0.2um的膜滲漏少適用

22、性會(huì)更強(qiáng)，但I(xiàn)nvitrogen的0.45umPVDF膜自有自家優(yōu)勢(shì)一一特別適合于低背景，高敏感度的印跡反響，同樣需要在乙醇或者甲醇，或者異丙醇中浸泡5分鐘就可以用了。3. 尼龍膜尼龍膜更多是用于核酸的轉(zhuǎn)移，也有見(jiàn)于蛋白印跡，比方dot blot ，比擬于NC膜來(lái)說(shuō)，它的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合力強(qiáng)，特結(jié)實(shí)又柔軟且不易卷曲，機(jī)械強(qiáng)度大，便于操作，缺點(diǎn)是背 景高一一由于尼龍膜電荷密度高，使得非結(jié)合區(qū)的封閉比疏水性NC膜困難，對(duì)于靈敏度高的檢測(cè)方法，背景問(wèn)題尤為突出據(jù)分子克隆山 說(shuō)通過(guò)熱處理的酪蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮延長(zhǎng)封閉時(shí)間可以改善，而且當(dāng)轉(zhuǎn)移緩沖液中存在有SDS時(shí)蛋白質(zhì)就容易從尼龍膜上泄漏通過(guò)甲醛固定可

23、以緩解這一情況。另外至今也沒(méi)有適合尼龍膜上的直接染色方法。 因此在許多情況下實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行WE實(shí)驗(yàn)不選擇尼龍膜。盡管如此，一些產(chǎn)品卻能“取其精華，去其糟粕，將尼龍膜一些不利于蛋白印跡的因素縮小或者去除，使其成為有效的蛋白轉(zhuǎn)移介質(zhì)。比方說(shuō)，化學(xué)發(fā)光底物做得相當(dāng)出色的Pierce 公司，其旗下的 Biodyne A&B Nylon Transfer Membrane就是這樣一個(gè)產(chǎn)品。這種分為A，B兩型的尼龍膜做工精良，孔徑大小一致，為了保有尼龍膜高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)和摒 棄背景影響大的缺點(diǎn)，Biodyne采用了適宜的signal-to-noise比例來(lái)調(diào)整，從而到達(dá)了200ug/cm2的蛋白結(jié)合

24、能力，同時(shí)有比大多數(shù)尼龍膜甚至比一些NC膜都要小的低背景。除此之外，B型的Biodyne對(duì)于一些帶負(fù)電蛋白是一種理想的轉(zhuǎn)移膜，因?yàn)樗贏型的根底上提高了正電荷集團(tuán)的濃度。另外Biodyne相對(duì)于NC膜來(lái)說(shuō)還是一種“打不怕，撕不爛，燒不著200C下的“頑強(qiáng)的轉(zhuǎn)移膜。二、SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳SDS- PAGEA:實(shí)際操作1. 做膠前的準(zhǔn)備1檢查是否有足夠的、干凈的spacer、comb和架子。2檢查是否有新鮮的，足量10%APS沒(méi)有立刻重配。3按將要檢測(cè)的抗體對(duì)應(yīng)的原始抗原的分子量大小，計(jì)算出膠的濃度，并算出別離膠各組分的用量。2. 制膠，電泳1裝好架子。2按照下面配方配制別離膠。單位：ml

25、. Total : 8ml7.5%10 %15%2 x Sep. buffer44430 % Gel.sol2.02.74ddH 2O1.91.20TEMED8ul8ul8ul10%APS80ul80ul80ul在膠上面參加一層蒸餾水，促進(jìn)膠更好的凝集。3待別離膠凝集后，配制濃縮膠。單位：ml, Total : 3.5ml3 %2< Stacking. buffer1.730% Gel.sol0.35ddH 2O1.4TEMED5ul10%APS50ul倒好后插入預(yù)先準(zhǔn)備好的梳子。4待膠凝集好后，上樣，電泳。上層膠用60-80V電壓，當(dāng)樣品至別離膠時(shí)，用100-120V電壓。一般電泳時(shí)間

26、在 1.5小時(shí)左右。B :考前須知及常遇到的問(wèn)題1別離膠不要倒的太滿(mǎn)，需要有一定的濃縮膠空間，否那么起不到濃縮效果。2 上樣蛋白量不應(yīng)超過(guò) 30ug/mm 載荷面即：如果你的膠槽是5mn¥ 1mm那么載荷面為：21mm< 5mm=5mm。3 gel通常在0.5-1h內(nèi)凝集最好，過(guò)快表示TEMEDAPS用量過(guò)多，此時(shí)膠太硬易龜裂， 而且電泳時(shí)容易燒膠。太慢那么說(shuō)明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實(shí)際不純或?qū)嵭А? 混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。5 電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。亠 條帶呈皺眉狀，可能是

27、由于裝置不適宜，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或 者兩邊聚合不完全。拖尾：樣品溶解不好。紋理縱向條紋：樣品中含有不溶性顆粒。條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。條帶兩邊擴(kuò)散：加樣量過(guò)多。三、轉(zhuǎn)移在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體膜上。膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBMDDT尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF聚偏二氟乙烯，其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。有兩種規(guī)格：Immobilon-P 0.45um和 Immobilon-PSQ0.2um for MW<20kDa 。A半干法即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過(guò)濾紙上吸

28、附的緩沖液傳導(dǎo)電 流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因?yàn)殡娏髦苯幼饔迷谀つz上，所以其轉(zhuǎn)移條件比擬嚴(yán)酷，但是其轉(zhuǎn)移 時(shí)間短，效率高。1實(shí)驗(yàn)條件的選擇電流1mA-2mA/cm2我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、 膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時(shí)間， 具體可以根據(jù)實(shí)際適當(dāng)調(diào)整。目的蛋白分子大小kDa膠濃度轉(zhuǎn)移時(shí)間h80-1408%25-80101.515-40120.75<20150.52實(shí)驗(yàn)操作1濾紙和膜的準(zhǔn)備在電泳結(jié)束前20分鐘應(yīng)開(kāi)始準(zhǔn)備工作。A.檢查是否有足夠的tran sfer buffer，沒(méi)有立即配制。B.檢查是否有適宜大小的濾紙和膜。C.將膜泡入甲醇中，約 1-2分鐘。再轉(zhuǎn)入tran sfer b

29、uffer中。D.將適宜的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入tran sfer buffer中。2轉(zhuǎn)移A. 在電轉(zhuǎn)移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。B. 將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transfer buffer 到膜上，保持膜的濕潤(rùn)。C. 將膠剝出，去掉stack gel ，小心的移到膜上。D. 剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標(biāo)記出膠的位置。E. 將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。倒上些transfer buffer，再鋪兩張靠膠濾紙。F. 裝好電轉(zhuǎn)移儀，根據(jù)需要選定所需的電流和時(shí)間。G. 轉(zhuǎn)移過(guò)程中要隨時(shí)觀察電壓的變化，如有異常應(yīng)及時(shí)調(diào)整。CATHODE (T靠膠濾紙膠膜靠膜濾紙ANO

30、DE (+)Fig* I*OirKfrh 卜3考前須知及常遇到的問(wèn)題1 濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙>=膜>=膠。2濾紙、膠、膜之間千萬(wàn)不能有氣泡，氣泡會(huì)造成短路。3因?yàn)槟さ氖杷?，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必?隨時(shí)保持濕潤(rùn)干膜法除外。4濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙靠膜內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過(guò)的蛋白質(zhì)，所以上下 濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。5轉(zhuǎn)移時(shí)間一般為 1.5小時(shí)，1mA-2mA/cm2 10%gel，可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時(shí)間 和電流大小。B 濕法 我們根本上不用此方法，這里暫不做介紹。C 轉(zhuǎn)移后效果的鑒定1染膠用

31、考馬斯亮蘭染色經(jīng) destain 脫色后，看膠上是否還有蛋白來(lái)反映轉(zhuǎn)移的效果。 2染膜有兩類(lèi)染液選擇，可逆的和不可逆的?？赡娴挠?ponceau-s red 、 Fastgreen FC、CPTS 等，這類(lèi)染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進(jìn)一步的分析用。但是不可逆的染料， 如考馬斯亮蘭、 india ink 、 Amido.black 10B 等，染色后膜就不能用于進(jìn)一步的分析。四、封閉 block 封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。常用的封閉液有 bovine serum albuminBSA ，non-fat milk ，casein ，gelatin ，tween-20 等，我們一般用 non-fat milk 。在轉(zhuǎn)移結(jié)束前配好 5%的 MilkTBST 溶解 。轉(zhuǎn)移結(jié)束后將膜放入 milk 中 block 一定要 放在干凈的容器里，防止污染而且要足以覆蓋膜 ，并清洗整理好用過(guò)的濾紙，以便下次使 用。Block 4 ° C O/N,或 RT