MGMT-甲基化試劑盒研發(fā)

1、人類MGMT基因（啟動子）甲基化檢測(MSP法)試劑盒研發(fā)項目分享主講人：劉駿琿 技術(shù)支持：劉旭宏抑癌基因 它可以通過多種信號傳導(dǎo)途徑以及蛋白-蛋白之間的相互影響起作用，影響細胞生長、分化、轉(zhuǎn)移、粘連、增殖及細胞周期，促進凋亡，抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。MGMT基因啟動子 1.與癌癥相關(guān) 腦膠質(zhì)癌 腸癌 口腔癌 腸癌研發(fā)思路MGMT甲基化檢測試劑盒研發(fā)引物的篩選引物性能的評估引物優(yōu)化比例的確定初步檢測體系的建立多因素優(yōu)化設(shè)計DNA質(zhì)控體系建立，甲基化標準品合成基因殘留質(zhì)控轉(zhuǎn)化成功質(zhì)控98%轉(zhuǎn)化參考品構(gòu)建篩選合格樣本甲基化濃度梯度參考品甲基化水平的檢出檢測流程的建立分析性能評估檢測體系建立HAN

2、DS系統(tǒng)的引入檢測位點確定 通過文獻調(diào)研確定MGMT基因啟動子區(qū)域 甲基化CpG島預(yù)測并與文獻比較 ACGAACGTCGAAACGCAAAACGTTCTAAAAACGCG 共7個潛在CpG位點 MGMT甲基化標準品構(gòu)建 1.確定目標序列，設(shè)計引物 2.重疊延伸PCR制備DNA 3.菌液培養(yǎng) 4.濃度標定 5.測序驗證DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化體系確定 供應(yīng)商選擇1.天根DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(DP215)2.EpiMark重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒3.EZ DNA Methylation-GOLD Kit 轉(zhuǎn)化程序選擇 1. 98C for 10 minutes 2. 53C for 30 minut

3、es 3. 53C for 6 minutes OR 4. 37C for 30 minutes 5. 4C storage（3-4步 8循環(huán)）qPCR體系建立三大體系 G體系 針對人類基因組DNA設(shè)計 P（非甲基化）體系 根據(jù)轉(zhuǎn)化后序列（非CpG位點設(shè)計探針） L（甲基化）體系 覆蓋CpG位點（全甲基化）的長探針引物探針設(shè)計 HANDS系統(tǒng)引入 1.減少引物二聚體 2.增加結(jié)合效率 3.增加酶切活性 4.保護堿基HANDS系統(tǒng)5353針對基因組DNA轉(zhuǎn)化模板引物的篩選實驗 實驗結(jié)果表明：F1R2 檢測Ct值靠前，擴增效率較高，因此擬采用這對引物作為檢測引物F1R2F1R1;F1R3;F2R2

4、;F2R3;F3R2;F3R3;F4R2淬滅探針 甲基化長探針BHQFAMBHQ針對基因組DNA轉(zhuǎn)化模板探針以及引物HAND的篩選實驗 實驗結(jié)果表明：AT-F1R2+POBE2檢測Ct值靠前，擴增效率較高，因此擬采用這對引物作為檢測引物F1R2+PROBE1AT-F1 AT-R2+PROBE1F1R2+POBE2AT-F1 AT-R2+POBE2反應(yīng)體系優(yōu)化 1.體系中Buffer，Mg2+,引物濃度等優(yōu)化。 2.添加劑優(yōu)化：蔗糖，NH4+, BSA針對基因組DNA轉(zhuǎn)化模板檢測體系添加劑體系篩選 實驗結(jié)果表明：在反應(yīng)體系中不添加任何添加劑對檢測的效果較好;F1R2+PROBE2F1R2+PRO

5、BE2+20um蔗糖F1R2+PROBE2+4.6mM NH4+1R2+PROBE2+K+; F1R2+PROBE2+0.1%BSA分析性能評估 1.特異性考察 2.梯度標準品驗證 3.反應(yīng)體系穩(wěn)定性 4.靈敏度考察針對實驗室保存正常人類基因組DNA轉(zhuǎn)化模板檢測應(yīng)用甲基化檢測探針檢測其特異性結(jié)果表明，目前合成的甲基化檢測談針對甲基化樣品的探針對于臨床正常非甲基化樣品不能檢出，特異性強，而采用非甲基化探針可以檢測信號。應(yīng)用甲基化檢測探針檢測其MGMT基因甲基化梯度參考品實驗結(jié)果表明：目前體系針對不同程度甲基化模擬模板，靈敏度為可以為檢測到6copies/ul400copies/ul200copi

6、es/ul100copies/ul50copies/ul25copies/ul12copies/ul6copies/ul針對基因組DNA轉(zhuǎn)化模板檢測體系少量臨床樣本檢測實驗結(jié)果表明：目前體系可以對臨床絕大部分DNA轉(zhuǎn)化液進行MGMT啟動子的檢測，只需要一次PCR即能實現(xiàn)檢測，不需要巢式PCR針對基因組DNA轉(zhuǎn)化模板檢測體系靈敏度深入考察 8倍 16倍 32倍 64倍 128倍 256倍 512倍 實驗結(jié)果表明：針對基因組DNA轉(zhuǎn)化模板檢測體系，可以檢測到轉(zhuǎn)化液稀釋512倍相當于基因組拷貝數(shù)12質(zhì)量控制體系的建立參考品構(gòu)建 98轉(zhuǎn)化液構(gòu)建 由100人類基因組轉(zhuǎn)化液與人類基因組按比例對參得到 1：

7、1甲基化參考品 由100人類基因組轉(zhuǎn)化液與甲基化質(zhì)粒標準品按比例對參得到 應(yīng)用非甲基化檢測探針檢測其MGMT基因甲基化梯度參考品結(jié)果表明 梯度稀釋的質(zhì)粒標準品稀釋2*103copies/ul在Ct值上與400ng轉(zhuǎn)化人類基因組相一致，將這2種樣品等量對摻相當于甲基化和非甲基化為1：1的標準品2*107copies/ul-2*103copies/ul應(yīng)用轉(zhuǎn)化液通檢探針檢測其MGMT基因甲基化質(zhì)粒梯度參考品并且對臨床正常樣本轉(zhuǎn)化液進行初步定量實驗結(jié)果表明：目前梯度稀釋范圍從2*1010copies/ul到2*103copies/ul，臨床正常樣本轉(zhuǎn)化液lCt值位于2*103copies/ul之后，

8、需要進一步定量2*1010copies/ul2*109copies/ul2*108copies/ul2*107copies/ul2*106copies/ul2*105copies/ul2*103copies/ul臨床正常樣本轉(zhuǎn)化液應(yīng)用轉(zhuǎn)化液通檢探針檢測其MGMT基因甲基化質(zhì)粒梯度參考品并且對臨床正常樣本轉(zhuǎn)化液進行進一步定量結(jié)果表明 梯度稀釋的質(zhì)粒標準品稀釋40 copies/ul在Ct值上與2.5ng轉(zhuǎn)化人類基因組相一致，將這2種樣品等量對摻相當于甲基化和非甲基化為1：1的標準品（50%甲基化參考品）2*103copies/ul400copies/ul臨床正常樣本轉(zhuǎn)化液80 copies/ul16 copies/ul4 copies/ul甲基化靈敏度 采用MGMT基因啟動子50%的甲基化參考品，按照比例依次稀釋，依次構(gòu)建 50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%應(yīng)用甲基化檢測探針檢測其MGMT基因甲基化梯度參考品對摻正常人類基因組轉(zhuǎn)化液（按照400copies/ul-6copies/ul每一個濃度都加上正常人類基因組轉(zhuǎn)化液）實驗結(jié)果表明：目前體系針對不同程度甲基化模擬模板靈敏度為2.4%以上濃度梯度均加入2.5ng正常人類基因組轉(zhuǎn)化液構(gòu)成（50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%）參考品400copies/ul200copies/ul100co