高效液相色譜分離分析技術(shù)

1、高效液相色譜法高效液相色譜法High Performance Liquid Chromatography高效液相色譜儀器高效液相色譜儀器目錄l儀器的結(jié)構(gòu)l分離原理l分離特點(diǎn)和局限性l分類l應(yīng)用范圍l建立方法的步驟高效液相色譜儀器的結(jié)構(gòu)高效液相色譜儀器的結(jié)構(gòu)一般一般分為分為4個(gè)主要個(gè)主要部分：部分：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度洗脫、自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。此外還配有輔助裝置：如梯度洗脫、自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。工作過程如下：工作過程如下： 首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)

2、過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。1. 高壓輸液系統(tǒng)：高壓輸液系統(tǒng)：一般一般由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動(dòng)阻力由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。高壓泵應(yīng)滿足如

3、下要求：高壓泵應(yīng)滿足如下要求：流量恒定，無脈動(dòng)，并有較大的調(diào)節(jié)范圍。流量恒定，無脈動(dòng)，并有較大的調(diào)節(jié)范圍。能抗溶劑的腐蝕，耐酸、耐堿。能抗溶劑的腐蝕，耐酸、耐堿。有較高的輸送壓力。一般分離，有較高的輸送壓力。一般分離，6.0104 Pa壓力；壓力；高效分離，要求達(dá)到高效分離，要求達(dá)到1.53.0107 Pa的壓力或更的壓力或更高。高。 泵的死體積要小，便于迅速更換溶劑和進(jìn)行梯度泵的死體積要小，便于迅速更換溶劑和進(jìn)行梯度淋洗。淋洗。在在高效液相色譜中，常用的進(jìn)樣方式：高效液相色譜中，常用的進(jìn)樣方式：高壓閥進(jìn)樣：高壓閥進(jìn)樣：優(yōu)點(diǎn)是能用于高壓，適于大體積進(jìn)樣，重現(xiàn)性優(yōu)點(diǎn)是能用于高壓，適于大體積進(jìn)樣，

4、重現(xiàn)性好；缺點(diǎn)是進(jìn)樣閥進(jìn)樣時(shí)需排掉一部分試樣，不同的進(jìn)樣好；缺點(diǎn)是進(jìn)樣閥進(jìn)樣時(shí)需排掉一部分試樣，不同的進(jìn)樣量需用不同的量需用不同的定量管定量管，同時(shí)峰的擴(kuò)展也比注射進(jìn)樣大。，同時(shí)峰的擴(kuò)展也比注射進(jìn)樣大。微量注射器進(jìn)樣：微量注射器進(jìn)樣：也可由微量注射器注入取樣環(huán)少量樣品，也可由微量注射器注入取樣環(huán)少量樣品，即采用較大體積取樣環(huán)而進(jìn)少量試樣，進(jìn)樣量由注射器控即采用較大體積取樣環(huán)而進(jìn)少量試樣，進(jìn)樣量由注射器控制，試樣不充滿取樣環(huán)，只填充一部分體積。制，試樣不充滿取樣環(huán)，只填充一部分體積。2. 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)3. 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)-色譜柱色譜柱色譜柱色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管是液相色譜的

5、心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其它金屬。鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其它金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長色譜柱長1530 cm，內(nèi)徑為，內(nèi)徑為45 mm，凝膠，凝膠色譜柱內(nèi)徑色譜柱內(nèi)徑312 mm，制備柱內(nèi)徑較大，可，制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)達(dá)25 mm 以上。以上。在在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器: 溶質(zhì)性檢測器溶質(zhì)性檢測器：僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，有

6、紫外有紫外UVD、熒光、熒光FD、二極管陣列檢測器、二極管陣列檢測器DAD等。等。 總體檢測器：對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，總體檢測器：對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，有示差折光檢測器有示差折光檢測器RID、電化學(xué)檢測器、電化學(xué)檢測器ECD、蒸發(fā)光散射檢測、蒸發(fā)光散射檢測器器ELSD和質(zhì)譜檢測器和質(zhì)譜檢測器MSD等。等。4. 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)分離原理由泵將儲(chǔ)液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測量之后，導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測物由進(jìn)樣器注入，并隨流動(dòng)相通過色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測器，檢測信號由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物

7、分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動(dòng)相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。分離特點(diǎn)和局限性特點(diǎn)：特點(diǎn)： 高速：高速：HPLC分離效率高，速度快，一次幾分鐘和幾十分鐘就可完成。色譜分離效率高，速度快，一次幾分鐘和幾十分鐘就可完成。色譜柱的壽命長，可達(dá)兩年以上。柱的壽命長，可達(dá)兩年以上。 高效：高效：HPLC高壓高壓(26 MPa)下操作，填料顆粒小下操作，填料顆粒小(250 m)，規(guī)則均勻的固，規(guī)則均勻的固定相，傳質(zhì)阻力小，柱效高定相，傳質(zhì)阻力小，柱效高(N=400060000 塊塊/m)，分離效率高。

8、，分離效率高。 高靈敏度：高靈敏度：現(xiàn)代高效液相色譜儀普遍配有高靈敏度檢測器，使分析靈敏度比現(xiàn)代高效液相色譜儀普遍配有高靈敏度檢測器，使分析靈敏度比經(jīng)典色譜有大提高（紫外檢測器最小檢測限可達(dá)經(jīng)典色譜有大提高（紫外檢測器最小檢測限可達(dá)10-9 g；熒光檢測器最小檢；熒光檢測器最小檢測限可達(dá)測限可達(dá)10-1110-13 g。 高自動(dòng)化：高自動(dòng)化：HPLC進(jìn)樣量小進(jìn)樣量小(XX0 L)。帶有自動(dòng)進(jìn)樣裝置和工作站。帶有自動(dòng)進(jìn)樣裝置和工作站。分離特點(diǎn)和局限性局限性：局限性： HPLC具有應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)，但是也有一些局限性。首先，其分析成本具有應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)，但是也有一些局限性。首先，其分析成本高于氣

9、相色譜法，且易引起環(huán)境污染，當(dāng)進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，比氣象色譜法高于氣相色譜法，且易引起環(huán)境污染，當(dāng)進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，比氣象色譜法的程序升溫操作復(fù)雜。且的程序升溫操作復(fù)雜。且HPLC的靈敏度還有待提高。的靈敏度還有待提高。方法分類高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。1液固色譜法液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個(gè)吸附解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度510m。適用于分離分子2001000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型

10、化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。方法分類2液液色譜法液液色譜法使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個(gè)分配平衡過程。涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用。現(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NP

11、C)和反相色譜法(RPC)。方法分類3離子交換色譜法離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)

12、度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。方法分類4離子對色譜法離子對色譜法它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對。分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入310mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。

13、被測組分保時(shí)間與離子對性質(zhì)、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。方法分類 5排排阻色譜法阻色譜法固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。應(yīng)用范圍 色譜法適用于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定易分解的、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物、生物活性物質(zhì)和多種天然產(chǎn)物、合成的天然高分子化合物等，也適用于一些化藥。他們涉及石油化工產(chǎn)品、食品、合成藥物、生物化工產(chǎn)品及環(huán)境污

14、染物等，約占全部有機(jī)化合物的80%。其余20%的有機(jī)化合物，包括氣體，易揮發(fā)低沸點(diǎn)及中等分子量的化合物，只能用氣象色譜分析法進(jìn)行分析。建立方法不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問題，也是分離的首要條件。其次，當(dāng)不同組分在色譜柱中運(yùn)動(dòng)時(shí)，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。一種HPLC分析方法的建立，除了了解樣品性質(zhì)，對液相色譜分離理論的理解，對前人從事過分相近工作的借鑒以及分析工作者自身的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，都對分析方法分建立起著重要的影響。在建立一種新的分析方法時(shí)，必須解決以下問題：1、根據(jù)被分析樣品的特性選擇一種是英語樣品分析的高效液相色譜方法。2、